Name: Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj analizę obwodów strachu metodą optogenetyki ex vivo przy użyciu channelrhodopsyny i patch-clamp. Technika ta pozwala badać właściwości synaptyczne połączeń lokalnych i dalekiego zasięgu w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Corze Hübner i Andrei Gall za pomoc w zdobyciu niektórych reprezentatywnych wyników. Prace te były wspierane przez Centrum Neuronauki Integracyjnej im. Wernera Reichardta (CIN) na Uniwersytecie w Tybindze, inicjatywę doskonałości finansowaną przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach inicjatywy doskonałości (EXC 307) oraz przez fundusze Fundacji Charytatywnej Hertie.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z dyrektywą UE w sprawie wykorzystywania zwierząt w badaniach naukowych i zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (Regierungspräsidium Tuebingen, kraj związkowy Badenia-Wirtembergia, Niemcy) odpowiedzialną za Uniwersytet w Tybindze. 
1. Procedura iniekcji stereotaktycznej
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne narzędzia (nożyczki, skalpel, zaciski, wiertarka, igły, materiał do szycia) za pomocą sterylizatora. Na sterylnym serwety chirurgicznej ułóż sterylne narzędzia i inne wymagane roztwory i materiały chirurgiczne, takie jak sterylne wymienniki bawełny, środek dezynfekujący, sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,4) iH2O2na sterylnym serwecie chirurgicznym.</li>
	<li>Wyciągnąć szklane mikropipety do wstrzykiwań (Rysunek 1A, wkładka) za pomocą żarnika pudełkowego o szerokości 3 mm na poziomym ściągaczu do mikroelektrod zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: W przypadku głębokich wstrzyknięć stożek elektrody powinien być wystarczająco długi, aby osiągnąć najbardziej współrzędne brzuszne (ok. 5 mm; współrzędne, patrz 1.10).</li>
	<li>Zmieszaj 1 μl roztworu wirusa i 0,2 μl 0,1% szybko zielonego roztworu w sterylnym PBS (dla lepszej widoczności roztworu w szklanej pipecie). Napełnij szklane pipety mieszaniną roztworu wirusa i szybkiego zielonego za pomocą mikrolitrowej pipety z cienką końcówką (Rysunek 1A, wkładka). 
	Uwaga: Praca z rekombinowanymi wektorami wirusowymi związanymi z adenowirusem (rAAV) jest uważana za pracę na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL 1) i musi być wykonywana w laboratorium BSL 1. rAAV użyte w tym badaniu (ryc. 1C) to: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotyp 2/9) 16; 2) MGm/PIN: rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotyp 2/9) 23; 3) mpITC/BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotyp 2/1) 23</li>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt (izofluran: 3% w tlenie do indukcji). 
	Uwaga: Myszy użyte w tym badaniu były w wieku od 4 do 7 tygodni i należały do następujących szczepów i genotypów: C57Bl6 / J typ dziki (eksperyment na rysunkach 2A i 3A-D); GAD67-GFP 24 (doświadczenie na rysunkach 2B i 3E-H); Tac2-Cre 25 (eksperyment na rysunkach 2C i 3I-J).</li>
	<li>Ogol głowę między uszami a oczami. Nałóż środek dezynfekujący (na bazie jodu) na ogoloną głowę za pomocą bawełnianych wacików.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas znieczulenia. Wstrzyknąć podskórnie myszowi środek przeciwbólowy (na bazie meloksykamu, 0,1 ml 5 mg/ml roztworu).</li>
	<li>Umieść mysz w ramce stereotaktycznej (ryc. 1A) i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski do znieczulenia gazowego (izofluran: 2% tlenu do konserwacji). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania kończyn. 
