Name: Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę ELISA do badania interakcji ligand-receptor i określania stałej dysocjacji. Technika umożliwia pomiar powinowactwa wiązania cytokin oraz identyfikację skutecznych peptydów blokujących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy prof. J. Stellingowi (Departament Nauki o Biosystemach i Inżynierii, ETH Zurich oraz Szwajcarski Instytut Bioinformatyki, Basel, Szwajcaria) za krytyczną recenzję manuskryptu.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Aby przygotować bufor do powlekania węglanu, rozpuścić 0,36 g Na2CO3 i 0,84 g NaHCO3w 100 ml destylowanej wody; sterylnie przefiltrować bufor za pomocą membranowego filtra polietersulfonowego (PES) o średnicy 0,22 μm napędzanego podciśnieniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować roztwór do płukania przez dodanie 0,05% v/v Tween 20 w buforze fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór albuminy krążącej byka (BSA) (roztwór blokujący) w roztworze PBS poprzez rozpuszczenie 5 g BSA (≥98%) w 100 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rekombinowany receptor, ligandy i peptydy blokujące
	<ol>
		<li>Zrekonstruować rekombinowany ludzki receptor podjednostki alfa interleukiny (IL28RA) i rekombinowane ligandy z oznaczeniem His ludzkiego IFN (IFNL1-3) zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywać w temperaturze -80°C. Syntetyzować peptydy blokujące i używać zgodnie z wcześniejszymi opisami 4. Użyć PBS do przygotowania różnych stężeń ligandów i peptydów do użycia w badaniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować przeciwciało pierwotne, rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne mysie 6x His w PBS z 0,1% BSA w rozcieńczeniu 1:1 000. Aby przygotować przeciwciało wtórnego, rozcieńczyć przeciwciało wtórnego koziego przeciwko mysiemu IgG (H+L) sprzężonego z peroksydazą rzodkiewkową (HRP) w PBS z 0,1% BSA w rozcieńczeniu 1:10 000.</li>
	<li>Przygotować roztwór TMB przez zmieszany reagenty A i B zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotować roztwór zatrzymania poprzez dodanie 5 N siarczany kwasu (H2SO4) w destylowanej wodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Enzymatyczne testy immunosorbentowe (ELISA)
UWAGA: Przeprowadzić bezpośrednie oddziaływanie ligand-receptor ELISA (bezpośrednie LRA, Rysunek 1) można użyć do zmierzenia stałej dysocjacji receptor-ligand (KD), jako miary powinowactwa receptor-ligand. Konkurencyjne oddziaływania ligand-receptor ELISA (konkurencyjne LRA, Rysunek 2) pozwala na przesiewowe badania peptydów (oraz innych związków blokujących), które działają na zakłócenie interakcji między ligandem a receptorem. Podstawowy protokół, który został wcześniej opublikowany 5, został dodatkowo zoptymalizowany. 
UWAGA: W obu metodach ELISA użyć wielociągowej pipety do dodawania roztworów do dołeczków płytki 96-dołęczkowej w każdym kroku. W krokach dekantacji roztworu lub płukania, wyrzucać roztwory bezpośrednio do zlewozmywaka.
<ol>
	<li>Test oddziaływania ligand-receptor (bezpośrednie LRA) 
	UWAGA: Do zilustrowania przepływu pracy (patrz Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Powlekanie płytki z rekombinowanym receptorem
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć rekombinowany receptor w buforze węglanu do końcowej koncentracji 100 ng/µl. Powlekać dołki płytki mikrotytrowawczej 96-dołęczkowej z fiksowaną koncentracją receptora (100 ng/µl) przez pipetowanie 100 µl do każdego dołka za pomocą wielociągowej pipety. Wykluczyć zewnętrzne ściany płytki, aby uniknąć artefaktu krawędzi dołka. Pokryć płytkę pokrywką i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C O/N.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Blokowanie i dodawanie ligandów
		<ol>
			<li>Następnego dnia usunąć roztwór powlekający poprzez pochylenie płytki w kierunku zlewozmywaka i płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania (PBS + 0,05% v/v Tween 20).</li>
			<li>Zablokować wolne miejsca wiązania receptora na powlekanej płytce za pomocą 200 µl 5% roztworu BSA do każdego dołka za pomocą wielociągowej pipety i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wyrzucić roztwór blokujący (patrz krok 2.1.2.1.) i płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania.</li>
			<li>Przygotować rekombinowane ligandy z oznaczeniem His w różnych stężeniach (np. 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml, 0,031 μg/ml, 0,0 μg/ml) w PBS. Dodać tylko PBS w pustych dołkach.</li>
			<li>Dodać 100 µl każdego stężenia ligandu do dołków w dwóch egzemplarzach i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, umożliwiając oddziaływanie ligand-receptor.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja z przeciwciałami
		<ol>
			<li>Po inkubacji z ligandami, płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania.</li>
			<li>Pipetować 100 µl roztworu pierwotnego przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciwko His do każdego dołka.</li>
			<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godzin

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).</li>
<li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other%2C+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li>
<li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation%3A+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li>
<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. był wspierany przez granty badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Uniwersytetu w Bazylei, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel i Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. wyraża wdzięczność za stypendium iPhD inicjatywy SystemsX.ch w programie biologii systemowej (9th call).

