Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 3. Aerobiologia

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie ogólnego zrozumienia procedur aerozolowych w laboratorium z komorami bezpieczeństwa biologicznego poziomu IV, które wspierają bezpieczeństwo pracowników laboratorium. Wizualizacja tego protokołu pomaga przedstawić stopień złożoności oraz komponenty bezpieczeństwa administratorom ds. zdrowia rozważającym projektowanie podobnych budynków, a także zewnętrznym współpracownikom zaangażowanym w badania nad patogenami o wysokim stopniu zagrożenia. Główną zaletą tej techniki, wykorzystującej komory bezpieczeństwa biologicznego klasy III z podciśnieniem do eksperymentów aerozolowych, jest możliwość bezpiecznego prowadzenia badań z zakresu aerobiologii przez personel laboratoryjny bez konieczności stosowania kombinezonów z nadciśnieniem.

Jako główny aerobiolog, zaprezentuję tę procedurę wraz z Kylem Bohannonem, inżynierem aerozoli z naszego laboratorium. Należy przetestować funkcjonalność sprzętu do szybkiego transferu, czyli RTP, wykorzystywanego w procedurach aerobiologicznych, w tym drzwi wózka transportowego oraz RTP łączącego wózek transportowy przez ścianę z komorą bezpieczeństwa biologicznego klasy III, czyli BSC. Zablokuj RTP w odpowiedniej pozycji.

Należy monitorować i odnotowywać w kartach każdego naczelnego niebędącego człowiekiem (NHP) wszelkie manipulacje fizyczne, podania leków lub procedury rutynowe. Jeśli wymagane jest dodatkowe znieczulenie, należy upewnić się, że wszystkie zdjęte nasadki, zużyte igły, ostre przedmioty i strzykawki zostały wyrzucone do pojemnika na odpady medyczne. Nie należy ponownie nakładać nasadek na igły po ich użyciu.

Transportuj znieczulone NHPs w przezroczystych pojemnikach zabezpieczonych zatrzaskiem w pokrywie skrzyni transportowej. Załaduj pojemniki transportowe na wózek mobilny, aby umożliwić swobodne przemieszczanie się badaczy w pełnych kombinezonach z przewodami doprowadzającymi powietrze do drzwi odpornych na ciśnienie powietrza. Po zakończeniu ekspozycji na aerozol umieść NHP w wózku transportowym i przenieś NHP z powrotem do klatki macierzystej.

Równolegle z przygotowaniem zwierząt przeprowadzonym przez personel medycyny porównawczej, należy przetestować funkcjonalność zdekontaminowanej komory bezpieczeństwa biologicznego. Należy zweryfikować, czy podciśnienie w komorze BSC klasy III jest utrzymywane w określonym zakresie. Należy sprawdzić komorę BSC klasy III pod kątem potencjalnych nieszczelności lub pęknięć.

Należy sprawdzić syntetyczne rękawice gumowe oraz uszczelki o-ring zamocowane do zdekontaminowanej komory BSC klasy III pod kątem słabych punktów, pęknięć, rozdarć lub oznak starzenia gumy. Na tym etapie komora bezpieczeństwa biologicznego klasy III nie jest skażona. Należy wymienić uszkodzone rękawice gumowe i/lub uszczelki o-ring w komorze BSC klasy III.

Należy sprawdzić zbiornik do dezynfekcji i zweryfikować, czy jest on napełniony środkiem dezynfekcyjnym do poziomu oznaczonego kreską, albo do poziomu trzech cali powyżej przegrody zanurzeniowej. Za pomocą konduktometru należy potwierdzić, że przewodność elektryczna środka dezynfekcyjnego w zbiorniku wynosi co najmniej 3 500 µS lub 3,5 mS. Należy upewnić się, że autoklaw przy komorze BSC klasy III jest sprawny, aby umożliwić odbiór zanieczyszczonych odpadów i sprzętu po zakończeniu eksperymentu lub jednorazowe przekazanie do wnętrza komory BSC klasy III przez portal autoklawu sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia doświadczenia, który został pominięty.

Autoklawować należy wyłącznie sprzęt, który znosi rygory tego procesu. Należy przetestować funkcjonalność pozostałego sprzętu do aerobiologii, na przykład połączeń i gniazd elektronicznych.

Włóż dłonie w rękawice z gumy syntetycznej przymocowane do komory BSC klasy III. Zmontuj komorę ekspozycyjną przeznaczoną wyłącznie dla głowy NHP, rurkę kondycjonującą oraz platformę do zarządzania aerozolem. Podłącz generator aerozolu do rurki kondycjonującej, a aerodynamiczny analizator wielkości cząstek do komory ekspozycyjnej przeznaczonej wyłącznie dla głowy NHP.

Wycofaj dłonie z przymocowanych syntetycznych rękawic gumowych. Za każdym razem po wyjęciu dłoni z przymocowanych syntetycznych rękawic gumowych, zutylizuj jednorazowe rękawiczki jako odpady biologiczne. Następnie uruchom oprogramowanie do protokołu aerozolowego na laptopie.

Wprowadź do menu oprogramowania odpowiednią wartość przepływu dla komory ekspozycyjnej tylko dla głowy NHP, generatora aerozolu i biosamplera, a także informacje administracyjne. Pobierz wcześniej przygotowany patogen przez port szybkiego transferu i napełnij generator aerozolu patogenem. Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy III jest teraz skażona.

Za pomocą oprogramowania aerozolowego włącz generator aerozolu. Patogen z generatora aerozolu wypełni komorę ekspozycyjną. Po wyłączeniu generatora aerozolu opróżnij materiał wyzywający i wyrzuć go do worka na odpady biologiczne znajdującego się wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy III.

Następnie należy napełnić biosampler podłożem do pobierania i przymocować go do komory ekspozycyjnej przeznaczonej wyłącznie dla głowy NHP. Do biosamplera należy podłączyć odpowiednią linię próżniową. Należy sprawdzić, czy głębokość znieczulenia NHP jest odpowiednia, co potwierdza brak reakcji na bodźce zewnętrzne, napięcie mięśniowe oraz stabilna częstotliwość oddechów i tętno.

Przenieś znieczulonego NHP przez RTP do BSC klasy III. Umieść NHP w pozycji na plecach na rampie ekspozycyjnej. Zweryfikuj stabilność oznak życiowych NHP wizualnie oraz za pomocą przenośnego monitora pacjenta.

Przed eksperymentem przeprowadź kalibrację pletyzmografii indukcyjnej układu oddechowego (RIP) zgodnie z protokołem producenta. Załóż pasy pletyzmografii indukcyjnej wokół brzucha i klatki piersiowej NHP. Sprawdź, czy pasy są prawidłowo dopasowane, a złącza elektroniczne są mocno zatrzaśnięte.

Następnie umieść maskę kalibracyjną Numatech na pysku NHP. Następnie sprawdź, czy wokół pyska NHP utworzyło się uszczelnienie. Skalibruj paski RIP za pomocą maski kalibracyjnej Numatech, korzystając z oprogramowania komputerowego.

Po zakończeniu procesu zdejmij maskę kalibracyjną. Zapisz parametry oddechowe i wyeksportuj dane oddechowe dla każdego zwierzęcia za pomocą kompatybilnego programu. Ostrożnie przeprowadź głowę NHP przez gumową tamę dentystyczną przymocowaną do otworu na głowę w komorze ekspozycyjnej przeznaczonej wyłącznie dla głowy NHP.

Należy upewnić się, że gumowa tama dentystyczna tworzy szczelne zamknięcie wokół szyi NHP podczas ekspozycji na aerozol. Wprowadź do oprogramowania docelową skumulowaną objętość aerozolu oraz niezbędne identyfikatory sprzętu przypisane do każdego cyklu ekspozycji, a następnie uruchom procedurę aerozolową. Po tym, jak NHP wdycha docelową skumulowaną objętość, system zostaje wyłączony.

Odczep pasy RIP i połóż je na stole obok NHP. Przetrzyj NHP gazikiem nasączonym roztworem chlorheksydyny o stężeniu od 1% do 2%, zachowując ostrożność podczas przecierania okolic oczu NHP. Osusz głowę NHP, aby usunąć nadmiar roztworu.

Przenieś NHP z powrotem przez RTP do badaczy wewnątrz laboratorium z kombinezonami aerobiologicznymi ABSL-4. Opróżnij generator aerozolu oraz wszelkie pozostałe materiały wyzwalające do worka na odpady biologicznie niebezpieczne zawierającego śmieci, sprzęt jednorazowy i wypełnione w 3/4 pojemniki na odpady ostre. Przenieś media zbierające z biosamplera aerozoli do odpowiednio oznakowanych probówek zbiorczych.

Umieścić probówki do pobierania próbek w wiadrze z mokrym lodem, przygotowując je do odpowiedniego bioanalizy w celu określenia szacunkowej dawki wziewnej. Następnie przenieść probówki do pobierania próbek oraz wiadro przez RTP. Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy III to hermetycznie zamknięta szafa ze stali nierdzewnej utrzymywana pod podciśnieniem w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego IV dla zwierząt.

Materiały są wprowadzane do komory bezpieczeństwa biologicznego przez personel pracujący w laboratorium z komorą bezpieczeństwa biologicznego dla zwierząt poziomu IV za pomocą zamontowanego pod komorą zbiornika ze stali nierdzewnej, tzw. zbiornika do zanurzania, zawierającego pięcioprocentowy roztwór odkażający na bazie podwójnych czwartorzędowych soli amoniowych. Ponieważ BSC jest wbudowana w ścianę oddzielającą laboratorium z komorą od laboratorium ABSL-4 z wymogiem stosowania kombinezonów, materiały, zwierzęta i patogeny wirusowe mogą być również przenoszone do BSC ze strony laboratorium z kombinezonami, przy użyciu wózka transportowego i RTP. Po otwarciu drzwi wózka transportowego w stronę laboratorium ABSL-4 z kombinezonami, komora bezpieczeństwa biologicznego klasy III jest uznawana za skażoną.

Przedmioty znajdujące się wewnątrz BSC mogą być manipulowane z zewnątrz przez personel noszący różne rodzaje syntetycznych rękawic gumowych. Przedmioty te, z wyłączeniem próbek zakaźnych, są usuwane z BSC po sterylizacji w autoklawie dwudrzwiowym lub dezynfekcji w zbiorniku do zanurzania. Poprzez weryfikację prawidłowego funkcjonowania komory bezpieczeństwa biologicznego klasy III oraz sprzętu do bioaerozoli, utrzymywane jest bezpieczne i sprawnie działające środowisko, które jest niezbędne dla bezpieczeństwa personelu.

Dzięki ścisłemu przestrzeganiu tych procedur i praktyk nie odnotowano żadnych zakażeń laboratoryjnych podczas badań nad bioaerozolami w Integrated Research Facility w Frederick. Po opanowaniu techniki tej można ją przeprowadzać w czasie pozwalającym na wielokrotną ekspozycję naczelnych w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu odpowiedniej głębokości znieczulenia.

Bez sedacji w stanie stacjonarnym pozyskiwanie danych z plejtmografii staje się znacznie trudniejsze. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać inne eksperymenty z zakresu aerobiologii z udziałem mniejszych gatunków, takich jak króliki i myszy. Technika ta umożliwia badaczom w dziedzinie aerobiologii kontrolę zmiennych wpływających na dozymetrię, takich jak temperatura, wilgotność względna i wydajność biosamplera, w celu dostarczenia precyzyjnej dawki drogą wziewną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat środków ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego stosowanych podczas eksperymentów aerobiologicznych. Środki ostrożności, takie jak wielokrotna wymiana rękawiczek ochronnych, powinny zmniejszyć ryzyko potencjalnych zakażeń laboratoryjnych.