	Uwaga: Utrzymuj sterylne warunki tak dobrze, jak to możliwe podczas całego zabiegu chirurgicznego; Noś jednorazową maskę na twarz, fartuch chirurgiczny i rękawiczki.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry na czubku głowy za pomocą nożyczek. Delikatnie odciągnij skórę na bok za pomocą kleszczy, przymocuj zaciskami, aby odsłonić powierzchnię czaszki i wyczyść czaszkę za pomocą H2O2.</li>
	<li>Zaznacz miejsca wstrzyknięć na czaszce za pomocą markera permanentnego z cienką końcówką i wywierć otwory na obie półkule (ryc. 1B). Współrzędne do wstrzyknięć w tym badaniu to (od Bregma (mm)): mPFC: przednia 1,9, boczna ± 0,3, brzuszna 2,1; MGm/PIN: tylny 3,0, boczny ± 1,8, brzuszny 3,8; mpITC/BLA: tylna 1,45, boczna ± 3,35 i brzuszna 4,75.</li>
	<li>Zamontuj napełnioną szklaną pipetę na ramie stereotaktycznej podłączonej do ciśnieniowego urządzenia do wstrzykiwania i ustaw pipetę w pozycji Bregma.</li>
	<li>Odłamać końcówkę szklanej pipety za pomocą cienkich kleszczyków z prostą końcówką. Zrób to delikatnie, aby zapobiec wytwarzaniu się roztworu wirusa w aerozolu. Upewnij się, że końcówka pipety jest otwarta, przykładając kilka impulsów ciśnienia i obserwując wyciskanie kropli roztworu wirusa.</li>
	<li>Przejdź do żądanych współrzędnych iniekcji i wstrzyknij połowę zawartości pipety (~0,5 μl), korzystając z następujących ustawień w ciśnieniowym urządzeniu do wstrzykiwania: Ciśnienie: 20 psi, średnia długość impulsu: 30 ms, średnia liczba impulsów: 50.</li>
	<li>Pozostaw pipetę na miejscu na ~1 minutę, a następnie powoli (1 mm/min) ją wycofaj. 
	Uwaga: Upewnij się, że pipeta nie jest zablokowana przed powtórzeniem procedury z tą samą pipetą na drugiej półkuli. W przypadku zatkania końcówki należy ponownie wyczyścić lub odłamać końcówkę i wyzerować pipetę w Bregma.</li>
	<li>Oczyść czaszkę za pomocą PBS (pH 7,4), usuń zaciski, delikatnie ściągnij skórę i zszyj nacięcie indywidualnym szwem guzikowym (3 - 4 węzły). Nałóż środek dezynfekujący (na bazie jodu) wokół rany.</li>
	<li>Przerwij znieczulenie i nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie zostanie całkowicie wybudzona. Trzymać w jednym pomieszczeniu lub wracać do towarzystwa innych zwierząt tylko wtedy, gdy w pełni wyzdrowieją. Po operacji kontynuuj monitorowanie stanu zdrowia i w razie potrzeby podawaj leki przeciwbólowe. Postępuj zgodnie z procedurami zgodnie z zasadami określonymi przez lokalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrych plastrów
<ol>
	<li>Przygotuj ACSF, roztwór do cięcia, narzędzia (nożyczki, skalpel, kleszcze, szpatułka, pipeta Pasteura) i bloki agarowe. 
	Uwaga: Na doświadczenie wymagany jest 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), który jest przygotowywany przez rozpuszczenie substancji chemicznych w podwójnie destylowanymH2O, jak wcześniej opublikowano 16,23. Roztwór do cięcia przygotowuje się przez uzupełnienie 200 ml ACSF 0,87 ml 2 M roztworu podstawowegoMgSO4</li>.
	<li>Natleniaj ACSF i roztwór tnący przez cały eksperyment za pomocą 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Głęboko znieczulij mysz za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt przy użyciu izofluranu (3% w tlenie). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania kończyny.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy dużymi nożyczkami i natychmiast schłodź głowę w lodowatym roztworze do cięcia.</li>
	<li>Otwórz czaszkę przez pojedyncze nacięcie w linii środkowej od ogona do rostralu i delikatnie popchnij kawałki czaszki na boki za pomocą kleszczy. Szybko usuń mózg, delikatnie wyjmując go z czaszki za pomocą małej zaokrąglonej szpatułki. Odetnij móżdżek skalpelem. Umieść mózg w lodowatym roztworze do cięcia.</li>
	<li>W przypadku miejsc wstrzyknięcia mPFC: odciąć przednią część mózgu (zawierającą mPFC) za pomocą skalpela i umieścić w lodowatym roztworze do krojenia, aż do pokrojenia.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu tnącego za pomocą bibuły filtracyjnej i przyklej tylną część mózgu do etapu wibratomu.</li>
