Name: Trójwymiarowa hodowla kulek alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli w kulkach alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki. Technika umożliwia badanie biologii nowotworowej i ekspresji markerów inwazyjności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu O. Riosowi za jego pomoc techniczną.

To badanie zostało zatwierdzone do wykorzystania materiału ludzkiego przez lokalne komisje etyczne Zakładu Medycznego oraz Centrum Badań i Zaawansowanych Studiów Narodowego Instytutu Politechnicznego.
1. Pobieranie próbek guza
<ol>
	<li>Uzyskaj biopsję tkanki gruczolaka przysadki od pacjenta za pomocą przezklinowego zabiegu chirurgicznego14.</li>
	<li>Pobrać próbkę gruczolaka przysadki mózgowej i umieścić ją w sterylnej szklanej butelce zawierającej 50 ml świeżej pożywki hodowlanej 199 (M199) wzbogaconej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,6 mg/ml wodorowęglanu sodu, 2,4 mg/ml HEPES i 1% antybiotyków (penicylina/streptomycyna) o pH 7,4. Przechowywać próbkę w szklanej butelce na lodzie. 
	Uwaga: Tkanka nowotworowa może być przetwarzana kilka godzin po operacji.</li>
	<li>Przenieś próbkę guza do laboratorium w szklanej butelce na lodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie enzymatycznych roztworów dysocjacji tkanek, roztworu inhibitora trypsyny i roztworów alginianu
Uwaga: Przed procedurą hodowli komórkowej przygotuj następujące roztwory. Przed użyciem przefiltrować wszystkie roztwory za pomocą filtra membranowego 0,22 μm.
<ol>
	<li>Przygotować 1% roztwór kolagenazy, rozpuszczając 5 mg kolagenazy (typ I) w 5 ml surowicy M199 bez surowicy.</li>
	<li>Przygotować 0,01% roztwór trypsyny, rozpuszczając 0,01 g trypsyny w 10 ml PBS-EDTA 0,3%.</li>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór inhibitora trypsyny, rozpuszczając 2 mg inhibitora trypsyny sojowej w 20 ml surowicy M199 bez surowicy.</li>
	<li>Przygotować roztwór DNAzy, rozpuszczając 20 μl DNAzy I 134 j./ml w 4 ml roztworu inhibitora trypsyny.</li>
	<li>Przygotować roztwór EGTA (1,2 M), rozpuszczając 22,8 mg EGTA w 40 ml 155 mM NaCl. Dostosować pH do 7,4. Kontynuować do końcowej objętości 50 ml.</li>
	<li>Przygotować roztwór HEPES (20 mM), rozpuszczając 238 mg HEPES w 50 ml 155 mM NaCl.</li>
	<li>Przygotować 1,2% roztwór alginianu, rozpuszczając 1,2 g alginianu sodu w 100 ml roztworu HEPES. Roztwór alginianu należy przelać w autoklawie.</li>
	<li>Przygotować roztwór wapnia (102 mM) rozpuszczając 750 mg CaCl2 w 50 ml roztworu HEPES, dostosować pH do 7,4</li>
</ol>
3. Pierwotna hodowla komórkowa i enkapsulacja alginianów
<ol>
	<li>Wewnątrz komory z przepływem laminarnym umieść tkankę nowotworową na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej około 20 ml PBS Ca2+ i Mg2+ wolnych od pH 7,4 (PBS *).</li>
	<li>Weź tkankę za pomocą pęsety chirurgicznej i umieść ją na innej szalce Petriego zawierającej świeży PBS*, delikatnie umyj chusteczkę. Powtarzaj ten krok, aż czerwone krwinki i zanieczyszczenia zostaną usunięte.</li>
	<li>Za pomocą pęsety chirurgicznej przytrzymaj tkankę gruczolaka przysadki i małymi nożyczkami chirurgicznymi pokrój ją na małe kawałki. Za pomocą pipety Pasteura z zaokrąglonymi krawędziami przenieść fragmenty tkanki i PBS* do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 68 x g przez 10 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Aby zaokrąglić krawędzie pipety Pasteura, lekko podpal końcówkę pipety w palniku Bunsena.</li>
	<li>Usunąć PBS* za pomocą pipety Pasteura i dodać 3-5 ml roztworu kolagenazy (około 5 ml na 65mm3 tkanki), wymieszać dwa do trzech razy przez odwrócenie. Inkubować tkankę w kolagenazie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w stałej rotacji.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 68 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć kolagenazę za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Dodać 5 ml DNAzy i wymieszać dwa do trzech razy przez odwrócenie, a następnie odwirować probówkę o sile 68 x g przez 10 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Jeśli tkanka nie jest całkowicie zdysocjowana, należy przeprowadzić drugie trawienie enzymatyczne z trypsyną przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać trawienie przez dodanie 2 objętości roztworu inhibitora trypsyny.</li>