ELISA jest standardową i sprawdzoną metodą dla wielu laboratoriów. Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy wcześniej opublikowaną metodę 5,7. Przedstawiony krok po kroku protokół pokazuje, jak można go wykorzystać w prosty sposób do określania wartości KD interakcji ligand-receptor. Ponadto można wyznaczyć IC50 peptydu blokującego, który interfereuje z interakcją ligand-receptor.
Główne zalety to szybkie przygotowanie, łatwa preparacja odczynników i znajomość obsługi, ponieważ wi...

W pełne zrozumienie szlaków sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy na temat interakcji ligand-receptor. Większość metod oceny interakcji konkretnego ligandu z jego specyficznym receptorem jest droga, czasochłonna, wymagająca dużo pracy i wymaga specyficznego sprzętu i doświadczenia 1.
W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punkt po punkcie protokoły do badania interakcji ligand-receptor na podstawie enzymowego testu immunopochłaniania (ELISA): bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) i konkurencyjny test LRA. ELISA jest wysoce czułą, specyficzną i dostępną techniką, rutynowo stosowaną w prawie każdym laboratorium. ELISA może być wykonywany i dostosowywany na różne sposoby. Prezentowane protokoły są zoptymalizowane do badania interakcji między różnymi interferonami lambda (INFL) a ich receptorem.
Bezpośredni LRA umożliwia ilościową ocenę wiązania ligand-receptor w odniesieniu do stężenia ligandu, a tym samym daje krzywą wiązania. Stosując odpowiedni model interakcji ligand-receptor, dane można analizować dalej w celu oszacowania stałej dysocjacji (KD).
W przedstawionym protokole zastosowana jest powszechnie stosowana równanie Hilla do modelowania wiązania ligand-receptor. Chociaż inne metody, takie jak technologia rezonansu plazmonowego powierzchniowego 2,3, pozwalają na określenie powinności wiązania między dwoma białkami, ta technologia jest często pracochłonna, droga i wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego.
Konkurencyjny LRA umożliwia przesiewowe badanie peptydów inhibitorowych: wiązanie ligand-receptor jest ilościowo oceniane w odniesieniu do stężenia peptydu. Daje to krzywą dawkowanie-odpowiedź opisującą efekt inhibitorowy peptydu. Dane mogą być analizowane dalej w celu oszacowania połowniczej stężenia inhibitory (IC50) peptydu blokującego.
Oba protokoły ELISA są łatwe w użyciu i mogą być dostosowane do szerokiego zakresu pytań badawczych. Białka rekombinowane dowolnego rodzaju mogą być używane do rzetelnego i szybkiego określenia części interakcji. Ponadto konkurencyjny LRA może być używany do określenia krytycznych miejsc interakcji ligandów i receptorów za pomocą peptydów blokujących, które są zaprojektowane tak, aby naśladować ligand lub receptor. Jeśli peptyd blokujący wykazuje wydajne i specyficzne hamowanie, peptyd zajmuje krytyczne miejsce interakcji ligandu (jeśli peptyd naśladuje receptor) lub ligandu (jeśli peptyd naśladuje ligand).
Pierwszy protokół opisuje oznaczanie wartości KD dla różnych INFL i podjednostki alfa ich receptora, tzn. receptora interleukiny-28 (IL28RA) przy użyciu bezpośredniego LRA. Następnie drugi protokół pokazuje, jak określić zdolność 20-aminokwasowego peptydu do hamowania interakcji INFL-IL28RA. Peptyd jest zaprojektowany tak, aby konkurować z IFNL na ich miejscu wiązania receptorowego, a tym samym umożliwia zrozumienie molekularne interakcji. Ponadto ten peptyd może być użyty do blokowania IL28RA w eksperymentach in vitro w celu określenia wpływu na efekty sygnalizacji poniżej4.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>Płytka ELISA</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>Do bufora powlekającego płytki ELISA</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>Do bufora powlekającego płytki ELISA</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>5% BSA w PBS do blokowania</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28 alfa</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-29/Bez nośnika/C-końcowa metka 10-His</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28A/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28B/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His</td></tr><tr><td>6x His Monoclonal antibody (Mouse)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>Pierwotne przeciwciało do uchwytywania ligandów z metką His</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse igG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>Przeciwciało wtórnie sprzężone z peroksydazą chrzanu</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reagent set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA - roztwór substratu TMB</td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H2SO4 (Roztwór do zatrzymania reakcji enzymatycznej)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Microplate reader</td><td>BioTeK</td><td></td><td>Czytnik płytek ELISA</td></tr></tbody></table>

