Name: System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj system indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis thaliana i kukurydzy. Ta metoda in vitro umożliwia synchroniczną indukcję i badanie rozwoju korzeni na poziomie cytologicznym oraz molekularnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Davy'emu Opdenackerowi za pomoc techniczną i fotografię. Bardzo dziękujemy dr Annick Bleys za pomocne sugestie dotyczące ulepszenia manuskryptu. Prace te zostały sfinansowane przez Międzyuczelniany Program Przyciągania Słupów IUAP P7/29 "MARS" z belgijskiego Federalnego Biura Polityki Naukowej, przez G027313N grantowy FWO oraz przez Agencję ds. Innowacji w Nauce i Technologii (IWT).

1. Protokół LRIS Arabidopsis
Uwaga: Tekst odnosi się do "małych" lub "dużych" eksperymentów na dużą skalę. Eksperymenty na małą skalę, takie jak analiza linii markerów i barwienie histologiczne6, 14, wymagają tylko kilku próbek. Eksperymenty na dużą skalę, takie jak ilościowe qRT-PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze9-11 lub sekwencjonowanie RNA, wymagają większej ilości próbek. W związku z tym ilość ~1000 sadzonek na próbkę została użyta przez Vanneste i wsp. 11 do przeprowadzenia eksperymentu z mikromacierzą po rozbiorze segmentu korzeniowego.
DZIEŃ 1
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion rzodkiewnika 
	Uwaga: Wybierz jedną z następujących procedur sterylizacji nasion. Każdy z nich nadaje się do kolejnych kroków protokołu. Sterylizacja gazowa (ppkt 1.1.2) ma dwie zasadnicze zalety w porównaniu ze sterylizacją płynną (ppkt 1.1.1): zajmuje mniej czasu w przypadku pracy z dużą liczbą nasion, ponieważ nie ma potrzeby pipetowania poszczególnych próbek; A wysterylizowane nasiona można przechowywać przez dłuższy czas. Wymaga jednak eksykatora i ostrożnego obchodzenia się z nim.
	<ol>
		<li>Sterylizacja płynem
		<ol>
			<li>Wlej żądaną liczbę nasion do probówek mikrowirówek. Użyj do 20 mg (~800 nasion) w probówce o pojemności 1,5 ml lub 40 mg (~1600 nasion) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
			<li>Dodaj 1 ml 70% etanolu. Odwróć lub delikatnie potrząśnij przez 2 minuty.</li>
			<li>Zastąp 70% etanol 1 ml roztworu do sterylizacji na 15 minut (Przygotuj świeży roztwór sterylizacyjny: 3,85 ml bulionu podchlorynu sodu (NaOCl) (12%) (UWAGA: Użyj dygestoria), 5 μl Tween 20, do 10 ml z wodą. Odwróć probówki kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie nasiona mają kontakt z roztworem.</li>
			<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza zastąp roztwór sterylizacyjny 1 ml sterylnej wody destylowanej i płucz nasiona 5 razy przez 5 minut, wielokrotnie zastępując je 1 ml świeżej sterylnej wody destylowanej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sterylizacja gazowa
		<ol>
			<li>Wlej żądaną liczbę nasion do probówki z mikrowirówką o pojemności 2 ml. Podczas pracy z kilkoma niezależnymi liniami używaj pojedynczych probówek i ułóż je otwarte w plastikowym pudełku lub uchwycie na probówki do mikrowirówek. Jeśli liczba nasion w jednej probówce przekracza 500 (12,5 mg), podziel nasiona na odpowiednią liczbę probówek, aby zapewnić pomyślną sterylizację. Upewnij się, że nakrętki sąsiednich probówek nie zakrywają się nawzajem. Dopasuj pokrywę pudełka na dole, ponieważ musi ona znajdować się również w eksykatorze do sterylizacji.</li>
			<li>Umieść pudełko w misce eksykatora wraz ze szklaną zlewką (UWAGA: Użyj dygestoria).</li>
			<li>Napełnić zlewkę 100 ml 12% NaOCl (UWAGA: Użyć dygestoria). Nałożyć pokrywkę na eksykatora, ale pozostawić mały otwór w miejscu, w którym umieszczona jest zlewka.</li>
			<li>Dodać 3 ml 37% kwasu solnego (dymiącego) (UWAGA: Używać dygestoriów) do zlewki przez mały otwór i szybko zamknąć eksykatora. Roztwór będzie bulgotał przez jakiś czas z powodu tworzenia się gazu Cl2. Pozostaw system zamknięty O/N (lub co najmniej 8 godzin).</li>
			<li>Zdjąć pokrywę eksykatora. Wyjmij pudełko i przykryj je pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas transportu.</li>
			<li>Umieść pudełko w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zdejmij pokrywę i pozostaw nasiona na około 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić uwolnienie gazu. 
