Name: Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę fizycznej izolacji przetrwalników bakteryjnych z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pozyskanie przetrwalników do dalszych badań mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki za grant nr 31003A-132358/1, 31003A_152972 i nr 151948, oraz Fundacji Pierre Mercier pour la Science.

1. Przygotowanie chemikaliów i sprzętu 
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml 1% roztworu heksametafosforanu sodu (SHMP) (NaPO3)n i sterylizować w autoklawie.</li>
	<li>Sterylizuj filtry nitrocelulozowe (NC) (wielkość porów 0,22 μm, średnica 47 mm) przez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.</li>
	<li>Sterylizuj filtry NC (wielkość porów 0,22 μm, średnica 25 mm) przez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.</li>
	<li>Zważyć i zanotować masę pustą sterylnych probówek o pojemności 50 ml (z założoną nakrętką) (jedna probówka na próbkę).</li>
	<li>Przygotować bufor Tris-EDTA (bufor TE) 1x: przygotować roztwór 10 mM Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan) i 1 mM buforu EDTA. Dostosuj pH do 8 i sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Przygotować roztwór lizozymu (20 mg/ml), rozpuszczając 0,02 g lizozymu w 1 ml buforu TE. Idealnie, za każdym razem rób świeże. Przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 tydzień.</li>
	<li>Przygotować roztwór fizjologiczny, rozpuszczając 8 g/l chlorku sodu (NaCl) w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie.</li>
</ol>
2. Oddzielanie biomasy od osadu
<ol>
	<li>Dodać 3 g próbki osadu do wstępnie zważonych sterylnych probówek o pojemności 50 ml za pomocą metalowych czerpaków płomieniowanych etanolem. Zrób to w czystej, sterylizowanej promieniami UV komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Dodać 15 ml 1% sterylnego (autoklawowanego) roztworu SHMP do próbki za pomocą sterylnej biurety z podziałką. Roztwór SHMP można również filtrować, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Homogenizować osad i roztwór SHMP za pomocą płynnego dyspergatora/homogenizatora (np. homogenizatora Ultra-Turrax). 70% etanolu - sterylizuj lub autoklawuj rotor dyspersyjny przed użyciem. Uruchomić homogenizację na 1 minutę przy 17 500 obr./min. Pozostawić próbkę na 2 minuty i powtórzyć homogenizację przez 1 minutę przy tej samej prędkości wirnika.</li>
	<li>Odstawić próbkę na 10 minut. Na tym etapie najcięższe cząstki (minerały) osiądą. Komórki i wszelkie organiczne składniki próbki pozostaną jednak w roztworze. Następnie przenieść roztwór supernatantu (zawierający biomasę komórkową) do czystej probówki o pojemności 50 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Do osadu dodać ponownie 15 ml 1% sterylnego (autoklawowanego) roztworu SHMP za pomocą sterylnej biurety z podziałką. Następnie powtórz kroki 2.3 i 2.4. To powtórzenie zapewnia oddzielenie maksymalnej ilości komórek i cząstek organicznych od składnika mineralnego osadu. Supernatant tego drugiego rozdziału może być połączony z supernatantem z pierwszego rozdziału. 
	Uwaga: Poniższe kroki są wykonywane na supernatancie (zawierającym biomasę komórkową). Składnik mineralny (osad) można wyrzucić.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 20 g przez 1 minutę. Ten krok zwiększa siłę g na tyle, aby osadzić małe cząstki mineralne, podczas gdy biologiczny materiał komórkowy nadal pozostaje w roztworze. Po odwirowaniu przenieść roztwór sklarowanego osadu (zawierający biomasę komórkową) do czystej probówki o pojemności 50 ml. Wyrzuć granulat mineralny.</li>
	<li>Oznaczyć końcową objętość roztworu zawierającego biomasę przez zważenie próbki. Oznaczanie masy pozwala uniknąć konieczności przenoszenia próbki do cylindra z podziałką i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia.</li>
</ol>
3. Zbieranie biomasy na membranie filtracyjnej
<ol>
	<li>Przygotuj jednostkę filtracyjną (do membran o średnicy 47 mm) i pompę próżniową. Wysterylizuj jednostkę filtracyjną albo przez autoklawowanie, albo (w przypadku szkła Pyrex) przez spryskanie jej 70% etanolem i spalenie palnikiem Bunsena. Poczekaj, aż ostygnie, zanim przejdziesz do protokołu.</li>
	<li>Dodaj sterylną membranę NC do jednostki filtracyjnej za pomocą sterylizowanych kleszczy płomieniowanych etanolem.</li>
	<li>Dodać połowę próbki sklarowanej nad osadem (z kroku 2.6) do urządzenia do filtracji membranowej i zebrać komórki na membranie za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie zdejmij membranę za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem etanolu. Umieść membranę na sterylnej szalce Petriego.
	<ol>
		<li>Przetnij membranę na pół za pomocą wysterylizowanych nożyczek płomieniowanych etanolem. Dodać każdą połówkę błony do oddzielnej probówki o pojemności 2 ml. Jedna połowa błony zostanie wykorzystana do ekstrakcji DNA i analizy całej społeczności bakteryjnej. Druga połowa filtra będzie przechowywana w temperaturze -80 °C i służy jako kopia zapasowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić nową membranę NC na jednostce filtrującej i zebrać biomasę z drugiej połowy objętości próbki (z kroku 2.6) za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie zdejmij membranę za pomocą sterylizowanych kleszczyków płomieniowanych etanolem. Umieść całą membranę w osobnej probówce o pojemności 2 ml. Próbka ta zostanie wykorzystana do leczenia w celu oddzielenia endospor od komórek wegetatywnych. Próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Liza komórek wegetatywnych