	<li>Odessać supernatant pipetą Pasteura i wyrzucić. Ponownie zawiesić osad w 1 objętości roztworu EGTA i wymieszać z 2 objętościami roztworu alginianu.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i alginian, pipetując pipetą Pasteura. Wziąć sterylną strzykawkę z igłą 21 G, usunąć tłok; Za pomocą pipety napełnić strzykawkę roztworem alginianu i komórek.</li>
	<li>Delikatnie włożyć tłok do strzykawki i ostrożnie dozować roztwór komórek alginianowych kropla po kropli do szklanej zlewki zawierającej około 30 ml roztworu bogatego w wapń.</li>
	<li>Umieścić igłę strzykawki w odległości około 5 cm od roztworu CaCl2. Zawiesina komórek alginianowych żeluje w kontakcie z CaCl2, tworząc kuliste kulki. Przechowuj kulki alginianowe w roztworze wapnia przez 5 min. 
	Uwaga: Wymieszaj szklaną zlewkę, do której wrzuca się koraliki. Przesuwaj go powoli ręką okrężnymi ruchami, aby nie sklejały się ze sobą.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć roztwór wapnia pipetą Pasteura i dwukrotnie przemyć kulki 3-5 ml M199 wzbogaconego o 20 % FBS.</li>
	<li>Przenieść kulki alginianowe do zwykłej kolby do hodowli tkankowej T25 za pomocą sterylnej szpatułki, dodać 4-5 ml M199 wzbogaconego 20% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co trzeci dzień.</li>
</ol>
4. Uwolnij komórki od alginianu
Uwaga: Przed uwolnieniem komórek z kulek alginianowych, pokryj szkiełka nakrywkowe o średnicy 13 mm poli-D-lizyną.
UWAGA: KWAS SIARKOWY JEST WYSOCE KWASEM, A APTS MOŻE POWODOWAĆ PODRAŻNIENIA OCZU I SKÓRY. DO OBCHODZENIA SIĘ Z TYMI ODCZYNNIKAMI NALEŻY UŻYWAĆ RĘKAWIC LATEKSOWYCH.
<ol>
	<li>W dygestorium za pomocą punktowej pęsety zanurzyć szkiełka nakrywkowe w szklanej szalce Petriego zawierającej 20% wodnego roztworu kwasu siarkowego na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować kwas siarkowy i przemyć szkiełka nakrywkowe pięciokrotnie wodą destylowaną przez 5 minut każde. Za pomocą pęsety punktowej umieść czyste szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego zawierającej 0,1 M NaOH na 5 minut w temperaturze RT15.</li>
	<li>Zdekantować NaOH i przemyć go raz wodą destylowaną, odessać wodę i wysuszyć szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety pokryć szkiełka nakrywkowe APTS (aminopropylotrietoksysilanem) przez 4 minuty (użyć 500 μl na 6 szkiełek nakrywkowych), zalać szalkę Petriego wodą destylowaną. Szybko zassaj wodę i kontynuuj mycie wodą destylowaną, przesuwając szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety punktowej, aby woda mogła przeniknąć pod spodem.</li>
	<li>Zasysaj wodę i wysusz szkiełka nakrywkowe, za pomocą pęsety punktowej umieść szkiełka nakrywkowe na czystej szalce Petriego i sterylizuj je w kuchence mikrofalowej przez 3 razy po 45 sekund. Dodać 1 000 μl sterylnej wody do 100 μg poli-D-lizyny (0,1 mg/ml).</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe z około 50 μl poli-D-lizyny przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Całkowicie odessać poli-D-lizynę. 
	Uwaga: Jest to ważne, ponieważ rozpuszczalna poli-D-lizyna w pożywce hodowlanej może hamować proliferację komórek.</li>
	<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe pięć razy sterylną wodą przez 5 minut każde. Zassać sterylną wodę i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w komorze z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Aby przeanalizować cytoszkielet aktynowy, uwolnij komórki przysadki mózgowej od alginianu. Pobrać część kulek alginianowych z kolby hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml i umieścić je w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 5 ml 55 mM cytrynianu sodu (rozpuścić 323,6 mg Na3C6H5O7, 2 H2O w 20 ml roztworu HEPES) i odwirować przy 68 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i wyrzucić.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml ciepłego M199 wzbogaconego o 20% FSB; delikatnie wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety Pasteura. 
	UWAGA: FALLOIDYNA I DAPI SĄ TOKSYCZNE. DO OBCHODZENIA SIĘ Z TYMI ODCZYNNIKAMI NALEŻY UŻYWAĆ RĘKAWICZEK.</li>
	<li>Aby policzyć komórki, przenieś 125 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 75 μl M199 i 50 μl zawiesiny komórek otrzymanej w ostatnim etapie (współczynnik rozcieńczenia = 5). Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Za pomocą końcówki mikropipety umieścić około 10 μl zawiesiny niebieskich krwinek Trypana w komorze hemocytometru.</li>