			Uwaga: Nasiona można bezpiecznie przechowywać w stanie suchym w zamkniętych probówkach do mikrowirówek do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja korzeni bocznych u Arabidopsis
	<ol>
		<li>Hamowanie korzeni bocznych (leczenie NPA)
		<ol>
			<li>Przygotuj pożywkę do wzrostu in vitro. Pożywka zawiera mieszaninę soli Murashige i Skoog o połowie mocy15, 0,1 g/l mio-inozytolu, 10 g/l sacharozy i jest buforowana 0,5 g/l kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES).</li>
			<li>Dostosować pH do 5,7 za pomocą 1 M KOH. Dodać 8 g/l agaru z tkankami roślinnymi i sterylizować pożywkę w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.</li>
			<li>Przygotować 25 mM roztwór podstawowy NPA w dimetylosulfotlenku (DMSO) (UWAGA: Używać rękawiczek). W komorze z laminarnym przepływem powietrza schłodzić autoklawizowane medium do około 65 °C (jest to temperatura, w której butelka może być trzymana ręcznie) i dodać 25 mM roztworu podstawowego NPA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM NPA.</li>
			<li>Homogenizować po dodaniu, delikatnie potrząsając butelką przez 10 sekund. Wlać 50 ml pożywki na kwadratową szalkę Petriego (12 cm x 12 cm). 
			Uwaga: W przypadku eksperymentu na dużą skalę zastosuj nylonową siatkę (20 μm), aby zapewnić łatwy transfer. Przygotuj siatkę (9 cm x 9 cm) do autoklawowania (Rysunek 1A). Po sterylizacji w autoklawie nałóż siatkę na podłoże wzrostowe za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1B). Delikatnie dociśnij siatkę do podłoża wzrostowego za pomocą wysterylizowanego drigalsky'ego, aby upewnić się, że ma dobry kontakt z podłożem wzrostowym (Rysunek 1B) (UWAGA: Pracuj w sterylnych warunkach). </li>
			<li>Wysiewaj nasiona na płytkach NPA. 
			Uwaga: W przypadku gdy planowane jest doświadczenie na dużą skalę, należy wysiać 2 gęste i dobrze ustawione rzędy po 50 nasion, aby ułatwić pobieranie próbek (patrz 1.2.2.3).
			<ol>
				<li>W przypadku sterylizacji płynnej wysiewaj nasiona na płytkach NPA za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Odciąć 3 - 4 mm końcówki pipetujące w sterylnych warunkach (lub przed sterylizacją końcówek), aby móc pipetować nasiona. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby ponownie zawiesić nasiona, a następnie odpipeuj około 150 μl sterylnej wody z 10 - 20 nasionami i poczekaj, aż nasiona osiądą na dnie końcówki. (UWAGA: Praca w sterylnych warunkach) 
				Uwaga: Dotykając delikatnie końcówką agaru lub siatki, uwolni się z niej kropla wody z nasionem (Rysunek 1C).</li>
				<li>W przypadku sterylizacji gazowej wysiewaj nasiona za pomocą autoklawowanych wykałaczek. Ściśnij wykałaczkę w agarze przed pobraniem nasion, aby zapewnić lepką powierzchnię. Podnieś nasiona jeden po drugim za pomocą wykałaczki i rozprowadź nasiona na płytkach (Rysunek 1D). Alternatywnie, dodaj sterylną wodę do nasion i siej zgodnie z opisem w 1.2.1.5.1 (UWAGA: Pracuj w sterylnych warunkach).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Uszczelnij płytki oddychającą taśmą klejącą i przechowuj je w temperaturze 4 °C w ciemności przez co najmniej 2 dni, a maksymalnie tydzień. Jest to potrzebne do stratyfikacji i zapewnia zsynchronizowane i bardziej wydajne kiełkowanie. 
			Uwaga: Alternatywnie nasiona można rozwarstwić przed siewem, zanurzyć w wodzie destylowanej w probówkach do mikrowirówek, co wymaga mniej miejsca w lodówce. W takim przypadku probówki należy przechowywać przez co najmniej tydzień w temperaturze 4 °C i natychmiast po wysianiu przenieść płytki do komory wzrostowej (patrz ppkt 1.2.1.7). 
			DZIEŃ 3</li>
			<li>Przenieś płytki do komory wzrostowej (światło ciągłe (110 μE m-2 s-1), 21 °C) na 5 dni (2 dni kiełkowania i 3 dni wzrostu) w pozycji prawie pionowej (80 do 90 °), aby zapewnić wzrost korzeni na, a nie na podłożu. 
			DZIEŃ 8 </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Indukcja korzenia bocznego (leczenie NAA)
		<ol>
			<li>Przygotować taką samą pożywkę wzrostową, jak opisano w ppkt 1.2.1.1 i 1.2.1.2. Przygotować 50 mM roztwór podstawowy NAA w DMSO (UWAGA: Używać rękawiczek). Schłodzić autoklawizowaną pożywkę do temperatury 65 °C i dodać do niej roztwór NAA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM NAA (UWAGA: Pracować w sterylnych warunkach).