<ol>
	<li>Przeprowadzić zabieg w celu oddzielenia przetrwalników od komórek wegetatywnych na biomasie uprzednio zebranej na membranie NC (krok 3.6).
	<ol>
		<li>Jeśli membrana została zamrożona, pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 10 minut do rozmrożenia. Następnie umieść membranę na sterylnej szalce Petriego i pokrój ją (około 4 razy) na mniejsze kawałki za pomocą sterylizowanych nożyczek płomieniowanych etanolem. Następnie umieść wszystkie kawałki filtra membranowego w sterylnej probówce o pojemności 2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 900 μl 1x buforu TE (Tris-EDTA) (patrz 1.5) do probówki zawierającej membranę próbki i dokładnie wymieszać za pomocą wiru. Na tym etapie biomasa jest usuwana z membrany do roztworu buforowego TE.</li>
	<li>Umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 65 °C na 10 minut i 80 obr./min. Następnie wyjmij probówkę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl świeżo przygotowanego lizozymu (patrz 1.5) do uzyskania końcowego stężenia 2 mg/ml. Nie dodawać lizozymu, zanim próbka nie ostygnie do 37 °C, ponieważ może to spowodować degradację enzymu.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 60 minut i 80 obr./min, w optymalnych warunkach dla lizozymu do lizy komórek wegetatywnych.</li>
	<li>Po zakończeniu lizy dodać do próbki 250 μl 3 N wodorotlenku sodu (NaOH) i 250 μl 6% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS). Po dodaniu tego objętość próbki osiąga 1,5 ml i uzyskuje się końcowe stężenie 0,5 N NaOH i końcowe stężenie 1% SDS.</li>
	<li>Inkubować tę mieszankę w temperaturze pokojowej przez 60 minut i 80 obr./min. Dodanie bazy i detergentów pomoże w końcowej lizie komórek. Stężenie tych detergentów zostało zoptymalizowane tak, aby nie szkodzić przetrwalnikom podczas lizy komórek wegetatywnych.</li>
	<li>Przygotuj sterylną jednostkę filtracyjną, która utrzymuje membrany o średnicy 25 mm przez autoklawowanie lub (w przypadku szkła Pyrex) spryskanie jej 70% etanolem i spalenie palnikiem Bunsena. Niech ostygnie.</li>
	<li>Umieść membranę NC 0,2 μm (średnica 25 mm) na jednostce filtracyjnej za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem etanolu.</li>
	<li>Dodać próbkę z kroku 4.7 na membranę i przefiltrować ciecz za pomocą pompy próżniowej. Gdy płyn przepłynie, wyłącz pompę próżniową. Na tym etapie lizowany wegetatywny materiał komórkowy jest usuwany, ponieważ nie jest zatrzymywany na błonie. Na błonie pozostaną tylko przetrwalniki.</li>
	<li>Dodać 2 ml sterylnego roztworu fizjologicznego, aby zmyć resztki detergentów i przefiltrować płyn za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Gdy ciecz zostanie całkowicie przefiltrowana, wyłącz pompę próżniową. Pozostaw membranę na jednostce filtrującej.</li>
</ol>
5. Leczenie DNazy
Uwaga: Zabieg DNazy należy przeprowadzić bezpośrednio na membranie filtracyjnej. Ważne jest, aby jednostka filtrująca nie przeciekała, a pompa próżniowa była wyłączona.
<ol>
	<li>Dodać 450 μl sterylnej wody, 50 μl buforu reakcyjnego DNazy (1x) i 0,5 μl enzymu DNazy bezpośrednio na membranę filtracyjną i odstawić na 15 minut. Jeśli to możliwe, przeprowadź trawienie w pomieszczeniu, które jest nieco cieplejsze niż przeciętne RT, ponieważ enzym działa lepiej w temperaturach 25 °C i wyższych. 
	Uwaga: Odłożenie palnika Bunsena na bok jednostki filtrującej również zwiększa temperaturę i ma dodatkową zaletę w postaci utrzymania sterylności otoczenia, a tym samym zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia próbek.</li>
	<li>Po zakończeniu mineralizacji DNazy włącz pompę próżniową, aby usunąć enzym z próbki.</li>
	<li>Zmyć resztki enzymu, dodając i filtrując 1 ml roztworu fizjologicznego.</li>
	<li>Jeśli ciecz całkowicie przeszła, wyłącz pompę próżniową i usuń membranę filtracyjną zawierającą przetrwalniki za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść ją na sterylnej szalce Petriego. 
	Uwaga: Próbka oddzielonych endospor jest teraz gotowa do dalszej analizy. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli jest używany do ekstrakcji DNA lub alternatywnie w temperaturze 4°C, jeśli jest używany do kiełkowania i hodowli.</li>
</ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Odporność endospor na zewnętrzne agresywne czynniki fizykochemiczne (np. temperaturę czy detergenty) wykorzystano do opracowania metody oddzielania endospor bakteryjnych od komórek wegetatywnych w próbkach środowiskowych. Jest to pierwsza kompleksowa metoda izolowania endospor z próbek środowiskowych w sposób nieniszczący. Poprzednie metody ilościowego określania, wykrywania lub analizowania endospor w próbkach opierały się na pomiarze określonych wskaźników zastępczych dla endospor, takich jak kwas dipikolinowy...

