Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie endospor bakteryjnych od złożonych próbek zbiorowisk drobnoustrojów, takich jak osad Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii dotyczące obecności i liczebności endospor w próbkach naturalnych. Opiera się na różnicy w odporności między przetrwalnikami a komórkami wegetatywnymi na chemikalia i ciepło. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda jest nieniszcząca dla endospor, dzięki czemu można je wykorzystać do dalszych eksperymentów, takich jak uprawa, kwantyfikacja i testy metaboliczne.

Chociaż zaprojektowaliśmy tę metodę do pracy z ekologią bakterii tworzących przetrwalniki, może być również stosowana w dziedzinach takich jak egzobiologia lub przemysł spożywczy, w których zarodniki mogą być korzystne lub szkodliwe. Po przygotowaniu roztworów i sprzętu zgodnie z protokołem tekstowym, pod sterylizowaną promieniami UV szafką bezpieczeństwa biologicznego, użyj metalowych miarek płomieniowanych etanolem, aby dodać trzy gramy próbki osadu do wstępnie zważonych, sterylnych probówek o pojemności 50 mililitrów. Za pomocą sterylnej, wyskalowanej biurety dodać do próbki 15 mililitrów sterylnego, przefiltrowanego 1% roztworu heksametafosforanu sodu lub SHMP.

Za pomocą dyspergatora lub homogenizatora cieczy i sterylnego wirnika dyspersyjnego homogenizować próbkę z prędkością 17 500 obr./min przez jedną minutę. Pozostawić próbkę na dwie minuty i powtórzyć homogenizację. Pozostawić próbkę na 10 minut do spoczynku, aby najcięższe cząstki mogły się uspokoić.

Przenieść supernatent zawierający biomasę komórkową do czystej probówki o pojemności 50 mililitrów, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodać kolejną 15 mililitrową porcję SHMP do osadzonego osadu i powtórzyć homogenizację przed zebraniem supernatantu i połączeniem go z pierwszą podwielokrotnością. Odwirować próbkę przy 20 razy G przez jedną minutę i przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów przed wyrzuceniem osadu.

Po przygotowaniu jednostki filtracyjnej i pompy próżniowej zgodnie z protokołem tekstowym, użyj płomienia etanolu do sterylizacji kleszczy, aby dodać sterylną membranę nitrocelulozową do jednostki filtracyjnej. Dodać połowę przygotowanej próbki supernatantu do jednostki filtracji membranowej i użyć pompy próżniowej do zebrania komórek na membranie. Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową.

Użyj wysterylizowanych kleszczy, aby ostrożnie usunąć membranę i umieścić ją na sterylnej szalce Petriego. Ze świeżym kawałkiem sterylnej membrany powtórz filtrację z pozostałą połową roztworu. Aby oddzielić przetrwalniki od komórek wegetatywnych w właśnie zebranej biomasie, rozmrozić membranę, jeśli była zamrożona, i użyć wysterylizowanych nożyczek z etanolem, aby pociąć ją na mniejsze kawałki.

Przenieś kawałki membrany do sterylnej dwumililitrowej probówki i dodaj 900 mikrolitrów buforu 1X TE. Dokładnie wymieszaj przez wirowanie, aby uwolnić biomasę z membrany. Inkubować probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza i 80 obr./min przez 10 minut.

Następnie wyjmij probówkę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut. Dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego lizozymu do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 80 obr./min przez 60 minut w celu lizy komórek wegetatywnych. Po zakończeniu lizy dodać do próbki 250 mikrolitrów 3 normalnych wodorotlenków sodu i 250 mikrolitrów 6% roztworu SDS.

Inkubować w temperaturze pokojowej i 80 obr./min przez 60 minut. Następnie przygotuj sterylną jednostkę filtracyjną, która utrzymuje membrany o średnicy 25 milimetrów w autoklawie. Po ostygnięciu jednostki filtrującej umieść na niej membranę nitrocelulozową o średnicy 25 milimetrów i grubości 0,2 mikrometra.

Dodaj próbkę do membrany i użyj pompy próżniowej do przefiltrowania cieczy, wychwytując przetrwalniki na membranie, podczas gdy wegetatywny materiał komórkowy przechodzi przez nią. Aby zmyć resztki detergentów, dodaj dwa mililitry sterylnego roztworu fizjologicznego do membrany i zastosuj pompę próżniową. Gdy ciecz jest całkowicie przefiltrowana, wyłącz pompę i pozostaw membranę na jednostce filtrującej.

Aby przeprowadzić obróbkę DNazy bezpośrednio na membranie, dodaj 450 mikrolitrów sterylnej wody, 50 mikrolitrów buforu reakcyjnego 1X DNazy i 0,5 mikrolitra enzymu DNazy na membranę i pozostaw w temperaturze około 25 stopni Celsjusza na 15 minut. Zewnątrzkomórkowe DNA uwolnione wcześniej z komórek poddanych lizie jest trawione enzymatycznie, a następnie wypłukiwane. Gwarantuje to, że końcowe przygotowanie przetrwalników jest wolne od zewnętrznego DNA, które ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy, takiej jak analiza molekularna.

Należy pamiętać, że na aparacie filtrującym nie powinno być żadnych wycieków, a próbka nie wysycha. Po inkubacji dodać jeden mililitr roztworu fizjologicznego i włączyć pompę, aby zmyć pozostałości enzymu z próbki. Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść błonę zawierającą przetrwalniki na sterylną szalkę Petriego.

Przeanalizuj próbkę zgodnie z protokołem tekstowym. Protokół pokazany na tym filmie ukierunkowanej lizy komórek wegetatywnych skutkuje oczyszczoną próbką endospor i znacznym wzrostem frakcji endospor tworzących firmicutes. W sekwencjonowaniu amplikonowym genu rybosomalnego RNA 16S firmicutes w próbkach niepoddanych działaniu substancji odpowiadają tylko 8% do 19% sekwencji.

Natomiast po leczeniu firmicutes stanowiły 90,6% i 83,9% próbki bogatej w endosporynę. Dwa główne rzędy firmicutes tworzących endospory, bacillales i clostridiales zostały wzbogacone, podczas gdy nie-tworzące endospory, takie jak lactobacillales, były nieobecne. Skuteczność leczenia wykazano również przy użyciu czystych kultur bakterii.

Preparat endospor i wegetatywną hodowlę komórkową poddano działaniu środka, wszystkie komórki inkubowano i mierzono wzrost przy gęstości optycznej 600 nanometrów. Jak pokazano tutaj, wzrost zaobserwowano w kulturach endospor, podczas gdy nie zaobserwowano wzrostu w hodowli E.Coli poddanej działaniu substancji, co wskazuje, że komórki wegetatywne są nieodwracalnie uszkodzone. Po opanowaniu, jeśli roztwory i sprzęt zostały przygotowane wcześniej, technikę tę należy wykonać w ciągu około pięciu godzin.

Należy pamiętać o unikaniu wszelkich zanieczyszczeń poprzez pracę w sterylnych warunkach i zapewnienie sterylności roztworów i całego sprzętu. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak hodowla, izolacja i testy metaboliczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące identyfikacji szczepu i potencjału metabolicznego przetrwalników. Można również przeprowadzić ekstrakcję DNA i sekwencjonowanie metagenomiczne w celu analizy różnorodności gatunków i obecności genów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić przetrwalniki od próbek środowiskowych. Nie zapominaj, że praca z detergentami, takimi jak SDS, może być bardzo niebezpieczna. Nie zapomnij o noszeniu środków ochrony osobistej.