			<ol>
				<li>Homogenizować po dodaniu, delikatnie potrząsając butelką przez 10 sekund. Wlać 50 ml pożywki na kwadratową szalkę Petriego (12 cm x 12 cm).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przenieść siewki z płytek zawierających pożywkę wzrostową uzupełnioną 10 μM NPA do sadzonek uzupełnionych 10 μM NAA.
			<ol>
				<li>Zaczep ramiona zakrzywionej pęsety pod liścieniami sadzonki i delikatnie zdejmij ją z talerza. Przesadzaj tylko z siewkami, których korzenie wyrosły całkowicie w kontakcie z podłożem NPA, a najlepiej w dół.</li>
				<li>Przesuń korzeń po powierzchni podłoża zawierającego NAA na niewielką odległość. Upewnij się, że korzenie roślin mają dobry kontakt z podłożem wzrostowym. W razie potrzeby delikatnie dociśnij korzeń do powierzchni podłoża za pomocą pęsety. 
				Uwaga: W przypadku eksperymentu na dużą skalę usuń wszystkie sadzonki, które nie stykają się z siatką i przenieś, podnosząc siatkę w dwóch górnych rogach pęsetą. Upewnij się, że siatka ma dobry kontakt z podłożem zawierającym NAA, przesuwając siatkę po powierzchni agaru na niewielką odległość (Rysunek 1E). </li>
			</ol>
			</li>
			<li>Uszczelnić nowe płytki oddychającą taśmą i umieścić je w komorze wzrostowej (światło ciągłe (110 μE m-2 s-1), 21 °C) w pozycji pionowej na żądany czas po indukcji do pobrania próbek. 
			Uwaga: W przypadku eksperymentu na dużą skalę za pomocą skalpela należy przeciąć wszystkie segmenty korzeni naraz bezpośrednio na siatce i pobrać z nich próbki, delikatnie zeskrobując powierzchnię siatki. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół LRIS dotyczący kukurydzy
<ol>
	<li>Stratyfikacja ziaren kukurydzy
	<ol>
		<li>Ziarna kukurydzy inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez co najmniej 1 tydzień. 
		nuta: Protokół ten został opracowany przy użyciu linii wsobnej kukurydzy B73.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja ziaren kukurydzy 
	DZIEŃ 1 
	nuta: Chociaż sadzonki kukurydzy nie muszą być uprawiane w sterylnych warunkach, zaleca się sterylizację ziaren kukurydzy i pracę ze sterylnym materiałem, aby zapobiec rozwojowi grzybów w systemie rolek papieru.
	<ol>
		<li>Umieść niezbędną liczbę ziaren kukurydzy w wysterylizowanej szklanej zlewce.</li>
		<li>Dodać 100 ml roztworu sterylizacyjnego (6% NaOCl w wodzie) (UWAGA: Używać dygestoria).</li>
		<li>Dodać mieszadło magnetyczne i umieścić zlewkę na mieszadle magnetycznym przy niskiej prędkości mieszania (około 250 obr./min) przy temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
		<li>Płukać pięć razy przez 5 minut, zastępując roztwór 100 ml świeżej sterylnej wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Wysiew ziaren kukurydzy
	<ol>
		<li>Załóż rękawiczki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i weź rolkę ręczników papierowych.</li>
		<li>Oderwij dwa odcinki ręcznika do rąk o łącznej długości dwóch arkuszy (około 92 cm x 24 cm) i połóż je jeden na drugim na czystej powierzchni (Rysunek 2A).</li>
		<li>Złóż arkusze na pół na całej długości (około 92 cm x 12 cm) (Rysunek 2A).</li>
		<li>Użyj pęsety, aby rozprowadzić 10 ziaren w odległości około 2 cm od góry na całej długości papieru, zachowując odstęp 8 cm między każdym ziarnem i 8 cm wolnego na obu końcach (Rysunek 2B). Upewnij się, że korzonek jądra jest skierowany w dół i w stronę papieru (Rysunek 2B).</li>
		<li>Delikatnie zwiń papier na całej długości, utrzymując nasiona na miejscu (Rysunek 2B). Aby ułatwić zwijanie, opcjonalnie można najpierw spryskać papier sterylną wodą.</li>
		<li>Umieść rolki papieru w wysterylizowanych szklanych probówkach o średnicy około 6 cm i wysokości 14 cm (np. probówki wirówkowe o pojemności 250 ml) i umieść je w stojaku (Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja korzeni bocznych w kukurydzy
	<ol>
		<li>Przygotować 50 mM roztwór podstawowy NPA (rozpuszczony w DMSO) (UWAGA: Używać rękawiczek).</li>
		<li>Dla każdej probówki przygotować 50 μM roztwór NPA, dodając 125 μl z 50 mM roztworu podstawowego NPA do 125 ml sterylnej wody w wysterylizowanej szklanej zlewce.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i wlać 125 ml 50 μM roztworu NPA na rolkę papieru w probówce. Rolka papieru wchłonie roztwór i całkowicie nasiąknie. 
		nuta: W przypadku korzystania z rolek papieru i tub o innych wymiarach należy odpowiednio dostosować objętość. Płyn powinien sięgać do połowy rurki, aby zapewnić wystarczający pobór.</li>
		<li>Umieść system rolek papieru w komorze wzrostowej na trzy dni (27 °C, ciągłe światło, 70% wilgotności względnej). Upewnij się, że rolki papieru pozostają nasączone, dodając dodatkowe 50 μM roztworu NPA, ponieważ roztwór z czasem odparowuje (Rysunek 2D). 