Celem tej pracy jest dostarczenie protokołu do oddzielania endospor bakteryjnych od wegetatywnych komórek bakteryjnych w próbkach środowiskowych. Tworzenie się endospor bakteryjnych jest strategią przetrwania, zwykle wywoływaną przez głód, występującą w wielu grupach bakterii należących do gromady Firmicutes1. Bakterie tworzące endospory są dobrze zbadane, głównie dlatego, że wiele szczepów jest patogenami, a zatem ma znaczenie medyczne (np. Bacillus anthracis lub Clostridium difficile). Środowiskowe szczepy bakterii tworzących przetrwalniki zostały wyizolowane z praktycznie każdego środowiska (gleby, wody, osadów, powietrza, lodu, jelit ludzkich, jelit zwierząt i innych)1-3. Dlatego Firmicutes są drugą najliczniejszą gromadą w kolekcjach kultur4.
Ze względu na ich wytrzymałą zewnętrzną korę i ochronne białka rdzenia, przetrwalniki mogą przetrwać ekstremalne warunki środowiskowe, począwszy od wysuszenia, a skończywszy na wysokim promieniowaniu, ekstremalnych temperaturach i szkodliwych chemikaliach5. Ta niezwykła odporność sprawia, że ekstrakcja DNA z przetrwalników6-8 jest wyzwaniem. To prawdopodobnie wyjaśnia, dlaczego zostały one pominięte w badaniach sekwencjonowania środowiskowego9,10. Inne metody, takie jak celowanie w przetrwalniki w próbkach środowiskowych za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych11, oznaczanie ilościowe kwasu dipikolinowego (DPA) w glebie12 i osadzie13, cytometria przepływowa14 lub pasteryzacja, a następnie hodowla15,16 zostały wykorzystane do uzyskania lub ilościowego określenia endospor w próbkach środowiskowych. W ostatnich latach opracowano zoptymalizowane metody ekstrakcji DNA, a także specyficzne startery molekularne do celowania w sekwencje genów specyficzne dla endospor10,17-20. Przyczyniło się to do ujawnienia większej różnorodności biologicznej wśród tej grupy bakterii21, a także doprowadziło do zastosowań w przemyśle i medycynie do wykrywania endospor, na przykład w mleku w proszku19.
Przedstawiony tutaj protokół opiera się na różnicy w odporności na szkodliwe warunki fizykochemiczne (takie jak ciepło i detergenty) przetrwalników bakteryjnych w stosunku do komórek wegetatywnych. Aby zniszczyć komórki wegetatywne w próbce, stosujemy kolejno ciepło, lizozym i niskie stężenia detergentów. Czas i siła tych zabiegów zostały zoptymalizowane tak, aby nie niszczyć zarodników, ale lizować wszystkie komórki wegetatywne. Niektóre komórki w środowiskowej puli komórkowej są bardziej odporne niż inne, dlatego aby zwiększyć prawdopodobieństwo zniszczenia wszystkich komórek wegetatywnych, stosujemy trzy różne zabiegi. Zaletą i nowością tej metody jest to, że przetrwalniki po zabiegu są nadal nienaruszone i mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Obejmują one ekstrakcję DNA, ilościowy PCR (qPCR) oraz sekwencjonowanie amplikonowe lub metagenomiczne (ukierunkowane konkretnie na grupę endospor, a tym samym zmniejszające różnorodność, przy jednoczesnym zwiększeniu zasięgu). Przetrwalniki mogą być również wykorzystywane do dalszej hodowli lub kwantyfikacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub wykrywania DPA. Ważną cechą tej metody jest to, że porównując próbkę niepoddaną działaniu substancji z próbką poddaną działaniu środka, można wywnioskować ilość i różnorodność przetrwalników w próbce środowiskowej oprócz składnika odpowiadającego komórkom wegetatywnym.