	<li>W przypadku nachylonych plasterków ciała migdałowatego przyklej mózg do bloku agaru (4%) przyciętego pod kątem 35° (ryc. 1D, środek). W przypadku wycinków ciała migdałowatego koronalnego, miejsc wstrzyknięć MGm/PIN i miejsc wstrzyknięć mPFC, przyklej mózg bezpośrednio na scenie (ryc. 1D, po lewej i prawej). Umieść dodatkowy blok agaru za mózgiem, aby zapewnić stabilność podczas krojenia.</li>
	<li>Umieścić stolik w komorze tnącej z lodowato natlenionym roztworem tnącym, który jest utrzymywany w temperaturze 4 °C za pomocą jednostki chłodzącej. Przygotuj ostre plastry ciała migdałowatego (320 μm) za pomocą szafirowego ostrza. Umieść plastry w komorze interfejsu zasilanej natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po przygotowaniu wycinków ciała migdałowatego należy umieścić komorę interfejsu w łaźni wodnej o temperaturze 36 °C, aby odzyskać plastry na 35 - 45 minut. Następnie zwróć komorę interfejsu do RT. Aby nagrywać z tych wycinków, przejdź do kroku 3.2.</li>
	<li>Na początku etapu 2.10 należy odciąć plastry w miejscach wstrzyknięcia, jak opisano wcześniej dla wycinków ostrego ciała migdałowatego (kroki 2.8 - 2.9). Odzysk plastrów w kąpieli wodnej nie jest tutaj wymagany. Opcjonalnie: Aby szybko oszacować lokalizację miejsca wstrzyknięcia, obserwuj wycinki na stereoskopie wyposażonym w świetlówkę i odpowiednie zestawy filtrów.</li>
	<li>Utrwalić plastry zawierające miejsca wstrzyknięć do analizy post-hoc, umieszczając je między dwiema bibułami filtracyjnymi i zanurzając je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w roztworze PBS O/N. W celu analizy miejsc wstrzyknięć należy postępować zgodnie z krokiem 4.1.</li>
</ol>
3. Wizualizacja i stymulacja włókien presynaptycznych
<ol>
	<li>Przygotuj mikroskop płatowy do optogenetycznej aktywacji włókien i komórek:
	<ol>
		<li>Wyśrodkuj zamontowaną diodę elektroluminescencyjną (LED) na ścieżce dostarczania światła.</li>
		<li>Zmierz natężenie światła LED w tylnej płaszczyźnie ogniskowej i na wyjściu każdego obiektywu za pomocą miernika mocy, wybierając odpowiednią długość fali 470 nm.</li>
		<li>Oblicz natężenie światła w mW/mm2 i utwórz krzywą kalibracyjną (natężenie LED (%) w funkcji strumienia świetlnego (mW/mm2)) dla każdego celu dla wartości mierzonych dla długości fali 470 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać wycinek ciała migdałowatego z komory interfejsu i umieścić w komorze na wycinek zamontowany na mikroskopie pionowym wyposażonym w lampę fluorescencyjną. Należy zwrócić uwagę, aby ustawić plasterek w taki sposób, aby powierzchnia warstwy skierowana do góry w komorze interfejsu była również skierowana do góry w komorze nagrywania. Perfuse slice ze świeżym, natlenionym ASCF w ilości 1 - 2 ml/min w temperaturze ~31 °C.</li>
	<li>Obserwuj włókna presynaptyczne w wycinku za pomocą lampy fluorescencyjnej w połączeniu z odpowiednimi zestawami filtrów dla określonego białka fluorescencyjnego eksprymowanego. Użyj obiektywu 5x, aby uzyskać przegląd (rysunek 1E) i obiektywu 60x, aby ocenić gęstość włókien w obszarze docelowym. 
	Uwaga: W przypadku GFP i YFP należy użyć zestawu filtrów "zielony" (wzbudzenie 472/20, rozdzielacz wiązki 495, emisja 490 LP) w przypadku mCherry użyj zestawu filtrów "czerwony" (wzbudzenie 560/40, rozdzielacz wiązki 585, emisja 630/70) zgodnie z tabelą materiałów/wyposażenia.</li>
	<li>Otwórz lub ogranicz aperturę w ścieżce światła mikroskopu zgodnie z potrzebami eksperymentu (rysunek 2D).</li>
	<li>Aby uzyskać zapis plastra, należy napełnić pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i zamontować w uchwycie elektrody. Zastosować nadciśnienie do pipety z plastrem i powoli zanurzyć ją najpierw w roztworze do kąpieli, a następnie, pod kontrolą wzrokową, do plastra za pomocą mikromanipulatora.