		DZIEŃ 4</li>
		<li>Przygotować 50 mM roztwór podstawowy NAA (rozpuszczony w DMSO) (UWAGA: Używać rękawiczek).</li>
		<li>Dla każdej probówki przygotuj 50 μM roztwór NAA, dodając 125 μl z 50 mM NAA do 125 ml sterylnej wody w wysterylizowanej szklanej zlewce.</li>
		<li>Delikatnie wyciśnij większość pozostałego roztworu NPA z rolek papieru i umieść je w sterylnej wodzie na 5 minut, aby je zmyć (UWAGA: Używaj rękawiczek). Delikatnie wyciśnij większość wody z rolek papieru. Powtórz ten krok prania trzy razy.</li>
		<li>Dobrze wymieszaj i wlej 50 μM roztwór NAA na rolki papieru w probówkach. Upewnij się, że są całkowicie przemoczone.</li>
		<li>Umieść system rolek papieru w komorze wzrostowej (27 °C, światło ciągłe, 70% wilgotności względnej) na żądany czas po indukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja korzeni bocznych w przybyszowych korzeniach korony kukurydzy 
	Uwaga: LRIS, jak opisano powyżej, indukuje korzenie boczne w korzeniu pierwotnym. Jednak w przypadku kukurydzy i innych roślin jednoliściennych korzeń pierwotny i korzenie nasienne embrionalne, wraz z ich korzeniami bocznymi, są głównie ważne podczas rozwoju siewek. Na późniejszym etapie wzrostu roślin na łodydze pojawiają się postembrionalne korzenie przybyszowe, które również rozwijają korzenie boczne, tworząc nowy system korzeniowy16. LRIS może być również używany do indukowania korzeni bocznych na tych postembrionalnych korzeniach korony przybyszowej poprzez wykonanie pewnych drobnych korekt LRIS na zarodkowym korzeniu pierwotnym.
	<ol>
		<li>Aby zrobić rolki papieru, utwórz kanapkę z papierów z odpowiednio dwiema warstwami ręcznika do rąk po zewnętrznej stronie i dwiema warstwami papieru do kiełkowania w środku. Umieść wysterylizowane ziarna (patrz kroki 2.1 do 2.2) między dwoma arkuszami papieru do kiełkowania. Papier do kiełkowania, w porównaniu z papierem ręcznikowym, będzie mniej podatny na penetrację przez włośniki i korzenie boczne, co ułatwi późniejsze otwieranie rolek papieru. Z drugiej strony dwie zewnętrzne warstwy ręcznika do rąk ułatwią wchłanianie płynu.</li>
		<li>Włóż bułki do szklanych probówek o pojemności 700 ml i zalej je sterylną wodą bez NPA. Upewnij się, że są całkowicie przemoczone.</li>
		<li>Wysterylizowane ziarna należy wykiełkować w komorze wzrostowej (patrz krok 2.4.9).</li>
		<li>Sadzonki należy uprawiać tak długo, aż zaczną pojawiać się przybyszowe korzenie korony (6 dni w przypadku witaminy B73). Upewnij się, że rolki papieru są przez cały czas mokre, dodając w razie potrzeby sterylną wodę.</li>
		<li>Przenieść do roztworu NPA o stężeniu 25 μM na 4 dni (patrz kroki 2.4.1 do 2.4.4), a następnie podobnie indukować boczną inicjację korzenia poprzez zastąpienie roztworu NPA roztworem NAA o stężeniu 50 μM po etapie przemywania (patrz kroki 2.4.5 do 2.4.9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+branch+or+not+to+branch%3A+the+role+of+pre-patterning+in+lateral+root+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation.</a> Development. 140, 4301-4310 (2013).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organisation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root.</a> Development. 119, 71-84 (1993).</li>
<li>Bell, J. K., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+study+of+lateral+root+initiation+and+development+in+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays.</a> Protoplasma. 70, 179-205 (1970).</li>
<li>Benkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local%2C+efflux-dependent+auxin+gradients+as+a+common+module+for+plant+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation.</a> Cell. 115, 591-602 (2003).</li>
<li>Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peri-cell-cycle+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">The peri-cell-cycle in Arabidopsis.</a> J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).</li>
<li>Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-mediated+cell+cycle+activation+during+early+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation.</a> Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).</li>
<li>Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+system+for+lateral+roots+in+Arabidopsis+thaliana+and+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize.</a> Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).</li>
<li>Casimiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+transport+promotes+Arabidopsis+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation.</a> Plant Cell. 13, 843-852 (2001).</li>
<li>Himanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profiling+of+early+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcript profiling of early lateral root initiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).</li>
<li>De Smet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-like+kinase+ACR4+restricts+formative+cell+divisions+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root.</a> Science. 322, 594-597 (2008).</li>
<li>Vanneste, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+in+the+pericycle+is+not+sufficient+for+SOLITARY+ROOT%2FIAA14-mediated+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).</li>
<li>Jansen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+as+a+tool+for+the+identification+of+root+branching+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize.</a> Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).</li>
