Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 2. Praktyki ogólne

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie bezpiecznych praktyk podczas pracy w laboratorium kombinezonu poziomu bezpieczeństwa biologicznego 4 na przykładzie testu płytki nazębnej. Procedura ta demonstruje modyfikacje niezbędne do przeprowadzenia standardowego testu płytki nazębnej w środowisku o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 4. Procedurę demonstruje mi Tracey Burdette, technik ze Zintegrowanego Ośrodka Badawczego.

Po wypełnieniu codziennej listy kontrolnej systemów wewnętrznych, wyczyść szafę bezpieczeństwa biologicznego klasy II, spryskując wnętrze, w tym skrzydło, 5% roztworem dezynfekującym z podwójnym czwartorzędu amoniowym. Następnie wytrzyj szafkę ręcznikami papierowymi, pamiętając o pozostawieniu butelki z rozpylaczem zawierającej roztwór dezynfekujący wewnątrz szafki, aby spryskać dłonie w rękawiczkach podczas i po zakończeniu testu. Rozpyl 70% roztwór etanolu wewnątrz szafki i skrzydła, aby usunąć lepki roztwór dezynfekujący.

Przygotuj pojemnik na odpady do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że końcowe stężenie dwuczwartorzędowego amoniowego roztworu środka dezynfekującego w pojemniku na odpady nie jest mniejsze niż 5%, biorąc pod uwagę wszelkie dodatkowe ciecze, które są dodawane. Umieścić pojemnik na odpady zawierający 5% podwójny czwartorzędowy roztwór środka dezynfekującego amoniu w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

Wszystkie prace należy wykonywać jak najbliżej środka wewnętrznej komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Wewnętrzne centrum zostało zaprojektowane tak, aby było najbardziej afektywną pozycją, aby się chronić. Usunąć 50 mikrolitrów próbki wirusa i wirusa kontrolnego i umieścić je w 450 mikrolitrach zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's z 2% płodową surowicą bydlęcą w studzienkach do rozcieńczania.

Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń tak daleko, jak to konieczne. Wymieszać próbki wirusa co najmniej pięć razy za pomocą końcówki pipety, zmieniając końcówki pipet po każdym rozcieńczeniu. Mieszaj powoli, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza w próbkach.

Po zakończeniu odłóż studzienki rozcieńczające na bok. Podczas wyrzucania końcówek należy przepłukać każdą końcówkę roztworem dezynfekującym z pojemnika na odpady, aby odkazić wnętrze i zewnętrzną część końcówki przed wyrzuceniem końcówki do pojemnika na odpady. Usunąć większość pożywki z dołków z sześciu płytek do hodowli komórkowych.

Dodaj 100 mikrolitrów właściwej próbki do odpowiedniego dołka wstępnie oznakowanych płytek w dwóch egzemplarzach. Po zakończeniu spryskaj dłonie w rękawiczkach roztworem dezynfekującym. Użyj ręcznika papierowego nasączonego roztworem dezynfekującym, aby wytrzeć zewnętrzną stronę wszystkich płytek przed ręcznym umieszczeniem płytek w inkubatorze.

Kołysz płytkami ruchem cyfry 8, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie próbki po komórkach co 15 minut przez jedną godzinę. Dodaj dwa mililitry mieszanki nakładki do każdej studzienki i ponownie kołysz ruchem 8, aby równomiernie rozprowadzić nakładkę na całej powierzchni studni. Całkowicie zanurz wszystkie odpady w 5% roztworze dezynfekującym w pojemniku na odpady na czas kontaktu wynoszący co najmniej 10 minut.

Spryskaj wnętrze i zewnętrzną stronę pojemnika na odpady, wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy II, zewnętrzną część sprzętu oraz ręce w rękawiczkach 5% roztworem dezynfekującym. Pozostaw roztwór w pojemniku na odpady i na innych powierzchniach przez czas kontaktu wynoszący 10 minut. Następnie wyjmij przedmioty z szafki bezpieczeństwa biologicznego i zanieś je do zlewu.

Umieść zużytą pipetę w tacce na pipety w celu sterylizacji w autoklawie. Wlej zawartość wiadra na odpady do sitka w zlewie. Następnie przynieś pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, który jest wyłożony czerwoną torbą na wypadek zagrożenia biologicznego, do zlewu i wrzuć zawartość sitka do czerwonej torby na zagrożenie biologiczne.

Umieść worek z zagrożeniem biologicznym na tacy autoklawu na wózku. Luźno zamknij worki autoklawu taśmą, aby para dostała się do worka. I oznacz jedną z taśm autoklawu swoimi inicjałami i datą.

Wyjmij perforowany metalowy pręt z autoklawu i otwórz górę. Umieścić fiolkę ze wskaźnikiem biologicznym zawierającą zarodniki Geobacillus stearothermophilus w metalowym pręcie, aby służyła jako sprawdzenie, czy cykl sterylizacji w autoklawie zakończył się pomyślnie. Umieść tacę autoklawu wypełnioną odpadami w autoklawie.

Uruchom autoklaw i sprawdź, czy cykl się rozpoczął. Ekran operacyjny autoklawu wskaże czas pozostały do tego przebiegu. Po zakończeniu wymaganego okresu inkubacji ostrożnie wyjąć płytki do oznaczania płytki z inkubatora i ręcznie umieścić je w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego II.

Odessać pożywkę i materiał nakładki za pomocą pipety i dozować do pojemnika z roztworem dezynfekującym. Zastąp pożywkę mieszaniną 10% neutralnej buforowanej formaliny i 0,8% fioletu krystalicznego, aby dezaktywować wirusa na czas kontaktu 30 minut. Po inaktywacji ostrożnie usunąć neutralną zbuforowaną mieszaninę formaliny/fioletu krystalicznego i umieścić ją w oddzielnym pojemniku na odpady w celu zneutralizowania przed usunięciem.

Przy zlewie opłucz talerze, aby usunąć nadmiar plamy, a następnie umieść talerze na tacy, aby całkowicie wyschły. Użyj lightboxa, aby policzyć płytki. Zapisz wszystkie zliczenia i oblicz miano wirusa na podstawie standardowego równania.

W celu usunięcia inaktywowanych próbek z laboratorium BSL-4 umieść probówki lub płytki w torbie termozgrzewalnej. Spryskaj wnętrze worka 5% środkiem dezynfekującym lub utrwalaczem, aby zdezynfekować wnętrze worka i zewnętrzną część probówek z próbkami. A następnie zgrzej torbę.

Umieść tę saszetkę w innej torebce, postępując zgodnie z tą samą procedurą. Zgrzej drugą torebkę i umieść podwójnie uszczelnione torebki w zbiorniku do zanurzania zawierającym 5% roztwór dezynfekujący na co najmniej 10 minut, aby zdezynfekować zewnętrzną część torebek. Wypełnij dziennik zbiornika do zanurzania w laboratorium, określając liczbę i rozmiar probówek, objętość w probówkach, użyty środek, zastosowaną metodę inaktywacji oraz pomieszczenie, do którego zostaną przeniesione próbki.

Przestrzeganie odpowiednich procedur w laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 4 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia bezpiecznego i skutecznego przeprowadzania testów. Odwołując się do wypełnianej codziennej wewnętrznej listy kontrolnej, pracownicy laboratorium upewniają się, że sprzęt jest w pełni sprawny. Próbka wirusa jest seryjnie rozcieńczana w celu uzyskania płytek zawierających od 30 do 300 blaszek na studzienkę i określenia miana wirusa.

Na powstawanie blaszek wpływa szereg czynników, w tym tropizm wirusa dla linii komórek gospodarza, technika inokulacji, warunki wzrostu wirusa, odpowiedni zakres rozcieńczenia i wybór nakładki. Odpady powstające w komorze bezpieczeństwa biologicznego podczas zabiegu są dwukrotnie dezynfekowane. Odpady są odpowiednio dezynfekowane jednorazowo przed wyjęciem z komory bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie odpady są sterylizowane w autoklawie przed opuszczeniem środowiska o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego zwierząt. Dzięki zastosowaniu tych procedur nie odnotowano żadnych zakażeń nabytych w laboratorium podczas badań na poziomie bezpieczeństwa biologicznego zwierząt na poziomie 4 w Zintegrowanym Ośrodku Badawczym w Frederick. Technikę tę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, w zależności od liczby próbek, jeśli technika jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, pamiętaj o prawidłowym wykonaniu rozcieńczeń, odpowiednim zliczeniu blaszek i przestrzeganiu wszystkich środków ostrożności, aby zapewnić bezpieczny i udany eksperyment. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć fizyczne ograniczenia narzucane przez kombinezony nadciśnieniowe oraz dodatkowy czas wymagany do wykonania standardowego testu płytki nazębnej.