	<ol>
		<li>Zbliż się do interesującego neuronu za pomocą pipety z plastrem z boku i od góry. Uwolnij nadciśnienie, gdy pipeta znajdzie się na powierzchni celi (wgłębienie widoczne na powierzchni komórki) i uzyskaj "gigaseal" poprzez zastosowanie podciśnienia.</li>
		<li>Zastosuj dalsze ssanie, aby rozerwać łatkę błony, aby uzyskać zapis całej komórki. Następnie stymuluj znakowane włókna za pomocą podłączonej diody LED za pomocą odpowiedniej długości fali do aktywacji ChR (470 nm), jednocześnie rejestrując odpowiedzi elektryczne z komórki.</li>
		<li>W przypadku stymulacji synaptycznej zacznij od niskiej intensywności diody LED i zwiększaj, aż do osiągnięcia pożądanej amplitudy prądu synaptycznego. Uruchom diodę LED, konfigurując wyjścia cyfrowe w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby kontrolować czas i długość impulsu (przykłady na rysunku 3). 
		Uwaga: inne oprogramowanie i/lub urządzenia generujące TTL mogą być używane do wyzwalania diody LED.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć stymulację z otwartym lub ograniczonym otworem (krok 3.4) w ścieżce świetlnej mikroskopu, zgodnie z życzeniem dla następnej zarejestrowanej komórki i/lub w obecności określonych leków.</li>
	<li>Po nagraniu utrwal plastry do analizy post-hoc, umieszczając je między dwiema bibułami filtracyjnymi i zanurzając je w 4% PFA O/N.</li>
	<li>Analizuj dane elektrofizjologiczne. 
	Uwaga: Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby wyświetlić zarejestrowane dane przemiatania dla każdej pojedynczej stymulacji w trybie offline. Analizując efekty leków, należy stosować procedury wykrywania pików, aby uzyskać przebieg czasowy wpływu leku na amplitudy prądu synaptycznego dla wszystkich indywidualnych przemiatania. Określ, kiedy działanie leku osiąga stan ustalony. Aby przygotować reprezentatywne średnie odpowiedzi dla rycin, użyj oprogramowania do uśrednienia ≥10 indywidualnych przebiegów na warunki eksperymentalne (por. Rysunek 3B-D, F-H, J prawy panel). 
	Uwaga: do analizy danych można wykorzystać kilka alternatywnych pakietów oprogramowania.</li>
</ol>
4. Analiza post-hoc miejsc iniekcji
<ol>
	<li>Umyć plastry miejsc wstrzyknięcia (od kroku 2.12) i miejsc zapisu (jeśli pożądane jest ponowne obrazowanie, od kroku 3.7) trzy razy w PBS. Odbywa się to poprzez wielokrotne zastępowanie roztworu świeżym PBS na obracającej się wytrząsarce trzy razy przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotuj 2% roztwór agaru w PBS i pozwól mu ostygnąć do ~65 °C. Ułóż plastry płasko na dnie małej szalki Petriego o średnicy 30 mm, zanurz plastry w agarze agarowym i pozwól mu ostygnąć do zestalenia.</li>
	<li>Przyklej blok agarowy z osadzonym plastrem lub plastrami do stopnia wibratomu i umieść stolik w komorze tnącej z PBS.</li>
	<li>Resekcja osadzonych plastrów do grubości 70 μm. Opcjonalnie: Po resekcji plastry można wybarwić, tj. Neurotrace w celu ujawnienia cytoarchitektury (ryc. 3A, C) i/lub barwieniem immunofluorescencyjnym dla YFP lub mCherry w celu wzmocnienia sygnału z białka fuzyjnego ChR.</li>
	<li>Zamontuj plastry na szkiełkach podstawowych i szkiełku nakrywkowym za pomocą nośnika montażowego. Miejsca iniekcji obrazu, a w razie potrzeby również wycinki obrazu zawierające włókna w obszarach projekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego laserowo-skaningowego mikroskopu (ryc. 2A-C).</li>
</ol>

<ol><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li>
<li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li>
<li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li>
<li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices%2C+ventral+hippocampus%2C+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li>
<li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li>
<li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li>
<li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala%3A+implications+for+fear+and+emotional+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64(2014).</li>
<li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li>
<li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin%2C+parvalbumin%2C+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li>
<li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li>
<li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li>
<li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8%2C+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li>
<li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li>
<li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+channelrhodopsin-2+%28ChR2%29+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje metodę badań optogenetycznych ex vivo obwodów neuronowych i lokalnej łączności, którą można łatwo zaimplementować w większości, jeśli nie we wszystkich, zestawach nagrywania z pionowym patch-clampem, wyposażając je w diodę LED ~470 nm w porcie światła epifluorescencyjnego. Główną zaletą optogenetycznej stymulacji wypustek aksonalnych w warstwach jest to, że pozwala ona na specyficzną aktywację i badanie właściwości połączeń, które nie były dostępne przy konwencjonalnej stymulacji elektryczne...