<li>Parizot, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarch+symmetry+of+the+vascular+bundle+in+Arabidopsis+root+encompasses+the+pericycle+and+is+reflected+in+distich+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation.</a> Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitious+roots+and+lateral+roots%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences.</a> Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).</li>
<li>Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+roots%3A+One+common+pathway+for+all+angiosperms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Plant+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms?</a> Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).</li>
<li>Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParizot%2C+B+%22Root+Genomics+and+Soil+Interactions%22">Root Genomics and Soil Interactions</a>. Crespi, M. , 3-28 (2012).</li>
<li>Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%2C+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types%3A+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15, 583-596 (2003).</li>
<li>Ludwig, Y., Hochholdinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of plant cells.</a> Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).</li>
<li>Beeckman, T., Engler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+technique+for+the+clearing+of+histochemically+stained+plant+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).</li>
<li>Ditengou, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+of+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).</li>
<li>Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+fluxes+in+the+root+apex+co-regulate+gravitropism+and+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation.</a> J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).</li>
<li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+root+formation+in+rice+%28Oryza+Sativa.+L.%29%3A+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li>
<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
<li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethylene+on+uptake%2C+distribution%2C+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li>
<li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2%2C4-dichlorophenoxy+acetic+acid%2C+naphthalene-1-acetic+acid%2C+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li>
<li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+genome-scale%2C+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li>
<li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole LRIS Arabidopsis ważne jest, aby przenosić tylko te sadzonki, które wyrosły całkowicie w kontakcie z podłożem zawierającym NPA. Gwarantuje to, że boczna inicjacja korzenia jest zablokowana na całej długości korzenia. Aby zapobiec zranieniu sadzonek podczas przenoszenia, ramiona zakrzywionych kleszczy można zaczepić pod liścieniami sadzonki. Po przeniesieniu upewnij się, że korzenie sadzonek mają wystarczający kontakt z podłożem agarowym zawierającym NAA. Można to osiągnąć, przesuwając korzeń po powie...

System korzeniowy jest kluczowy dla wzrostu roślin, ponieważ zapewnia zakotwiczenie i pobieranie wody i składników odżywczych z gleby. Ponieważ ekspansja systemu korzeniowego opiera się głównie na produkcji korzeni bocznych, ich inicjacja i tworzenie są szeroko badane. Korzenie boczne są inicjowane w określonym podzbiorze komórek perycyklowych, zwanych komórkamizałożycielskimi 1. U większości roślin dwuliściennych, takich jak Arabidopsis thaliana, komórki te znajdują się na biegunach protoksylemu2, podczas gdy u roślin jednoliściennych, takich jak kukurydza, znajdują się na biegunach łyka3. Komórki założycielskie charakteryzują się zwiększoną odpowiedzią auksynową4, po której następuje ekspresja określonych genów cyklu komórkowego (np. CYKLINA B1; 1 / CYCB1; 1), po czym przechodzą pierwszą rundę asymetrycznych podziałów antyklinalnych5. Po serii skoordynowanych podziałów antyklinalnych i peryklinalnych tworzy się zawiązek korzenia bocznego, który ostatecznie wyłoni się jako autonomiczny korzeń boczny. Miejsce i czas bocznej inicjacji korzeni nie są jednak przewidywalne, ponieważ zdarzenia te nie są ani obfite, ani zsynchronizowane. Utrudnia to stosowanie podejść molekularnych, takich jak transkryptomika, do badania tego procesu.
Aby temu zaradzić, opracowano System Indukowania Korzeni Bocznych (LRIS)6, 7. W tym systemie siewki są najpierw traktowane kwasem N-1-naftyloftalamowym (NPA), który hamuje transport i akumulację auksyny, w konsekwencji blokując boczną inicjację korzeni8. Następnie przenosząc sadzonkę na pożywkę zawierającą syntetyczną auksynę Kwas 1-naftalenooctowy (NAA), cała warstwa perycyklowa reaguje na podwyższony poziom auksyny, wywołując w ten sposób masowo boczne korzenie inicjujące podziały komórkowe6. W związku z tym system ten prowadzi do szybkich, synchronicznych i rozległych inicjacji korzeni bocznych, umożliwiając łatwe pobieranie próbek korzeni wzbogaconych o określony etap rozwoju korzeni bocznych. Następnie próbki te można wykorzystać do określenia profili ekspresji całego genomu podczas tworzenia korzeni bocznych. LRIS dostarczył już znaczącej wiedzy na temat bocznej inicjacji korzeni u rzodkiewnika i kukurydzy9-13, ale potrzeba zastosowania tego systemu do innych gatunków roślin staje się coraz bardziej oczywista w miarę sekwencjonowania większej liczby genomów i rosnącego zainteresowania transferem wiedzy do gatunków ważnych z ekonomicznego punktu widzenia.