	<li>Policz komórki w liczniku hemocytometru za pomocą odwróconego mikroskopu z oświetleniem z kontrastem fazowym. Policz wszystkie komórki w środkowym kwadracie o średnicy 1 mm i czterech kwadratach narożnych o średnicy 1 mm. Uzyskaj gęstość komórek na mililitr, mnożąc średnią liczbę na kwadrat przez współczynnik rozcieńczenia - 104. Na przykład, jeśli średnia liczba komórek na kwadracie wynosi 45 komórek x 5 x 104 = 2,25 x 106 komórek/ml. 
	Uwaga: Policz komórki w dziesięciu kwadratach komory hemocytometru. Nie licz komórek dotykających środkowej linii na dole i po prawej stronie.</li>
	<li>Wysiewaj 35 000 komórek na szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm pokrytych poli-D-lizyną.</li>
</ol>
5. Układ cytoszkieletu aktynowego
<ol>
	<li>Po 48 godzinach w hodowli usunąć pożywkę hodowlaną pipetą Pasteura i szybko dodać 500 μl na szkiełko nakrywkowe PBS, natychmiast usunąć PBS.</li>
	<li>Utrwalić i przepuścić komórki za pomocą 500 μl na szkiełko nakrywkowe buforu utrwalającego (0,1 M RURY, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0,5 % Triton X-100 i 2% formaldehydu) przez 10 minut w temperaturze 37 °C</li>
	<li>Usunąć bufor utrwalający i dodać 500 μl na szkiełko nakrywkowe 3,5% paraformaldehydu w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór paraformaldehydu.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy, dodając 500 μl na szkiełko nakrywkowe PBS przez 5 minut każde. Szkiełka nakrywkowe należy płukać w temperaturze pokojowej, w ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Inkubować komórki z 50 mM chlorkiem amonu przez 10 minut, odsysać roztwór chlorku amonu i powtarzać krok 5.4.</li>
	<li>Inkubować komórki z 1% BSA (bez IgG, bez proteaz) w PBS przez 30 minut, usunąć roztwór BSA i powtórzyć krok 5.4.</li>
	<li>Inkubować komórki z 50 μM falloidyny sprzężonej z rodaminą przez 7 minut w temperaturze pokojowej, powtórzyć krok 5.4.</li>
	<li>Inkubować komórki z 255 μM DAPI rozcieńczonym w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, powtórzyć krok 5.4. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą środka montażowego i uszczelnij je lakierem do paznokci.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy układów cytoszkieletu aktyny za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem 63X, przy długości fali wzbudzenia 541 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li>
<li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+T+%22Carbohydrate+chemistry%22">Carbohydrate chemistry</a>. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).</li>
<li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li>
<li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+C.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li>
<li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+release+from+alginate+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li>
<li>Tashjian, A. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li>
<li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Folia.+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li>
<li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li>
<li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li>
<li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li>
<li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li>
<li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+neurosurg%22%5BJournal%5D)">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li>
<li>Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAplin%2C+J+%22Measuring+cell+adhesion%22">Measuring cell adhesion</a>. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).</li>
<li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In.+Vitro.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li>
<li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół składa się z kilku krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest jednorodność wielkości kulek, która jest wymagana do utrzymania tych samych warunków dyfuzji składników odżywczych i gazów we wszystkich kulturach komórkowych. Z naszego doświadczenia wynika, że użycie igły 21 G do wytwarzania kulek alginianowych pozwala na uzyskanie wydajnej kultury o jednolitym rozmiarze kulek. Drugim ważnym czynnikiem jest odległość od igły; Odległość ta nie może być większa niż 5 cm od roztworu wapnia, aby uniknąć zdeformowania...

Trójwymiarowe rusztowania są szeroko stosowane w hodowli komórek, ponieważ zapewniają trójwymiarowe wsparcie strukturalne dla hodowanych komórek i utrzymują komunikację między komórkami1. Materiały polimerowe pochodzenia naturalnego zostały wykorzystane do produkcji trójwymiarowych rusztowań, w tym kolagenu typu I, chitozanu i alginianu. Alginian to naturalny polimer pozyskiwany z brunatnych alg morskich Macrocystispyrifera (Kelp). Polimer ten składa się z powtarzających się jednostek kwasu β-D-mannuronowego (M) i kwasu α-L-guluronowego (G)2 i tworzy stabilne żele w obecności niektórych kationów dwuwartościowych, takich jak wapń i bar. Roztwory chlorku wapnia (CaCl2) są powszechnie stosowane jako odczynnik sieciujący do tworzenia kulek alginianowych. Roztwory alginianu wrzucone do CaCl2 natychmiast tworzą trójwymiarowe kuliste żele. Gdy roztwór alginianu miesza się z komórkami, komórki są zamykane w kulkach alginianowych3.
Alginate ma właściwości, które umożliwiły mu wykorzystanie go jako matrycy do enkapsulacji różnych komórek, w tym chondrocytów4, mioblastów szkieletowych5 i nerwowych komórek macierzystych6. Jest to materiał obojętny i umożliwia dyfuzję składników odżywczych, tlenu i produktów przemiany materii, które utrzymują przeżycie i funkcję komórek; Co więcej, w przeciwieństwie do innych systemów hodowli na bazie żelu, komórki hodowane w kulkach alginianowych mogą być również uwalniane z rusztowania za pomocą chelatorów wapnia, takich jak cytrynian sodu, a następnie komórki mogą być zbierane do dalszych badań7.
Gruczolaki przysadki są zazwyczaj łagodnymi nowotworami o niskim tempie proliferacji. Linie komórkowe gruczolaka przysadki u szczurów zostały z powodzeniem wyhodowane w systemie dwuwymiarowym8. Jednak ta hodowla wydzielniczych ludzkich guzów komórek przysadki mózgowej nie jest wydajnym rozwojem; Rozproszone komórki przysadki nowotworowej słabo rosną w hodowli, komórki wykazują ograniczone przyczepianie i rozprzestrzenianie się, a komórki zazwyczaj tworzą pływające agregaty w naczyniu hodowlanym9,10.
Podjęto kilka prób uzyskania zawieszenia komórek przysadki nowotworowej, w tym metodą dyspersji enzymatycznej i mechanicznej11, metodą dyspersji wyłącznie mechanicznej12 oraz hodowlą eksplantatów guza10. Dzięki tym podejściom różni autorzy uzyskali żywotne kultury przylegające do różnych okresów czasu. Zdolność komórek wydzielniczych guza do przetrwania w tych dwuwymiarowych systemach zależy od typu guza i tempa ich proliferacji9. Jednak w hodowlach długoterminowych przeważają komórki o fenotypach fibroblastów11,13. W artykule opisano metodę uzyskiwania pierwotnej hodowli z komórek gruczolaka przysadki otoczonych kulkami alginianu, która dodatkowo uwalnia je od rusztowania alginianowego, co umożliwia szczegółową analizę aspektów ich biologii komórki, np. ich układów cytoszkieletu.

<table><tbody><tr><td><silny>odczynnik&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 pożywka hodowlana&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31100-027</td><td>Dla kultury, ciepła w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&aostry;-2etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Research Organics</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sorbowej&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Kwas alginowy, z Macrocystis pyrifera (Kelp)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazyna-N,N&prime;-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Etylen kwas tetraoctowy glikolu (EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Surowica bydlęca Albumina IgG-Free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna&ndash; Izotiocyjanian tetrametylodaminy B</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toksyczny. Używaj rękawiczek do obsługi tego odczynnika&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toksyczny. Używaj rękawiczek do obsługi tego odczynnika&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>Silnie. Używaj rękawiczek do obsługi tego odczynnika&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Może powodować podrażnienie oczu i skóry. Używaj rękawiczek do obsługi tego odczynnika&nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa&nbsp; &nbsp; </silny></td><td><silny>firma&nbsp; </td><td>Numer katalogowy&nbsp; </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td>Toksyczny: Może powodować raka. Używaj rękawiczek do obsługi tego odczynnika&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator&nbsp;</td><td>Wirówka Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DuPont Corporation&nbsp;</td><td>Model shakera sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumenty laboratoryjne</td><td>Model 314-820&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa hodowla kulek alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Opisano metodę hodowli trójwymiarowej, w której pierwotne komórki gruczolaka przysadki są hodowane w kulkach alginianowych. Alginian to polimer pozyskiwany z brązowych alg morskich. Krótko mówiąc, tkanka nowotworowa jest cięta na małe kawałki i poddawana trawieniu enzymatycznemu z kolagenazą i trypsyną. Następnie uzyskuje się zawiesinę komórkową. Zawiesinę komórek nowotworowych miesza się z 1,2% alginianem sodu i wrzuca do roztworu CaCl2, a zawiesinę alginian/komórkę żeluje się w kontakcie z CaCl2 w celu utworzenia kulistych kulek. Komórki osadzone w kulkach alginianowych są zaopatrywane w składniki odżywcze dostarczane przez pożywkę hodowlaną wzbogaconą o 20% FBS. Trójwymiarowa hodowla w kulkach alginianowych utrzymuje żywotność komórek gruczolaka przez długi czas, do czterech miesięcy. Co więcej, komórki mogą zostać uwolnione z alginianu poprzez przemycie kulek cytrynianem sodu i wysianie na szklanych szkiełkach nakrywkowych w celu dalszych analiz immunocytochemicznych. Zastosowanie modelu hodowli komórkowej pozwala na utrwalenie i wizualizację cytoszkieletu aktynowego przy minimalnej dezorganizacji. Podsumowując, kulki alginianowe zapewniają niezawodny system hodowli do utrzymania komórek gruczolaka przysadki.

Niniejszy protokół został z sukcesem zastosowany w hodowli i utrzymaniu komórek gruczolaków przysadki w kuleczkach alginianowych przez różne okresy czasu. Rysunek 1 przedstawia komórki zatopione w kuleczkach alginianowych po trzech miesiącach; komórki te wykazują dwójłomne, zaokrąglone kształty pod mikroskopem odwróconym (Rysunek 1). Rysunek 2 pokazuje lokalizację N-kadheryny w komórkach gruczolaka przysadki szczura zatopionych w alginian...

Trójwymiarowa hodowla w kulkach alginianowych, ze względu na swoją prostotę i powtarzalność, została wybrana do utrzymania komórek gruczolaka przysadki. Procedury obejmowały wstępne trawienie enzymatyczne i mechaniczną dysocjację tkanki nowotworowej, a następnie zawiesinę komórek zamknięto w kulkach alginianowych.

Trójwymiarowa hodowla kulek alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ogólnym celem opisanej metody jest przedstawienie trójwymiarowej hodowli w kuleczkach alginianowych do utrzymania komórek gruczolaków przysadki człowieka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórek nowotworowych, takie jak ekspresja różnych markerów inwazyjności. Główną zaletą tej techniki jest to, że rusztowanie alginianowe, w przeciwieństwie do innych systemów trójwymiarowych, umożliwia wydzielenie komórek gruczolaka przysadki z kuleczek alginianowych w celu dalszych badań.Procedurę zademonstruje Carmen Solano-Agama, asystentka badawcza z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, umieść wcześniej pobraną tkankę gruczolaka w szalce 35 mm zawierającej około 20 ml PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Za pomocą pęsety chirurgicznej przenieś tkankę do innej szalki Petriego zawierającej świeży PBS, aby ją wypłukać.Powtarzaj przenoszenie do świeżego buforu aż do usunięcia erytrocytów i zanieczyszczeń. Następnie, za pomocą pęsety chirurgicznej, przytrzymaj tkankę gruczolaka przysadki i za pomocą małych nożyczek chirurgicznych potnij tkankę na małe fragmenty. Następnie, używając pipety Pasteura z zaokrąglonymi krawędziami, przenieś fragmenty tkanki wraz z buforem do probówki o pojemności 15 ml.Wiruj z prędkością 68 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po wirowaniu usuń PBS za pomocą pipety Pasteura i dodaj od trzech do pięciu mililitrów roztworu kolagenazy. Wymieszaj dwa lub trzy razy, odwracając probówkę, a następnie inkubuj tkankę w kolagenazie w temperaturze 37 °C przy stałym obrocie przez 30 minut.Ponownie wiruj probówkę przez 10 minut, a następnie za pomocą pipety Pasteura usuń roztwór kolagenazy. Dodaj 5 mililitrów TNase i wymieszaj dwu- lub trzykrotnie poprzez odwracanie, po czym ponownie wiruj próbkę. Jeśli tkanka nie została całkowicie zdysocjowana, przeprowadź drugą dygestię enzymatyczną zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie odessać nadsącz i go usunąć. Potem użyć jednej objętości roztworu EGTA do resuspensji osadu i delikatnie wymieszać z dwiema objętościami roztworu alginianu. Wyjąć tłok ze sterylnej strzykawki z igłą o rozmiarze 21 G, a następnie za pomocą pipety nanieść mieszaninę alginianu i komórek do strzykawki.Ostrożnie wsuń tłok do strzykawki, a igłę strzykawki umieść w zlewce, w odległości około pięciu centymetrów od roztworu chlorku wapnia. Następnie ostrożnie dozuj zawiesinę komórek w alginianie kropla po kropli do zlewki. W kontakcie z roztworem zawiesina ulegnie żelowaniu, tworząc sferyczne kuleczki.Mieszając powoli kolistymi ruchami, delikatnie zamieszaj zawartość zlewki, aby zapobiec sklejaniu się kulek. Następnie pozostaw kulki alginianowe w roztworze chlorku wapnia na pięć minut. Po inkubacji ostrożnie usuń roztwór wapnia i użyj od trzech do pięciu mililitrów pożywki M199 wzbogaconej o 20% FBS, aby dwukrotnie wypłukać kulki.Za pomocą sterylnej szpatułki przenieś kuleczki alginianowe do zwykłej kolby hodowlanej T25 i dodaj od 4 do 5 ml pożywki M199 z FBS. Inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla w inkubatorze z nawilżaczem. Następnie przygotuj szkiełka podstawowe pokryte poli-D-lizyną, zgodnie z protokołem tekstowym.Aby przeanalizować cytoszkielet aktynowy, za pomocą pipety przenieś 1 ml kulek alginianowych z kolby hodowlanej do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml 55 mM cytrynianu sodu i wiruj z prędkością 68 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odessaj nadsącz i go wylej.Używając jednego mililitra ciepłego medium M199 wzbogaconego o 20% FBS, resuspendujemy pellet i delikatnie mieszamy zawiesinę komórkową. Następnie, po policzeniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, wysiewamy 35 000 komórek na szklane lamelle o średnicy 13 milimetrów pokryte poli-D-lizyną. Po inkubacji komórek przez 48 godzin usuwamy pożywkę i raz przemywamy komórki PBS.Następnie, aby utrwalić i permeabilizować komórki, dodaj 500 µL buforu do fiksacji na każde szkiełko podstawowe i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Usuń bufor do fiksacji i dodaj 500 µL 3,5% paraformaldehydu w PBS na każde szkiełko podstawowe. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym usuń roztwór.Na koniec, po przemyciu komórek i inkubacji w roztworze falloidyny sprzężonej z rodamyną oraz DAPI, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego z obiektywem 63x i długością fali wzbudzenia 541 nm, aby uzyskać obrazy cytoszkieletu aktynowego. Rysunek ten przedstawia komórki gruczolaka przysadki osadzone w kuleczkach alginianowych po trzech miesiącach. Jak pokazano tutaj, w świetle odwróconego mikroskopu optycznego komórki wykazują dwójłomne, zaokrąglone kształty.Na tej rycinie przedstawiono lokalizację N-kadheryny w komórkach gruczolaków przysadki szczura zatopionych w alginianie. N-kadheryna lokalizuje się w miejscach kontaktów międzykomórkowych, a w jądrze widoczna jest rozproszona chromatyna. W tym eksperymencie wskaźnik proliferacji uzyskano z 10 niefunkcjonalnych ludzkich gruczolaków przysadki, wykorzystując reaktywność immunologiczną dla Ki67, uzyskując średni wskaźnik znakowania wynoszący 19,2 ± 1,5%.W tym przypadku cytoszkielet aktynowy komórek nieinwazyjnych wykazywał wydłużone kształty z niewielkimi stresowymi włóknami aktynowymi. Większe zróżnicowanie ułożeń filamentów aktynowych i struktur przypominających liście zależało od rodzaju gruczolaka przysadki, niezależnie od systemu hodowli. Na przykład w niefunkcjonalnym gruczolaku inwazyjnym dominującym kształtem tych komórek był kształt zaokrąglony, z nieciągłymi pierścieniami kortykalnymi filamentów aktynowych.Po opanowaniu techniki, główna hodowla gruczolaków przysadki może zostać przeprowadzona w ciągu trzech godzin. Enkapsulacja w alginianie może zająć 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu igły w odległości nie większej niż pięć centymetrów od roztworu wapnia, aby uniknąć powstawania twardych kulek i obumierania komórek w wyniku zderzenia strumienia roztworu komórek w alginianie z powierzchnią roztworu wapnia.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak utrwalenie fragmentów alginianu, a następnie odwodnienie za pomocą glikolu polietylenowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób komórki gruczolaków przysadki organizują swój cytoszkielet w tym trójwymiarowym rusztowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak utrzymywać komórki gruczolaków przysadki w trójwymiarowej hodowli w kuleczkach alginianowych.

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Ten film demonstruje technikę tworzenia trójwymiarowej hodowli komórek glejowych. Komórki glejowe pochodzące z mózgu szczura są zamknięte w fotosieciowalnej matrycy polimerowej zawierającej składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Po inkubacji w pożywce wzrostowej komórki glejowe namnażają się w macierzy nośnej, tworząc trójwymiarową kulturę.

Stworzenie trójwymiarowej hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura

Ten film pokazuje, jak glejaki, pochodzące z guzów mózgu, są rozdzielane na pojedyncze komórki i zamykane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego. Proces ten sprzyja interakcjom komórka-komórka, tworząc ustrukturyzowany, trójwymiarowy model glejaka.

Hydrożel na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego organizmu. W artykule opisano rozwój organoidów z przysadki myszy jako nowatorski model 3D in vitro do badania populacji komórek macierzystych gruczołu, których biologia i funkcja pozostają słabo poznane.

Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli w kulkach alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki. Technika umożliwia badanie biologii nowotworowej i ekspresji markerów inwazyjności.

Trójwymiarowa hodowla kulek alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki

Przeglądaj więcej filmów