Precyzyjne narzędzia do wizualizacji i jednoczesnej aktywacji specyficznych połączeń między obszarami mózgu i określonymi typami neuronów stają się coraz ważniejsze w zrozumieniu funkcjonalnych połączeń leżących u podstaw zdrowych funkcji mózgu i stanów chorobowych. W idealnej sytuacji pociąga to za sobą fizjologiczne badanie precyzyjnych właściwości synaptycznych, z którymi komunikują się zidentyfikowane neurony. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku połączeń między obszarami mózgu, których nie można zachować w pojedynczym ostrym wycinku mózgu. W przeszłości udawało się to w dużej mierze osiągnąć w oddzielnych eksperymentach. Z jednej strony, znaczniki neuronalne wstrzyknięte in vivo zostały wykorzystane w połączeniu z późniejszą analizą pod mikroskopem świetlnym lub elektronowym partnerów pre- i postsynaptycznych. Z drugiej strony, gdy szlaki włókien z regionu pochodzenia są zachowane i dostępne w przygotowaniu plastrów, stymulacja elektryczna została wykorzystana do oceny mechanizmów komunikacji synaptycznej z komórkami w regionie docelowym.
Wraz z pojawieniem się optogenetyki, ukierunkowana ekspresja kanałów kationowych bramkowanych światłem, takich jak rodopsyny kanałowe (ChR) połączone z białkami fluorescencyjnymi, umożliwia teraz aktywację neuronów i ich trajektorii aksonalnych, umożliwiając jednocześnie ich wizualizację i analizę anatomiczną post-hoc 1-4. Ponieważ aksony wyrażające ChR mogą być stymulowane nawet po odcięciu od macierzystej somaty 5, możliwe jest: 1) ocena danych wejściowych z obszarów mózgu, które nie były dostępne przy konwencjonalnej stymulacji elektrycznej, ponieważ drogi włókien nie są rozdzielne lub konkretna trajektoria nie jest znana; 2) jednoznacznie wskazać region pochodzenia dla konkretnych danych wejściowych, które były postulowane, ale nie do końca zrozumiałe; oraz 3) zbadanie funkcjonalnej łączności między zdefiniowanymi typami komórek, zarówno lokalnie, jak i w projekcjach dalekiego zasięgu. Ze względu na szereg zalet, to optogenetyczne mapowanie obwodów w wycinkach mózgu stało się szeroko stosowane w ostatnich latach, a różne wektory wirusowe do ekspresji znakowanych fluorescencyjnie ChR są łatwo dostępne u dostawców komercyjnych. Niektóre kluczowe zalety aktywacji optogenetycznej w porównaniu z konwencjonalną stymulacją elektryczną to brak uszkodzeń tkanek spowodowanych umieszczeniem elektrod stymulacyjnych, specyfika stymulacji włókien, ponieważ stymulacja elektryczna może również rekrutować włókna pasujące lub inne pobliskie komórki, oraz równie szybka i czasowo precyzyjna stymulacja. Ponadto stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych może być łatwo ukierunkowane na określone obszary mózgu 6, a ekspresję warunkową lub specyficzną dla typu komórki można osiągnąć za pomocą ekspresji zależnej od Cre i/lub specyficznych promotorów 7. W tym przypadku technika ta jest stosowana do mapowania obwodów dalekiego zasięgu i lokalnych w systemie strachu.
Ciało migdałowate jest kluczowym regionem do nabywania i wyrażania strachu oraz przechowywania strachu i wspomnień emocjonalnych 8,9. Oprócz ciała migdałowatego, przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) i hipokamp (HC), struktury, które są wzajemnie połączone z ciałem migdałowatym, są zaangażowane w aspekty nabywania, utrwalania i odzyskiwania wspomnień strachu i wygaszania 10,11. Aktywność w pododdziałach mPFC wydaje się odgrywać podwójną rolę w kontrolowaniu zarówno wysokich, jak i niskich stanów lęku 12,13. Częściowo może to być pośredniczone przez bezpośrednie połączenia między mPFC a ciałem migdałowatym, które kontrolowałoby aktywność i wyjście ciała migdałowatego. Dlatego w ostatnich latach rozpoczęto kilka badań w eksperymentach ex vivo z warstwami w celu zbadania interakcji synaptycznych między aferentami mPFC a specyficznymi komórkami docelowymi w ciele migdałowatym 14-17.