Tutaj podane są szczegółowe protokoły RRIS Arabidopsis i kukurydzy. Następnie przedstawiono przykład zastosowania systemu, ilustrując, w jaki sposób dane transkryptomiczne uzyskane z LRIS kukurydzy można wykorzystać do identyfikacji funkcjonalnych homologów, które pełnią zachowaną funkcję podczas bocznej inicjacji korzeni u różnych gatunków roślin. Na koniec zaproponowano wytyczne mające na celu optymalizację LRIS dla innych gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td><silny>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nasiona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis</td><td></td><td></td> nasiona <td>Col-0 ekotyp</td></tr><tr><td>Sterylizacja gazowa nasion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf mikroprobówki 3810X, PCR czyste</td></tr><tr><td>mikroprobówki wirówkowe 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock kwas</td></tr><tr><td>solny</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (dymiące) do analizy EMSURE ACS,ISO,Reag. Szklany</td></tr><tr><td>eksykator</td> Ph Eu <td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Szklana</td></tr><tr><td>zlewka</td><td></td><td></td><td></td></tr> Pyrex <tr><td>plastikowe probówki do mikrowirówek pudełko lub uchwyt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Wybielacz sterylizacja nasion</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Etanol, abs. 100% s.a. rozcieńczony do 70%</td></tr><tr><td>podchloryn sodu (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterylna woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Pożywka wzrostowa</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina soli Murashige i Skoog</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>mio-inozytol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-sacharoza Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>granulki do analizy (maks. 0,002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Hodowla tkanek roślinnych Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia do indukcji korzeni bocznych</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-1-naftyloftalamowy (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>Nr N0926.0250</td><td>10 &mikro; Kwas M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naftalenooctowy (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nr N0903.0050</td><td>10 &mikro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Wykonanie siatki do transferu</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylonowa siatka</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Syntetyczna siatka nylonowa 20 &mikro; m</td></tr><tr><td>Siew i obsługa sadzonek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square talerze Petriego</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml probówki DURAN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp; Probówki wirówkowe 50 ml</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cięte</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, odciąć 5 mm końcówki przed autoklawowaniem</td></tr><tr><td>taśmy oddychającej&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>nr kat. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>pęseta</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pęseta Dumont typ A nr 5; Pęseta Dumont typ e nr 7</td></tr><tr><td><silny>Warunki wzrostu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth pokój</td><td></td><td></td><td>21 &deg; C, ciągły lekki</td></tr><tr><td><silny>Materiały</mocny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Katalog</mocny></td><td><silny>Komentarze</mocny></td></tr><tr><td><silny>KUKURYDZA LRIS</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nasiona</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziarna kukurydzy</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>Sterylizacja ziaren wybielaczem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass zlewka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetyczna mieszadło&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>podchloryn sodu (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterylna woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silna>Chemikalia do indukcji korzeni bocznych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-1-naftyloftalamowy (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>Nr N0926.0250</td><td>50 &mikro; M (korzeń pierwotny kukurydzy), 25 &mikro; M (korzeń przybyszowy kukurydzy)</td></tr><tr><td>Kwas 1-naftalenooctowy (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Nr N0903.0050</td><td>50 &mikro; M (kukurydziany)</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Siew i obsługa sadzonek</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ręczniki papierowe</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Ręczniki do rąk - rolka / białe; rozmiar arkusza (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>papier do kiełkowania nasion</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38 # papier do kiełkowania nasion</td></tr><tr><td>pęseta</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pęseta Dumont typ A nr 5; Pęseta Dumont typ e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml probówki (wirówka)</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>średnicy ok. 5,6 cm i wysokości 14,7 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki 700 ml</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylindry, okrągła rurka stopy, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>stojak</td><td></td><td></td><td>na probówki do kukurydzy, domowa</td></tr><tr><td>sterylna woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silna>Warunki wzrostu</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>szafka</td><td></td><td></td> wzrostowa <td>27 &deg; C, światło ciągłe, wilgotność względna 70%</td></tr></tbody></table>

system indukowany korzeniami bocznymi u arabidopsis i kukurydzy

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Boczny rozwój korzeni znacząco przyczynia się do rozwoju systemu korzeniowego, a zatem jest kluczowy dla wzrostu roślin. Badanie bocznej inicjacji korzenia jest jednak żmudne, ponieważ zachodzi ona tylko w kilku komórkach wewnątrz korzenia i w nieprzewidywalny sposób. Aby obejść ten problem, opracowano system indukowany korzeniami bocznymi (LRIS). Poprzez traktowanie siewek kolejno inhibitorem transportu auksyny i syntetyczną auksyną, wysoce kontrolowana boczna inicjacja korzenia zachodzi synchronicznie w korzeniu pierwotnym, umożliwiając obfite pobieranie próbek w pożądanym stadium rozwojowym. LRIS został po raz pierwszy opracowany dla Arabidopsis thaliana, ale może być również stosowany do innych roślin. W związku z tym został przystosowany do stosowania w uprawie kukurydzy (Zea mays). Przedstawiono szczegółowy przegląd różnych etapów LRIS w obu zakładach. Połączenie tego systemu z transkryptomiką porównawczą umożliwiło identyfikację funkcjonalnych homologów genów inicjacji korzeni bocznych rzodkiewnika u innych gatunków, jak pokazano tutaj dla CYCLIN B1; 1 (CYCB1; 1) gen cyklu komórkowego w kukurydzy. Na koniec omówiono zasady, które należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu LRIS dla innych gatunków roślin.

Zastosowanie LRIS do przeprowadzenia porównawczej transkryptomiki procesu inicjacji korzeni bocznych
Jednym z zastosowań LRIS jest porównywanie i korelacja profili ekspresji genów podczas tworzenia korzeni bocznych u różnych gatunków. Podejścia z zakresu transkryptomiki porównawczej stwarzają możliwość precyzyjnego wskazania genów ortologicznych zaangażowanych w proces rozwoju korzeni bocznych u różnych gatunków...

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Ogólnym celem systemu indukcji korzeni bocznych jest zsynchronizowanie inicjacji korzeni bocznych w roślinach za pomocą zabiegów hormonalnych. Korzenie roślin są ukryte i wiadomo, że ich badanie jest niezwykle trudne. Opracowaliśmy system in vitro, który umożliwia badanie procesu inicjacji korzeni bocznych na poziomie cytologicznym, histologicznym i molekularnym.Zazwyczaj naukowcy rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotykać trudności, jeśli rośliny nie osiągnęły odpowiedniego kontaktu z podłożem, co uniemożliwia jednorodną indukcję korzeni bocznych. Demonstracja wizualna tej metody pomaga przedstawić krytyczne kroki, które należy uwzględnić, aby zapewnić jednorodną indukcję. Chociaż system ten został pierwotnie opracowany dla niewielkiej rośliny Arabidopsis, może on zostać zastosowany również w innych systemach, takich jak kukurydza, ryż lub jęczmień.Na początek, za pomocą sterylnej pęsety nanieś nylonową siatkę o oczkach 20 µm na pożywkę wzrostową uzupełnioną o NPA. Delikatnie dociśnij siatkę do pożywki za pomocą rozcieracza Drigalskiego, aby zapewnić jej dobry kontakt z podłożem. Następnie wciśnij sterylną wykałaczkę w agar, aby stworzyć na jej końcówce lepką powierzchnię.Użyj wykałaczki, aby równomiernie rozprowadzić partię sterylizowanych gazem nasion na przygotowanych płytkach. Uszczelnij płytki oddychającą taśmą klejącą i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsius w ciemności przez co najmniej dwa dni i maksymalnie jeden tydzień. Jest to konieczne dla stratyfikacji i zapewnia zsynchronizowaną oraz wydajną kiełkowanie.Trzeciego dnia przenieś płytki do pomieszczenia hodowlanego na dwa dni kiełkowania, a następnie na trzy dni wzrostu pod kątem od 80 do 90 stopni. Ósmego dnia zidentyfikuj korzenie, które wyrosły w całkowitym kontakcie z siatką, a także korzenie, które nie są w kontakcie z siatką. Usuń wszystkie siewki, których korzenie nie stykają się z siatką.Przenieś siatki zawierające siewki na płytki uzupełnione 10 micromolar NAA. Po umieszczeniu na płytce, w razie potrzeby delikatnie dociśnij siatkę do powierzchni pożywki, aby upewnić się, że ściśle przylega ona do medium wzrostowego. Aby zapewnić jednorodną indukcję we wszystkich siewkach, ważne jest odrzucenie tych, które na pożywce z dodatkiem NPA nie urosły w kontakt z siatką, oraz prawidłowe dociśnięcie siatki, jeśli jest to konieczne, na pożywce z dodatkiem NAA.Uszczelnij nowe płytki przepuszczalną taśmą i umieść je w pomieszczeniu do hodowli w pozycji pionowej na wymagany czas po indukcji. W momencie zbierania próbek, użyj skalpela, aby przeciąć segmenty korzeni jednocześnie bezpośrednio na siatce, a następnie pobierz próbki, delikatnie zeskrobując powierzchnię siatki. Przedstawimy teraz niektóre etapy działania systemu indukowalnego korzeni bocznych u kukurydzy.Rozpocznij od sterylizacji ziaren kukurydzy, umieszczając odpowiednią liczbę ziaren w sterylnym zlewce szklanym. Następnie do zlewki dodaj 100 milliliters 6% podchlorynu sodu w wodzie oraz mieszadło magnetyczne. Postaw zlewkę na mieszadle magnetycznym i mieszaj z niską prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie usuń roztwór wybielacza. Zastąp go 100 mililitrami świeżej sterylnej wody i płucz nasiona przez pięć minut. Powtórz ten krok pięć razy.Załóż rękawiczki i oderwij dwa arkusze ręczników papierowych, kładąc je jeden na drugim na czystej powierzchni. Następnie złóż arkusze na pół wzdłuż ich długości. Używając pęsety, rozmieść 10 nasion w odległości około dwóch centymetrów od górnej krawędzi, na całej długości papieru, zachowując odstęp ośmiu centymetrów między każdym nasionem oraz pozostawiając osiem centymetrów wolnej przestrzeni na obu końcach.Upewnij się, że koleń jądra jest skierowany w dół i w stronę papieru. Delikatnie zroluj papier wzdłuż jego długości, dbając o to, aby nasiona pozostały na swoim miejscu. W razie potrzeby można spryskać papier sterylną wodą, aby ułatwić ten etap.Umieść rolki w sterylizowanych probówkach szklanych i włóż dodatkowe probówki do statywu. Wlej 125 mililitrów 50 mikromolarnego roztworu NPA na rolkę papieru w probówce. Rolka papieru wchłonie roztwór i zostanie całkowicie nasączona.Umieść system z papierowych rolki w komorze wzrostowej na trzy dni. Upewnij się, że rolki papierowe pozostają nasączone podczas inkubacji, dodając w razie potrzeby dodatkowy roztwór NPA. Aby zapewnić jednorodną indukcję inicjacji korzeni bocznych, ważne jest sprawdzenie, czy rolki papierowe pozostają wilgotne od roztworu NPA, ale jednocześnie korzenie nie są zanurzone w samym płynie.Po trzech dniach przebywania w NPA siewka kukurydzy posiada mały pęd oraz korzeń o długości około dwóch do trzech centymetrów. W czwartym dniu delikatnie wyciśnij większość pozostałego roztworu NPA z papierowych rolek i umieść rolki w sterylnej wodzie, aż zostaną nasycone. Po około pięciu minutach delikatnie wyciśnij większość wody z papierowych rolek.Powtórz etap płukania trzykrotnie. Po ostatnim płukaniu wyciśnij większość wody i umieść papier z powrotem w probówce. Wlej 50 µM roztwór NAA na rolki papieru w probówkach, aż zostaną całkowicie nasączone.Następnie umieść system z papierowymi rolkami w komorze wzrostowej na pożądany czas po indukcji. W porównaniu do siewek linii markera odpowiedzi na auksynę pDR5-GUS, które nie rosły na NAA lub rosły na NAA przez jedną godzinę, siewki hodowane na NAA przez dwie godziny wykazują odpowiedź na auksyny, która jest jednym z pierwszych zdarzeń wyzwalających inicjację korzeni bocznych. Podziały te zaczynają przesuwać się w górę od wierzchołka około drugiej godziny i nasilają się przy przedłużonej ekspozycji na NAA.Przy użyciu linii markerowej cyklu komórkowego pCYCB1;1-Gus pierwsze podziały komórkowe prowadzące do formowania korzeni bocznych można zaobserwować zaczynając od około sześciu godzin po rozpoczęciu traktowania NAA. Mikromacierze oraz ilościowa rt-PCR mogą być wykorzystane do oceny ekspresji różnych genów w różnych regionach korzeni Arabidopsis i kukurydzy podczas indukcji korzeni bocznych. Zarówno w przypadku Arabidopsis, jak i kukurydzy, przy dłuższym czasie wzrostu roślin, indukowane podziały doprowadzą do rozwoju i wyrastania korzeni bocznych.Jako dowód koncepcji systemu zastosowanego u kukurydzy, przedstawiono siewki wyhodowane w różnych warunkach w celu porównania. Siewki hodowane przez 10 dni w wodzie mają korzenie boczne, które nie zainicjowały się synchronicznie i są szeroko rozstawione wzdłuż osi. Siewki hodowane przez 10 dni w obecności NPA w ogóle nie posiadają korzeni bocznych.Siewki hodowane przez trzy dni na NPA, a następnie poddane działaniu NAA, wykazują masową i zsynchronizowaną indukcję korzeni bocznych. W tym filmie pokazaliśmy, jak przygotować system indukcji korzeni bocznych, który okazał się niezwykle istotny w odkrywaniu nowych, fundamentalnych informacji na temat procesu rozgałęziania korzeni. Przedstawiliśmy działanie tej metody na przykładzie Arabidopsis oraz kukurydzy, jednak można ją łatwo dostosować do innych wybranych gatunków roślin.Powodzenia.

lateral-root-inducible-system-in-arabidopsis-and-maize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Ten protokół pokazuje metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii świetlnej. Konfiguracja charakteryzuje się zamontowaniem rośliny pionowo na powierzchni żelu i pozwoleniem jej rosnąć w kontrolowanych jasnych warunkach. Pozwala to na długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych w znormalizowanych warunkach.

Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego korzeni roślin rosnących na powierzchni żelu

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Poznaj system indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis thaliana i kukurydzy. Ta metoda in vitro umożliwia synchroniczną indukcję i badanie rozwoju korzeni na poziomie cytologicznym oraz molekularnym.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Przeglądaj więcej filmów