Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

Cele tej metody opartej na Elisa to po pierwsze określenie powinowactwa wiązania cytokiny do jej receptora, a po drugie, zmierzenie efektów blokujących peptydów inhibitorów interakcji ligand-receptor. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji białko-białko, takich jak wiązanie cytokin-receptorów. Powinowactwa wiązań i ich blokowanie mogą zwiększyć ogólne zrozumienie dynamiki interakcji.

Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, generowanie oznaczonych receptorów i stosunkowo niski koszt, dzięki łatwemu dostępowi do takich urządzeń jak czytnik Elisa. Chociaż ta metoda może dać wgląd w interakcję cytokin-receptor, może być również zastosowana do innych systemów, takich jak ogólne interakcje białko-białko i projektowanie związków blokujących, aby zahamować określone interakcje. Przygotuj roztwory zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Upewnij się, że bufor powłoki węglanowej jest filtrowany przez membranę PES o przepływie 0,22 mikrona. Użyj odkurzacza. Wykonaj również 10 różnych stężeń każdego ligandu lub peptydu.

W tym filmie opisano dwa zastosowania, pierwsze to bezpośrednia interakcja ligand-receptor, Elisa. Może być używany do zmierzenia stałej dysocjacji receptor-ligand, która reprezentuje powinowactwo wiązania receptor-ligand. Drugie zastosowanie to ostatnio zoptymalizowane Elisa konkurencyjnej interakcji ligand-receptor.

To umożliwia przesiewanie peptydów i innych związków blokujących, które działają na interakcję receptor-ligand. Dla efektywności, przygotuj się do użycia wielokanałowych pipet do płytek 96-dołkowych, a podczas dekantacji, po prostu wylej ich zawartość. Rozpocznij procedurę od powłoki płytki z rekombinantnym receptorem.

Najpierw rozcieńcz receptor w buforze węglanowym do 100 nanogramów na mikrolitr. Następnie, wczytaj dołki płytki z 100 mikrolitami roztworu receptora. Wyklucz zewnętrzne ściany, aby uniknąć zajmowania się artefaktem brzegu płytki.

Przykryj płytkę i inkubatoruj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Wykonuj wszystkie inkubacje płytek z delikatnym kołysaniem. Następnego dnia, usuń roztwór powłokowy i przemyj płytkę trzy razy roztworem do przemywania, PBS z odrobiną Tween 20.

Następnie, zablokuj wolne miejsca wiązania receptora, dodając 200 mikrolitrów 5%PSA. Pozostaw płytkę do inkubacji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby ukończyć blokadę. Później, wylej zawartość dołków i przemyj płytkę jak poprzednio.

Teraz, wczytaj dołki z 100 mikrolitami różnych rozcieńczeń rekombinantnego ligandu z tagiem his. Wczytaj każde stężenie dwukrotnie. Wczytaj dołki puste z PBS.

Następnie, inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji z ligandami, przemyj płytkę trzy razy roztworem do przemywania. Następnie, wczytaj 100 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciwko his do każdego dołka i inkubatoruj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po wypłukaniu przeciwciała, do każdego dołka dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego TMB, zrównoważonych ilości roztworów substratu A i B.Następnie, trzymaj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. Następnie, po wystarczającym rozwoju koloru, dodaj 50 mikrolitrów roztworu do każdego dołka.

Protokół opiera się na założeniu, że sygnał mierzalny pochodzi z wiązania specyficznego. Może być konieczne oszacowanie wkładu wiązania niespecyficznego w sygnał. Następnie, odczytaj wartości absorpcji płytki przy 450 nanometrach i przejdź do obliczania wartości KD.

Procedura konkurencyjnego LRA przebiega tak samo jak bezpośrednia procedura LRA, z wyjątkiem kilku ważnych zmian. Po przemyciu nadmiaru powłokowych ligandów z płytki, zablokuj dołki płytki. Dodaj 200 mikrolitrów 5%BSA roztworu do każdego dołka i inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji, przygotuj rekombinantne ligandy z tagiem his w stałym stężeniu 10 nanogramów na mililitr w PBS. Następnie, przygotuj peptyd blokujący w różnych stężeniach w PBS, w zakresie od 10 nanomolar do 100 mikromolar, aby zagwarantować krzywą dawki-odpowiedź. W ten sposób można znaleźć wartość IC50 dla peptydu blokującego.

W dołkach kontrolnych, wczytaj stałe stężenie ligandu bez peptydu, aby wyprowadzić maksymalne wiązanie. W dołkach pustych, dodaj tylko PBS bez ligandu ani peptydu. W pozostałych dołkach, dodaj 50 mikrolitrów ligandów i 50 mikrolitrów każdego stężenia peptydu.

Następnie, inkubatoruj płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i postępuj jak zwykle. Stałości dysocjacji między trzema różnymi peptydami ligandów interferonu a podjednostką receptora IL28R-a zostały określone za pomocą bezpośredniego LRA, ułamek zajętych miejsc wiązania jest wykreślany przeciwko logarytmowi odpowiedniej koncentracji interferonu. Wyniki te ilustrują krzywą wiązania, która może być analizowana w celu oszacowania wartości KD poprzez dopasowanie danych do równania Hilla.

Wykres Scatcharda ilustruje współpracę w wiązaniu ligandów, ostatecznie ligand interferonu 1 ma