Podczas uczenia się strachu, informacje sensoryczne o bodźcach uwarunkowanych i nieuwarunkowanych docierają do ciała migdałowatego poprzez projekcje z określonych obszarów wzgórza i kory mózgowej. Plastyczność tych sygnałów wejściowych do neuronów w bocznej części (LA) ciała migdałowatego podstawno-bocznego (BLA) jest ważnym mechanizmem leżącym u podstaw warunkowania strachu 9,18. Coraz więcej dowodów sugeruje, że równoległe procesy plastyczne w ciele migdałowatym obejmują elementy hamujące w celu kontrolowania pamięci strachu. Grupą skupionych neuronów hamujących są GABA-ergiczne przyśrodkowe komórki interkalowane przytorebkowe (mpITC), ale ich dokładna łączność i funkcja nie jest w pełni poznana 20-22. W tym przypadku mapowanie obwodów optogenetycznych wykorzystuje się do oceny łączności aferentnej i eferentnej tych komórek oraz ich wpływu na neurony docelowe w ciele migdałowatym, wykazując, że mpITC otrzymują bezpośrednie bodźce sensoryczne ze stacji przekaźnikowych wzgórza i kory mózgowej 23. Specyficzna ekspresja ChR w neuronach mpITC lub BLA umożliwia mapowanie lokalnych interakcji, ujawniając, że mpITC hamują, ale są również wzajemnie aktywowane przez główne neurony BLA, umieszczając je w nowych obwodach hamujących sprzężenie zwrotne i sprzężenie zwrotne, które skutecznie kontrolują aktywność BLA 23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaktyczna ramka</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>może być zastąpiona przez inną ramkę stereotaktyczną dla myszy</td></tr><tr><td>Adapter myszy Steretoxic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>może zostać zastąpiony przez inny ramka stereotaktyczna dla</td></tr><tr><td>myszy Maska do znieczulenia gazowego dla myszy</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>już niedostępna, zastąpiona przez numer artykułu. 51609M</td></tr><tr><td>Urządzenie do wtrysku ciśnieniowego, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>Można stosować T25-2-900</td><td>inne urządzenia do wtrysku ciśnieniowego (np. Picospritzer)</td></tr><tr><td>Kapilary szklane Kwik Fill</td><td>World Precision Instruments, Niemcy</td> Aparat anestezjologiczny <td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Niemcy</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC i poduszka grzewcza</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy ściągacz do mikropipet Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator narzędzi chirurgicznych, Sterylizator 75</td><td>Melag, Niemcy</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotyp 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotyp 2/9)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, Stany Zjednoczone</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotyp 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Niemcy</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran znieczulający, Isofuran CP (1 ml / ml)</td> <td>CP Pharma, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antyseptyczny, Betadine (prowidon-jod)</td> <td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>można zastąpić innym środkiem dezynfekującym</td></tr><tr><td>Przeciwbólowy, Metacam Solution (5 mg / ml meloksykamu)</td> <td>Boehringer Ingelheim, Niemcy</td><td></td><td>można zastąpić innymi środkami przeciwbólowymi</td></tr><tr><td>Maść do oczu Bepanthen</td><td>Bayer, Niemcy</td><td>0191</td><td>można zastąpić inną maścią do oczu</td></tr><tr><td>Wiertło NM3000 (SNKG1341 i SNIH1681)</td><td>Nouvag, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Igła do szwów</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Pleciony jedwabny szew</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Nagrania, stymulacja światłem i analiza</td></tr><tr><td>sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)</td><td>dla składu zobacz referencje #16 i #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwory plastrów wewnętrznych</td><td>dla kompozycji patrz referencje #16 i #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu heptahydrat</td><td>Roth, Niemcy</td><td>P027.1</td><td>przygotuj 2M roztwór podstawowy w oczyszczonym </td></tr><tr><td>krajalnica do wody, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Niemcy</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka chłodząca do krajalnicy do tkanek, CU65</td><td>Fisher Scientific, Niemcy</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Szafirowe ostrze</td><td>Noże</td><td></td> diamentowe Delaware na <td>zamówienie, zapytaj o firmę</td></tr><tr><td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Świetlówka Xcite (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Kanada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop krosowy, BX51WI</td><td>Olympus, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowy Multiclamp 700B&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie PClamp, wersja 10</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td></td><td>używane do sterowania akwizycją danych i stymulacją</td></tr><tr><td>Regulator temperatury kąpieli, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Niemcy</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator trzyosiowy Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Niemcy</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik mikromanipulatora SM7</td><td>Luigs & Neumann, Niemcy</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>szklane kapilary do pipet krosowych</td><td>World Precision Instruments, Niemcy</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z azotanu celulozy do komory interfejsu&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Niemcy</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED lub USL 70/470 i odpowiednie adaptery to dwa alternatywne opcje stymulacji LED</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED lub USL 70/470 oraz odpowiednie adaptery to dwa alternatywne opcje dla modułu LED do stymulacji LED</td></tr><tr><td>, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelektroniczny</td><td>L70-000</td><td>CoolLED lub USL 70/470 i odpowiednie adaptery to dwie alternatywne opcje do stymulacji LED</td></tr><tr><td>Adapter dwuportowy</td><td>Rapp Optoelektroniczny</td><td>zapytaj w firmie</td><td>CoolLED lub USL 70/470 i odpowiednie adaptery to dwie alternatywne opcje do stymulacji LED</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów czerwony (wzbudzenie)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F49-560</td><td>Filtry można kupić w zestawie F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (rozdzielacz wiązki)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F48-585</td><td>Filtry można kupić w zestawie F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisja)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F47-630</td><td>Filtry można kupić w zestawie F46-008</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów zielony (wzbudzenie)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F39-472</td><td>Alternatywy: zestaw filtrów F36-149 lub F46-002 (z emisją pasmowo-przepustową)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (rozdzielacz wiązki)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F43-495W</td><td>Alternatywy: zestaw filtrów F36-149 lub F46-002 (z emisją pasma przepustowego)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emisja)</td><td>AHF, Niemcy</td><td>F76-490</td><td>Alternatywy: zestaw filtrów F36-149 lub F46-002 (z emisją pasma przepustowego)</td></tr><tr><td>LaserCheck, ręczny miernik mocy</td><td>Coherent, USA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, wersja 6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>do analizy danych elektrofizjologicznych, można również zastosować inne alternatywne pakiety oprogramowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Neuromatyczny pakiet makr dla IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>do analizy danych elektrofizjologicznych, można również zastosować inne alternatywne pakiety oprogramowania&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Analiza post hoc wstrzyknięć i projekcji</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde w proszku (PFA)</td><td>Roth, Niemcy</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 niebieska fluorescencyjna barwnik Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar do zatapiania i resekcji</td><td>Roth, Niemcy</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 30 x 10 mm do zatapiania</td><td>SPL Life Można</td><td>zastosować alternatywy</td><td></td> naukowe</tr><tr><td>Slajdy, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Niemcy</td><td>61303802</td><td>alternatywy można zastosować</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe</td><td>R. Langenbrinck, Niemcy</td><td>Można zastosować 3000302</td><td>alternatywy</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Vecta</td><td>Shield Vector Laboratories, USA</td> Można <td>zastosować alternatywne media montażowe</td><td>H-1000</td></tr> filtr <tr><td>azotanu celulozy do spłaszczania plastry do utrwalania</td><td>Satorius Stedim Biotech, Niemcy</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM 710</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Podejścia optogenetyczne są obecnie szeroko stosowane do badania funkcji populacji i obwodów neuronalnych poprzez połączenie ukierunkowanej ekspresji białek aktywowanych światłem i późniejszej manipulacji aktywnością neuronalną przez światło. Rodopsyny kanałowe (ChR) są kanałami kationowymi bramkowanymi światłem, a po połączeniu z białkiem fluorescencyjnym ich ekspresja pozwala na wizualizację i jednoczesną aktywację określonych typów komórek i ich projekcji aksonalnych w określonych obszarach mózgu. Poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie wektorów wirusowych, białka fuzyjne ChR mogą być konstytutywnie lub warunkowo wyrażane w określonych komórkach określonego regionu mózgu, a ich projekcje aksonalne mogą być następnie badane anatomicznie i funkcjonalnie poprzez aktywację optogenetyczną ex vivo w wycinkach mózgu. Ma to szczególne znaczenie w dążeniu do zrozumienia właściwości synaptycznych połączeń, których nie można było rozwiązać za pomocą konwencjonalnych podejść do stymulacji elektrycznej, lub w identyfikacji nowych połączeń aferentnych i odprowadzających, które wcześniej były słabo poznane. Oto kilka przykładów ilustrujących, w jaki sposób ta technika może być zastosowana do zbadania tych pytań w celu wyjaśnienia obwodów związanych ze strachem w ciele migdałowatym. Ciało migdałowate jest kluczowym regionem do nabywania i wyrażania strachu oraz przechowywania strachu i wspomnień emocjonalnych. Wiele dowodów sugeruje, że przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) uczestniczy w różnych aspektach nabywania i wygaszania strachu, ale jej dokładne połączenie z ciałem migdałowatym dopiero zaczyna być rozumiane. Po pierwsze, pokazano, w jaki sposób aktywacja optogenetyczna ex vivo może być wykorzystana do badania aspektów komunikacji synaptycznej między aferentami mPFC a komórkami docelowymi w ciele migdałowatym podstawno-bocznym (BLA). Ponadto zilustrowano, w jaki sposób to optogenetyczne podejście ex vivo można zastosować do oceny nowych wzorców połączeń, na przykładzie grupy neuronów GABA-ergicznych w ciele migdałowatym, klastrze komórek interkalowanych przytorebkowych (mpITC).