metoda wiązania i konkurencji oparta na technice elisa do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Pełne zrozumienie ścieżek sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy dotyczącej interakcji ligand-receptor. W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punktowe protokoły enzymowo-związanych testów immunosorbentowych (ELISA) do badania interakcji ligand-receptor: bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) oraz konkurencyjny LRA. Jako przypadek studyjny przedstawiono analizę ELISA interakcji między różnymi interferonami lambda (IFNL) a alfa podjednostką ich receptora (IL28RA): bezpośredni LRA stosuje się do wyznaczania stałych dysocjacji (wartości KD) między receptorem a ligandami IFN oraz konkurencyjny LRA do wyznaczania zdolności hamującej oligopeptydu, który został zaprojektowany, aby konkurować z IFNL na ich miejscu wiązania receptorowego. Opisano analityczne kroki służące do oszacowania wartości KD oraz połowowej maksymalnej stężenia hamującego (IC50). Na koniec, w dyskusji podkreślono zalety i wady przedstawionej metody oraz w jaki sposób wyniki umożliwiają lepsze molekularne zrozumienie interakcji ligand-receptor.

Stałą dysocjacji pomiędzy INFL1-3 a ich podjednostką receptora IL28RA wyznaczono za pomocą bezpośredniej LRA. Wyniki przedstawiono na Rysunku 3: Ułamek zajętych miejsc wiązania przedstawiono w przeliczeniu na logarytm odpowiedniej koncentracji IFN. Wykres Scatcharda danych przedstawiono w prawym dolnym rogu. Wyniki pokazują, że bezpośrednia LRA daje krzywą wiązania, którą można dalej analizować w celu oszacowania wartości KD. Wartość KD została określona przez dopasowanie...

Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Cele tej metody opartej na Elisa to po pierwsze określenie powinowactwa wiązania cytokiny do jej receptora, a po drugie, zmierzenie efektów blokujących peptydów inhibitorów interakcji ligand-receptor. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białko-białko, takich jak wiązanie cytokin-receptorów. Powinowactwa wiązań i ich blokowanie mogą zwiększyć ogólne zrozumienie dynamiki interakcji.Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, generowanie oznaczonych receptorów i stosunkowo niski koszt, dzięki łatwemu dostępowi do takich urządzeń jak czytnik Elisa. Chociaż ta metoda może dać wgląd w interakcję cytokin-receptor, może być również zastosowana do innych systemów, takich jak ogólne interakcje białko-białko i projektowanie związków blokujących, aby zahamować określone interakcje. Przygotuj roztwory zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Upewnij się, że bufor powłoki węglanowej jest filtrowany przez membranę PES o przepływie 0,22 mikrona. Użyj odkurzacza. Wykonaj również 10 różnych stężeń każdego ligandu lub peptydu.W tym filmie opisano dwa zastosowania, pierwsze to bezpośrednia interakcja ligand-receptor, Elisa. Może być używany do zmierzenia stałej dysocjacji receptor-ligand, która reprezentuje powinowactwo wiązania receptor-ligand. Drugie zastosowanie to ostatnio zoptymalizowane Elisa konkurencyjnej interakcji ligand-receptor.To umożliwia przesiewanie peptydów i innych związków blokujących, które działają na interakcję receptor-ligand. Dla efektywności, przygotuj się do użycia wielokanałowych pipet do płytek 96-dołkowych, a podczas dekantacji, po prostu wylej ich zawartość. Rozpocznij procedurę od powłoki płytki z rekombinantnym receptorem.Najpierw rozcieńcz receptor w buforze węglanowym do 100 nanogramów na mikrolitr. Następnie, wczytaj dołki płytki z 100 mikrolitami roztworu receptora. Wyklucz zewnętrzne ściany, aby uniknąć zajmowania się artefaktem brzegu płytki.Przykryj płytkę i inkubatoruj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Wykonuj wszystkie inkubacje płytek z delikatnym kołysaniem. Następnego dnia, usuń roztwór powłokowy i przemyj płytkę trzy razy roztworem do przemywania, PBS z odrobiną Tween 20.Następnie, zablokuj wolne miejsca wiązania receptora, dodając 200 mikrolitrów 5%PSA. Pozostaw płytkę do inkubacji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby ukończyć blokadę. Później, wylej zawartość dołków i przemyj płytkę jak poprzednio.Teraz, wczytaj dołki z 100 mikrolitami różnych rozcieńczeń rekombinantnego ligandu z tagiem his. Wczytaj każde stężenie dwukrotnie. Wczytaj dołki puste z PBS.Następnie, inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z ligandami, przemyj płytkę trzy razy roztworem do przemywania. Następnie, wczytaj 100 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciwko his do każdego dołka i inkubatoruj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po wypłukaniu przeciwciała, do każdego dołka dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego TMB, zrównoważonych ilości roztworów substratu A i B.Następnie, trzymaj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. Następnie, po wystarczającym rozwoju koloru, dodaj 50 mikrolitrów roztworu do każdego dołka.Protokół opiera się na założeniu, że sygnał mierzalny pochodzi z wiązania specyficznego. Może być konieczne oszacowanie wkładu wiązania niespecyficznego w sygnał. Następnie, odczytaj wartości absorpcji płytki przy 450 nanometrach i przejdź do obliczania wartości KD.Procedura konkurencyjnego LRA przebiega tak samo jak bezpośrednia procedura LRA, z wyjątkiem kilku ważnych zmian. Po przemyciu nadmiaru powłokowych ligandów z płytki, zablokuj dołki płytki. Dodaj 200 mikrolitrów 5%BSA roztworu do każdego dołka i inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Podczas inkubacji, przygotuj rekombinantne ligandy z tagiem his w stałym stężeniu 10 nanogramów na mililitr w PBS. Następnie, przygotuj peptyd blokujący w różnych stężeniach w PBS, w zakresie od 10 nanomolar do 100 mikromolar, aby zagwarantować krzywą dawki-odpowiedź. W ten sposób można znaleźć wartość IC50 dla peptydu blokującego.W dołkach kontrolnych, wczytaj stałe stężenie ligandu bez peptydu, aby wyprowadzić maksymalne wiązanie. W dołkach pustych, dodaj tylko PBS bez ligandu ani peptydu. W pozostałych dołkach, dodaj 50 mikrolitrów ligandów i 50 mikrolitrów każdego stężenia peptydu.Następnie, inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i postępuj jak zwykle. Stałości dysocjacji między trzema różnymi peptydami ligandów interferonu a podjednostką receptora IL28R-a zostały określone za pomocą bezpośredniego LRA, ułamek zajętych miejsc wiązania jest wykreślany przeciwko logarytmowi odpowiedniej koncentracji interferonu. Wyniki te ilustrują krzywą wiązania, która może być analizowana w celu oszacowania wartości KD poprzez dopasowanie danych do równania Hilla.Wykres Scatcharda ilustruje współpracę w wiązaniu ligandów, ostatecznie ligand interferonu 1 ma

an-elisa-based-binding-competition-method-to-rapidly-determine-ligand

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Ten film demonstruje wykrywanie interakcji receptor-ligand za pomocą testu reporterowego. Udana interakcja receptor-ligand aktywuje dalszy szlak sygnałowy, powodując wytwarzanie i uwalnianie cytokin jako wydzielniczych cząsteczek reporterowych w roztworze, co potwierdza się za pomocą testu ELISA.

Test reporterowy oparty na teście ELISA do badania interakcji receptor-ligand w komórkach BW

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Białka wiążące lód (IBPs), znane również jako białka przeciwzamrożeniowe, hamują wzrost kryształków lodu i stanowią obiecujący dodatek do stosowania w krio konserwacji tkanek. Głównym narzędziem wykorzystywanym do badania białek IBPs jest osmometr nanolitrowy. Opracowaliśmy autorską platformę chłodzącą zamontowaną na mikroskopie optycznym, sterowaną za pomocą dedykowanej procedury w programie LabVIEW. Opisany tutaj osmometr nanolitrowy umożliwia ultrazieczulną manipulację temperaturą próbki.

Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód

Białka przeciw zamarzaniu (AFP) wiążą się z określonymi płaszczyznami lodu, aby zapobiec lub spowolnić wzrost lodu. Analiza powinowactwa do płaszczyzny lodu oparta na fluorescencji (FIPA) jest modyfikacją oryginalnej metody trawienia lodu do oznaczania płaszczyzn lodu związanych z AFP. AFP są znakowane fluorescencyjnie, włączane do makroskopowych pojedynczych kryształków lodu i wizualizowane w świetle UV.

Wyznaczanie płaszczyzn wiązania lodu przez białka zapobiegające zamarzaniu za pomocą powinowactwa do płaszczyzny lodu opartej na fluorescencji

Poznaj metodę ELISA do badania interakcji ligand-receptor i określania stałej dysocjacji. Technika umożliwia pomiar powinowactwa wiązania cytokin oraz identyfikację skutecznych peptydów blokujących.

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

Przeglądaj więcej filmów