<table><tbody><tr><td>Filtry membranowe nitrocelulozowe Whatman, 0,2 &#956; m wielkość porów, średnica 47 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>w proszku, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Homogenizator Ultra-Turrax T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Szklane uchwyty filtrów do 47&nbsp; mm membrany, szkło Pyrex</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa do pracy chemicznej</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Filtracja do pobierania próbek w kolektorze dla 25&nbsp; mm membrany</td><td>Millipore</td><td>1225 Kolektor do pobierania próbek</td><td>polipropylen</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Bez Rnazy</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>Dodecylosulfan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe nitrocelulozowe Whatman, 0,2 &#956; m wielkość porów, średnica 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Tworzenie endospor to strategia przetrwania znaleziona wśród niektórych bakterii z typu Firmicutes. Podczas tworzenia przetrwalników bakterie te wchodzą w morfofizjologiczny stan spoczynku, który zwiększa przeżywalność w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Mimo że tworzące endospory Firmicutes są jedną z najczęściej wzbogacanych i izolowanych grup bakteryjnych w badaniach hodowlanych, często są one nieobecne w badaniach różnorodności opartych na metodach molekularnych. Odporność rdzenia zarodnika jest uważana za jeden z czynników ograniczających odzyskiwanie DNA z endospor. Opracowaliśmy metodę, która wykorzystuje wyższą odporność endospor do oddzielenia ich od innych komórek w złożonej społeczności mikrobiologicznej przy użyciu metod lizy fizycznej, enzymatycznej i chemicznej. Uzyskany w ten sposób preparat zawierający wyłącznie przetrwalniki może być wykorzystany do ponownej hodowli lub do przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak dostosowana ekstrakcja DNA zoptymalizowana pod kątem przetrwalników i późniejsze sekwencjonowanie DNA. Metoda ta, zastosowana do próbek osadów, pozwoliła na wzbogacenie endospor i po sekwencjonowaniu ujawniła dużą różnorodność substancji tworzących przetrwalniki w osadach jezior słodkowodnych. Spodziewamy się, że zastosowanie tej metody do innych próbek przyniesie podobny wynik.

Przedstawione tutaj wyniki zostały opublikowane wcześniej10,21. Prosimy o zapoznanie się z tymi artykułami w celu uzyskania interpretacji środowiskowej oraz omówienia danych.
Cała procedura została podsumowana na Rysunku 1 i składa się z trzech głównych etapów: po pierwsze, oddzielenia biomasy od osadu lub jakiejkolwiek innej macierzy środowiskowej; po drugie, zniszczenia komórek wegetatywnych; i po trzecie, analizy końcowej wydzielonych endospor. Analiza końcowa mo...

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie bakteryjnych endospor z próbek złożonych społeczności drobnoustrojów, takich jak osady. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii dotyczące obecności i liczebności endospor w próbkach naturalnych. Opiera się ona na różnicy w odporności endospor i komórek wegetatywnych na działanie substancji chemicznych oraz ciepła. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda nie jest niszcząca dla endospor, dzięki czemu mogą one zostać wykorzystane w dalszych eksperymentach, takich jak hodowla, kwantyfikacja i testy metaboliczne.Choć metoda ta została opracowana z myślą o ekologii bakterii tworzących endospory, może ona również znaleźć zastosowanie w takich dziedzinach jak egzobiologia czy przemysł spożywczy, gdzie obecność spor może być korzystna lub szkodliwa. Po przygotowaniu roztworów i sprzętu zgodnie z protokołem tekstowym, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza z lampą UV, należy użyć wysterylizowanych nad palnikiem etanolowym metalowych łyżek, aby przenieść trzy gramy próbki osadu do wcześniej zważonych, sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Za pomocą sterylnej, skalibrowanej biurety należy dodać do próbki 15 ml sterylnego, przefiltrowanego 1% roztworu heksametafosforanu sodu (SHMP).Używając dyspergera cieczy lub homogenizatora z jałowym rotorem dyspergującym, homogenizuj próbkę przy 17 500 RPM przez jedną minutę. Pozostaw próbkę na dwie minuty, a następnie powtórz homogenizację. Pozostaw próbkę na 10 minut, aby najcięższe cząstki mogły opaść.Przenieś supernatant zawierający biomasę komórkową do czystej probówki o pojemności 50 mililitrów, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj kolejną porcję 15 mililitrów SHMP do osadzonego pelletu i powtórz homogenizację przed zebraniem supernatantu i połączeniem go z pierwszą porcją. Odwiruj próbkę przy 20 ×g przez jedną minutę i przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie usuń pellet.Po przygotowaniu zestawu do filtracji i pompy próżniowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy wysterylizować pęsetę w płomieniu etanolu, aby umieścić sterylną membranę nitrocelulozową w jednostce filtrującej. Należy nanieść połowę przygotowanego wcześniej supernatantu na jednostkę filtrującą i użyć pompy próżniowej w celu osadzenia komórek na membranie. Po całkowitym przepływie cieczy przez filtr należy wyłączyć pompę próżniową.Używając wysterylizowanej pęsety, ostrożnie wyjmij membranę i umieść ją w sterylnym naczyniu Petriego. Powtórz proces filtracji z pozostałą połową roztworu, używając nowego kawałka sterylnej membrany. Aby oddzielić endospory od komórek wegetatywnych w pobranej biomasie, rozmroź membranę, jeśli była zamrożona, i za pomocą nożyczek wysterylizowanych w płomieniu etanolu potnij ją na mniejsze kawałki.Przenieś fragmenty błony do sterylnej probówki o pojemności 2 ml i dodaj 900 µL buforu 1X TE. Wymieszaj dokładnie za pomocą wibratora w celu uwolnienia biomasy z błony. Inkubuj probówkę w temperaturze 65 °C przy 80 RPM przez 10 minut.Następnie wyjmij probówkę z inkubatora i pozostaw ją do ochłonięcia na 15 minut. Dodaj 100 µL świeżo przygotowanej lizozymy do końcowego stężenia 2 mg/mL i inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przy 80 RPM przez 60 minut w celu lizy komórek wegetatywnych. Po zakończeniu lizy dodaj do próbki 250 µL 3 N wodorotlenku sodu oraz 250 µL 6% roztworu SDS.Inkubować w temperaturze pokojowej przy 80 RPM przez 60 minut. Następnie, poprzez autoklawowanie, przygotować sterylną jednostkę filtracyjną przeznaczoną dla membran o średnicy 25 milimetrów. Po ostygnięciu jednostki filtracyjnej umieścić w niej membranę nitrocelulozową o średnicy 25 milimetrów i wielkości porów 0,2 mikrometra.Nanieś próbkę na membranę i użyj pompy próżniowej do przefiltrowania cieczy, aby zatrzymać endospory na membranie, podczas gdy materiał z komórek wegetatywnych przejdzie przez filtr. Aby wypłukać pozostałości detergentów, dodaj dwa mililitry sterylnego roztworu fizjologicznego do membrany i uruchom pompę próżniową. Gdy ciecz zostanie całkowicie przefiltrowana, wyłącz pompę i pozostaw membranę w jednostce filtracyjnej.Aby przeprowadzić trawienie DNazą bezpośrednio na membranie, należy nanieść na nią 450 µL sterylnej wody, 50 µL buforu reakcyjnego 1X DNase oraz 0,5 µL enzymu DNazy i pozostawić w temperaturze około 25 °C na 15 minut. Pozwolenie na enzymatyczne trawienie zewnątrzkomórkowego DNA, wcześniej uwolnionego z lizowanych komórek, a następnie jego wypłukanie, zapewnia, że końcowy preparat endospor jest wolny od zewnętrznego DNA, co jest kluczowe dla dalszych etapów, takich jak analiza molekularna.Należy pamiętać o tym, aby aparat filtracyjny nie przeciekał, a próbka nie wysychała. Po inkubacji należy dodać jeden mililitr roztworu fizjologicznego i włączyć pompę, aby wypłukać pozostałości enzymu z próbki. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść membranę zawierającą endospory do sterylnej szalki Petriego.Próbkę należy analizować zgodnie z protokołem tekstowym. Przedstawiony w tym filmie protokół ukierunkowanej lizy komórek wegetatywnych pozwala na uzyskanie oczyszczonej próbki endospor oraz znaczący wzrost frakcji firmicutes tworzących endospory. W sekwencjonowaniu amplikonów genu 16S rRNA firmicutes w próbkach niepoddanych obróbce stanowią jedynie od 8% do 19% sekwencji.Z kolei po zastosowaniu preparatu bakterie z grupy firmicutes stanowiły 90,6% oraz 83,9% próbki bogatej w endospory. Dwa główne rzędy endosporotwórczych firmicutes, bacillales i clostridiales, uległy wzbogaceniu, podczas gdy nieendosporotwórcze firmicutes, takie jak lactobacillales, były nieobecne. Efektywność zabiegu wykazano również z wykorzystaniem kultur czystych.Przygotowano preparat endospor oraz hodowlę komórek wegetatywnych, następnie wszystkie komórki inkubowano, a wzrost mierzono za pomocą gęstości optycznej przy 600 nanometrach. Jak pokazano tutaj, w hodowlach endospor zaobserwowano wzrost, natomiast w potraktowanej hodowli E.Coli nie odnotowano żadnego wzrostu, co wskazuje na nieodwracalne uszkodzenie komórek wegetatywnych. Po opanowaniu techniki oraz przy założeniu, że roztwory i sprzęt zostały przygotowane wcześniej, procedura ta powinna zająć około pięciu godzin.Ważne jest, aby unikać wszelkich zanieczyszczeń, pracując w warunkach sterylnych i zapewniając sterylność roztworów oraz całego sprzętu. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hodowla, izolacja i testy metaboliczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące identyfikacji szczepów i potencjału metabolicznego endospor. Można również przeprowadzić późniejszą ekstrakcję DNA i sekwencjonowanie metagenomiczne w celu analizy różnorodności gatunkowej oraz obecności genów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielać endospory z próbek środowiskowych. Pamiętaj, że praca z detergentami, takimi jak SDS, może być niezwykle niebezpieczna. Pamiętaj o stosowaniu środków ochrony osobistej.

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Schlimpert, S., et al. Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje uprawę i izolację zarodników Streptomyces venezuelae. Zarodniki, uśpione komórki, które pomagają bakteriom przetrwać stres, są wytwarzane podczas ograniczania składników odżywczych i zbierane przez wirowanie. Metoda ta zapewnia czystą, przechowywaną w niskiej temperaturze zawiesinę zarodników do dalszych...

 Przygotowanie i izolacja zarodników Streptomyces venezuelae z płynnej kultury 

Źródło: Wunderlin, T. i inni. Fizyczna izolacja endospor od próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje metodę izolowania endospor z próbki środowiskowej zawierającej zarówno komórki wegetatywne, jak i różne bakterie. Procedura obejmuje filtrację, mechaniczne zakłócenia oraz selektywne zabiegi chemiczne w celu osłabienia i rozbicia komórek wegetatywnych, jednocześnie zachowując endospory. Ostatni etap izoluje odporne endospory poprzez...

Izolacja endospor z próbki środowiskowej poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych 

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Grzyby smutku powodują wiele niszczycielskich chorób rolniczych. Są rozproszone jako uśpione teliospory, które kiełkują w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Przedstawiamy dwie metody badania zmian molekularnych podczas kiełkowania: pomiar wzrostu oddychania w celu wykrycia aktywacji metabolicznej i ocenę zmieniających się zdarzeń molekularnych poprzez izolację teliospory na różnych etapach morfologicznych.

Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Poznaj metodę fizycznej izolacji przetrwalników bakteryjnych z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pozyskanie przetrwalników do dalszych badań mikrobiologicznych.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Przeglądaj więcej filmów