Ta sekcja przedstawia schemat postępowania w podejściu optogenetycznym ex vivo oraz reprezentatywne wyniki różnych strategii eksperymentalnych służących do zbadania właściwości fizjologicznych sensorycznych i modulacyjnych projekcji długodystansowych do neuronów BLA i mpITC, a także właściwości lokalnej łączności między mpITC a BLA.
Po stereotaktycznym wstrzyknięciu wybranego wektora wirusowego w odpowiednie współrzędne...

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie właściwości funkcjonalnych i synaptycznych projekcji neuronalnych oraz mikroobwodów z wykorzystaniem optogenetyki ex-vivo. Obejmuje to ekspresję channel rhodopsin oraz jej aktywację w konkretnych projekcjach w połączeniu z rejestracją techniką patch-clamp. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące właściwości synaptycznych połączeń lokalnych i długodystansowych w obrębie oraz pomiędzy obszarami mózgu.Zostało to tutaj zilustrowane podczas badania obwodów neuronalnych odpowiadających za zachowania lękowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie obwodów i synaps, których nie można analizować za pomocą konwencjonalnych technik stymulacji elektrycznej. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą musiały zmierzyć się z wyzwaniem polegającym na optymalnym przeprowadzeniu wszystkich wymaganych etapów.Obejmuje to stereotaktyczne celowanie wstrzyknięć wirusowych, określenie optymalnego czasu ekspresji kanałorodopsyny, przygotowanie wysokiej jakości skrawków mózgu oraz stabilną aktywację światłem i rejestrację sygnałów. Przed rozpoczęciem tej części procedury, za pomocą operacji st

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film pokazuje generowanie pochylonych wycinków ciała migdałowatego z mózgu myszy. Mózg jest umieszczony pod kątem na etapie próbki wibratomowej, aby uzyskać wycinki zawierające ciało migdałowate i aksony z przyśrodkowej kory przedczołowej, które tworzą połączenia synaptyczne z ciałem migdałowatym. Wycinki mózgu są utrzymywane w temperaturze fizjologicznej, aby zachować tkankę do dalszych eksperymentów.

Generowanie pochylonych wycinków ciała migdałowatego z mózgu myszy

Ten film pokazuje przygotowanie cienkich wycinków koronalnych mózgu z mysiego mózgu, odsłaniając obszary ciała migdałowatego bogate w połączenia synaptyczne z przyśrodkowej kory przedczołowej. Wycinki są następnie odzyskiwane w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w celu utrzymania żywotności neuronów.

Generowanie koronalnego wycinka mózgu odsłaniającego obszary ciała migdałowatego z mózgu myszy

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Paradygmat strachu obserwacyjnego ocenia zastępcze zamrożenie u gryzoni jako model empatii afektywnej. Procedura ta polega na wystawieniu gryzoni-obserwatorów na działanie demonstrantów tego samego gatunku, którzy otrzymują awersyjne wstrząsy stopami w celu wywołania empatycznych reakcji zamrożenia. Stosując obserwacyjne testy strachu, naukowcy mogą zbadać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw empatii afektywnej.

Strach obserwacyjny jako model empatii afektywnej u myszy

Poznaj analizę obwodów strachu metodą optogenetyki ex vivo przy użyciu channelrhodopsyny i patch-clamp. Technika ta pozwala badać właściwości synaptyczne połączeń lokalnych i dalekiego zasięgu w układzie nerwowym.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów