Name: Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania heteroksylanów ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem spektrometrii mas i rezonansu magnetycznego. Technika łączy znakowanie końców redukcyjnych z hydrolizą enzymatyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt był wspierany przez fundusze z Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, przekazane Klastrowi Zboża o Wysokiej Zawartości Błonnika za pośrednictwem Food Futures Flagship. AB potwierdza również wsparcie w postaci grantu Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (ARC) dla Centrum Doskonałości ARC w zakresie Roślinnych Ścian Komórkowych (CE110001007).

1. Etykietowanie redukującej reszty cukrowej (RE) W-sol AXs z 2-aminobenzamidem (2AB)
<ol>
	<li>Inkubować AX W-sol z 2AB (0,2 M) w obecności 1 M NaBH3CN (cyjanoborowodorek sodu) (pH 5,5) przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w celu przekształcenia redukcyjnych końców łańcuchów szkieletowych polisacharydów w ich fluorescencyjne pochodne. 
	UWAGA: Następujący krok należy wykonać w dygestorium, ponieważ NaBH3CN uwalnia trujący cyjanek w kontakcie z wodą.
	<ol>
		<li>Odważyć NaBH3CN (62,8 mg) i rozpuścić w wodzie (1 ml) w probówce do mikrowirówek (1,5 ml) w celu przygotowania 1 M roztworu NaBH3CN. Rozpuścić odczynnik 2AB (27,2 mg) w 1 M roztworze NaBH3CN (1 ml) przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C i dostosować pH mieszaniny reakcyjnej (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) do pH 5,5 za pomocą 10% kwasu octowego.</li>
		<li>Dodać 200 μl mieszaniny reakcyjnej (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) do W-sol AXs (1 mg) w szklanej probówce z nakrętką i wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w dygestorium. Schłodzić zawiesinę do temperatury pokojowej i dodać 4 oblicze absolutnego etanolu.</li>
		<li>Umieścić zawiesinę w chłodni (4 °C) O/N w celu wytrącenia polisacharydów.</li>
		<li>Odwirować (1 500 x g, 10 min, RT) w celu usunięcia supernatantu. Dokładnie umyć granulat absolutnym etanolem (4x), acetonem (1x) i metanolem (1x), odwirowując między każdym praniem. Suszyć próżniowo w temperaturze 40 °C O/N. 
		Uwaga: Intensywne mycie usuwa również resztki 2AB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie ksylooligosacharydów z 2 AX znakowanych AB W-sol
<ol>
	<li>Rozpuścić AXs W-sol znakowane 2AB (1 mg) w 500 μl buforu octanu sodu (100 mM, pH 5) w probówce do mikrowirówek (1,5 ml). Dodać 4 jednostki endoksylanazy (GH 11, [M1]) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Zniszczyć aktywność enzymatyczną przez ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić zawiesinę do temperatury RT i przenieść do szklanej rurki z nakrętką. Dodać 4 objętości bezwzględnego alkoholu etylowego i umieścić zawiesinę w chłodni (4 °C) O/N w celu wytrącenia niestrawionych polisacharydów.</li>
	<li>Wirówka (1 500 x g, 10 min, RT) w celu oddzielenia niestrawionych polisacharydów (osadów) i ksylooligosacharydów wytworzonych przez endoksylanazę (supernatant). Zdekantować supernatant do czystej szklanej probówki i umieścić go w ciepłej łaźni wodnej (40 °C).</li>
	<li>Odparować etanol pod strumieniem azotu gazowego do objętości punktu końcowego (~500 μl). Zamrażać supernatant w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i suszyć zamrożony supernatant w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie ksylooligosacharydów z KOH-sol AXs i etykietowanie 2AB
<ol>
	<li>Potraktuj KOH-sol AXs endoksylanazą (GH 11, [M1]) w celu wytworzenia ksylooligosacharydów, jak opisano powyżej (sekcje 2.1-2.4).</li>
	<li>Traktować ksylooligosacharydy generowane przez endoksylanazę z KOH-sol AXs mieszaniną reakcyjną 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN), jak opisano powyżej (sekcje 1.1.1-1.1.2).</li>
	<li>Zdekantować supernatant do czystej szklanej probówki i umieścić go w ciepłej łaźni wodnej (40 °C). Odparować etanol pod strumieniem azotu gazowego do objętości punktu końcowego (~500 μl). Zamrażać supernatant w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i suszyć zamrożony supernatant w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.</li>
</ol>
4. MALDI-TOF-MS
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu MALDI-matrix
	<ol>
		<li>Dodać małą miarkę 2,5-dihydroxbenzoesowego kwasu (DHB) do 50% acetonitrylu (500 ml) zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego w probówce (roztwór MALDI-matrix). Wymieszaj za pomocą wiru, jeśli szybko się rozpuści, dodaj kolejną małą miarkę DHB. Uwaga: Idealne stężenie roztworu MALDI-matrix wynosi 10 μg/μl-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytki tarczowej MALDI
	<ol>
		<li>Wodne próbki oligosacharydów (rodzime) (5–10 μg) (W-sol i/lub KOH-sol) należy umieścić na płytce docelowej MALDI. Dodać 0,3 μl roztworu z matrycą MALDI, używając oddzielnej końcówki i mieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostaw mieszaninę do wyschnięcia w temperaturze RT. 
		Uwaga: Prawidłowo wysuszone próbki powinny składać się z długich kryształów w kształcie igieł skierowanych w stronę środka plamki. Jeżeli osad jest lepki i/lub rozmazany, próbka może być albo zbyt skoncentrowana, albo składać się z soli, jest mało prawdopodobne, aby takie osady dawały dobre widma, a próbkę należy dalej oczyszczać.</li>
		<li>Wprowadź tarczę celowniczą do źródła MS i pracuj w trybie jonów dodatnich (+ive). Ustaw napięcie akceleratora na 19,0 kV przy źródle jonów 1 i 16,3 kV przy źródle jonów 2. Dostosuj moc lasera na większą niż 70%. Wybierz miejsce próbki na tabliczce tarczy MALDI i kliknij start, aby rozpocząć strzały laserowe. 
		Uwaga: Nie wszystkie obszary celu będą generować sygnały. Określone miejsce da sygnał tylko dla kilku strzałów laserowych ze względu na wyczerpanie mieszaniny próbka/matryca lub charakterystykę kryształu.
		<ol>
			<li>Przesuń laser w różne obszary celu podczas akwizycji i uśrednij około 200 losowych widm, aby uzyskać zadowalający stosunek sygnału do szumu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ESI-QTOF-MS
<ol>
	<li>Analiza oligosacharydów generowanych przez endoksylanazę (natywnych) przy użyciu nano-HPLC sprzężonego z kwadrupolowym czasem przelotu (QTOF) MS z jonizacją elektrorozpylania (ESI) z separacją chromatograficzną online przy użyciu kolumny RP C-18 (75 μm x 150 mm; rozmiar kulki 3,5 μm).
	<ol>
		<li>Przenieść mieszaninę wodnych oligosacharydów wytwarzanych przez endoksylanazę do fiolki i umieścić w próbniku automatycznym HPLC. Zaprogramuj gradient elucji 5-80% z fazami ruchomymi, odpowiednio 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitrylu, przez 60 minut.</li>
		<li>Dostosuj natężenie przepływu do 0,2 μl/min. Dostosuj tryb jonów dodatnich w zakresie skanowania 300-1,600 m/z i szybkości skanowania 0,5 skanowania/sekundę, korzystając z warunków źródła ESI w następujący sposób: gaz kurtynowy 10, GS1 4, temperatura źródła 100 °C, napięcie rozpylania jonów 2 300 V i potencjał deklastrowania 50 V. Uruchom program chromatograficzny LC i eluuj oligosacharydy. Wynikowy chromatogram jonów całkowitych (TIC) jest automatycznie zapisywany przez oprogramowanie.</li>
		<li>Otwórz zapisany TIC i wybierz wyodrębnij chromatogram. Wpisz oczekiwane masy (np. 271, 403, 535, 667, 799 i 931 m/z) w wierszu polecenia. Zeskanuj chromatogram, klikając Enter. Przetwarzaj wybrane skany jonowe danych chromatogramu ESI-QTOF MS za pomocą oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. ESI-MSn
<ol>
	<li>Wprowadzić od 1 do 2 μl per-O-metylowanego oligosacharydu (metylowanego zgodnie z opisem Pettolino i wsp.1) Pobrać próbkę w 50% acetonitrylu do końcówki nanosprayu za pomocą strzykawki. Przytnij końcówkę nano-sprayu za pomocą noża do szkła, aby pasowała do dyskretnego uchwytu nano-sprayu dołączonego do MS.</li>
	<li>Ustaw masę zgodnie z oczekiwanym zakresem mas (200-1 500 m/z) i kurtynę gazową na 10, napięcie jonowe natrysku na 1 900 V i polaryzację na dodatnią.</li>
	<li>Naciśnij przycisk pozyskiwania, aby otworzyć odpowiednie okno, wprowadź nazwę pliku danych, aby uzyskać całkowity skan jonowy (ESI-MS1). Następnie naciśnij przycisk STOP.</li>
	<li>Zmień typ skanowania z jonów produktu na fragmentację piku zainteresowania. Wprowadź masę zainteresowania (np. 885 m/z), aby rozdrobnić i dostosować zakres mas (200-900 m/z). Naciśnij przycisk akwizycji i dostosuj energię zderzenia (w górę i/lub w dół w zakładce związku), aby osiągnąć całkowitą fragmentację jonu macierzystego (885 m/z) i uzyskać skan jonów fragmentacyjnych (ESI-MS2).</li>
	<li>Wprowadź masę interesującego nas jonu fragmentacyjnego (np. 711 m/z) i dostosuj zakres mas (200-720 m/z). Naciśnij przycisk namierzania i dostosuj energię zderzenia, aby osiągnąć całkowitą fragmentację jonu prekursorowego (711 m/z) i uzyskać skan jonów fragmentacyjnych (ESI-MS3).</li>
</ol>
7. Spektroskopia H1 NMR
<ol>
	<li>Rozpuść mieszaninę oligosacharydów wytworzonych przez endoksylanazę (KOH-sol, forma natywna) (~500 μg) w D2O (1,0 ml, 99,9%) w plastikowej probówce (15 ml). Zamrozić zawiesinę w temperaturze -80 °C przez 4 godziny i wysuszyć zamrożoną zawiesinę w liofilizatorze w celu odzyskania ksylooligosacharydów.</li>
	<li>Powtórzyć czynności 7.1 dwukrotnie, aby w pełni wymienićH2OnaD2O.</li>
	<li>Wysuszone oligosacharydy rozpuścić w D2O (0,6 ml, 99,9%) i dodać 0,5 μl acetonu (5% w D2O) jako wzorzec wewnętrzny. Przenieś zdeuterowane oligosacharydy do probówki z próbką NMR.</li>
	<li>Trzymaj probówkę NMR zawierającą próbkę za górę i włóż probówkę z próbką do plastikowego wirownika. Umieść kołpak w przykładowym mierniku głębokości. Popchnij lub pociągnij probówkę z próbką, aby wyregulować głębokość próbki, aby upewnić się, że linia środkowa górnych i dolnych mierników głębokości próbki jest równa.</li>
	<li>Wyjąć ogranicznik głębokości i włożyć próbkę do automatycznego próbnika podłączonego do spektrometru NMR 600 MHz wyposażonego w sondę kriogeniczną.</li>
	<li>Zaloguj się i otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem. Wprowadź nazwę przykładowego pliku. Otwórz istniejący zestaw danych, a następnie użyj polecenia "edc", aby zapisać go pod nową nazwą. Wpisz numer pozycji próbki w automatycznym próbniku i naciśnij "ENTER". 
	Uwaga: Naciśnięcie przycisku "ENTER" spowoduje delikatne upuszczenie probówki z próbką do otworu magnesu, gdzie zostanie umieszczona w górnej części sondy.</li>
	<li>Ustaw żądaną temperaturę próbki, wpisując "edte" w wierszu poleceń. Poczekaj, aż temperatura próbki osiągnie żądaną wartość, zanim przejdziesz do następnego kroku. Wpisz " lock" w wierszu poleceń i wybierz odpowiedni rozpuszczalnik (D2O). Poczekaj, aż u dołu okna pojawi się komunikat "blokada zakończona".</li>
	<li>Wpisz "atmm" w wierszu poleceń i kliknij "optymalizuj" u góry paska menu atmm. Wybierz start do strojenia i dopasowania sondy do wybranego kanału (w tym przypadku 1H).</li>
	<li>Wpisz "topshim" w wierszu polecenia dla procesu podkładkowania, w którym dokonuje się drobnych korekt pola magnetycznego, aż do uzyskania jednolitego pola magnetycznego wokół próbki. Uzyskaj sygnał, wpisując "zg" w wierszu poleceń i wprowadź.</li>
	<li>Analizować widma za pomocą oprogramowania15 zgodnie z instrukcjami producenta z przesunięciem chemicznym 1H odniesionym do wewnętrznego wzorca acetonu przy 2,225 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
<li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacic%2C+A+%22The+Biochemistry+of+Plants%2C+Vol.+14%2C+Carbohydrates%22">The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates</a>. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).</li>
<li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li>
<li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li>
<li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylan+Biosynthesis%3A+News+from+the+Grass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li>
<li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li>
<li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%281%E2%86%923%29-+and+%281%E2%86%924%29-linked+%CE%B2-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li>
<li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye%2C+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li>
<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
<li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li>
<li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li>
<li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiol%22%5BJournal%5D)">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+MassHunter+Workstation+Software+-+Quantitative+Analysis+Familiarization+Guide%22">Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide</a>. , Agilent Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf</a> (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Topspin+User+Manual%22">Topspin User Manual</a>. , Bruker. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf ">http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf </a> (2010).</li>
<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS%2FMS+spectra+of+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate.+J%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li>
<li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides%2C+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat%2C+that+contain+the+elements+----4%29%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----+or+----4%29%5Balpha-+L-Araf-%281----2%29%5D%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li>
<li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li>
<li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Większość polisacharydów ściany komórkowej w fazie macierzowej ma pozornie losowo podstawione szkielety (zarówno z resztami glikozylowymi, jak i nieglikozylowymi), które są bardzo zmienne w zależności od gatunku rośliny, etapu rozwoju i typutkanki 3. Ponieważ polisacharydy są wtórnymi produktami genów, ich sekwencja nie jest pochodząca z matrycy, a zatem nie ma jednego podejścia analitycznego, takiego jak w przypadku kwasów nukleinowych i białek, do ich sekwencjonowania. Dostępność oczyszczonych, specyficznych...

Heteroksylany to rodzina polisacharydów, które są dominującymi niecelulozowymi polisacharydami pierwotnych ścian traw i drugorzędowych ścian wszystkich roślin okrytozalążkowych3-6. Szkielety ksylanu różnią się rodzajami i wzorcami substytucji resztami glikozylu (kwas glukuronowy (GlcA), arabinoza (Araf)) i nieglikozylowo (O-acetyl, kwas ferulowy) w zależności od rodzaju tkanki, etapu rozwoju i gatunku7.
Ściany bielma pszenicy (Triticum aestivum L.) składają się głównie z arabinoksylanów (AXs) (70%) i (1→3)(1→4)-β-D-glukanów (20%) z niewielkimi ilościami celulozy i heteromannanów (po 2%)8. Szkielet ksylanu może być w różny sposób niepodstawiony i przeważnie monopodstawiony (głównie pozycja O-2 i w mniejszym stopniu pozycja O-3) oraz dwupodstawiony (pozycje O-2 i O-3) z resztami α-L-Araf 9. Koniec redukcyjny (RE) heteroksylanów z roślin dwuliściennych (na przykład Arabidopsis thaliana)10 i nagonasiennych (na przykład świerka (Picea abies))11 zawiera charakterystyczną sekwencję glikozylowo-tetrasacharydową; -β-D-Xylp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-GalpA-(1→4)-D-Xylp. Aby zrozumieć biosyntezę i funkcję heteroksylanu (biologiczną i przemysłową), ważne jest pełne zsekwencjonowanie szkieletu ksylanu, aby zrozumieć typy i wzorce substytucji, a także sekwencję końca redukującego (RE).
Specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki końca redukującego (RE) i sekwencji glikozylu w obszarze wewnętrznym heteroksylanów są opisane w tym manuskrypcie. Techniki te polegają na znakowaniu fluoroforem (za pomocą 2 aminobenzamidu (2AB)) końca redukującego (RE) łańcucha heteroksylanowego przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą). To podejście, szczególnie w przypadku sekwencjonowania RE, zostało po raz pierwszy opisane przez laboratoriumYork 10,12-13, ale obecnie zostało rozszerzone o sekwencjonowanie regionu wewnętrznego i jest kombinacją ustalonych technik, które można w równym stopniu dostosować do wszystkich heteroksylanów, niezależnie od ich źródła izolacji. Podejście to można również zastosować do innych klas polisacharydów przy użyciu (jeśli są dostępne) odpowiednich endohydrolaz.
W obecnym badaniu, odkrochmalone ściany komórkowe bielma pszenicy zostały wyizolowane jako nierozpuszczalna w alkoholu pozostałość (AIR) i sekwencyjnie ekstrahowane wodą (W-sol Fr) i 1M KOH zawierającym 1% NaBH4 (KOH-sol Fr), jak opisano w Ratnayake et al. (2014)2. Uwolnione oligosacharydy zarówno z W-, jak i KOH-sol Fr są następnie metylowane, a szczegółowa analiza strukturalna zarówno natywnych, jak i metylowanych oligosacharydów jest przeprowadzana przy użyciu kombinacji MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-sprzężonego z HPLC z rozdzielaniem chromatograficznym online przy użyciu kolumny RP C-18 i ESI-MSn. Trawienie endoksylanazy KOH-sol AXs charakteryzowało się również magnetycznym rezonansem jądrowym (NMR).

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamid (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>borowodorek sodu (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Niebezpieczne, należy obchodzić się z</td></tr><tr><td>cyjanoborowodorkiem sodu (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Niebezpieczne, należy obchodzić się z nim ostrożnie</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-ksylanaza M1 (z Trichoderma viride) (120101a)</td><td>Megazym (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Kolumna Zorbax eclipse plus&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>(2,1 razy; 100 mm; 1,8 &mikro; m rozmiar koralików)&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp; &nbsp; (Model - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp; &nbsp; (Model # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- pułapka jonowa&nbsp; (Model # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, Kalifornia).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (wersja 3.0)-Biospin- oprogramowanie&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Model # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do charakterystyki sekwencji glikozylu w regionie redukcyjnym (RE) i regionie wewnętrznym heteroksylanów. Odskrochmielone ściany komórkowe bielma pszenicy wyizolowano jako pozostałość nierozpuszczalną w alkoholu (AIR)1 i sekwencyjnie ekstrahowano wodą (W-sol Fr) i 1 M KOH zawierającym 1% NaBH4 (KOH-sol Fr), jak opisano przez Ratnayake i in. (2014)2. Przyjęto dwa różne podejścia (zob. podsumowanie na rys. 1). W pierwszym, nienaruszone AX W-sol są traktowane 2AB w celu znakowania oryginalnej reszty cukru w łańcuchu szkieletowym RE, a następnie traktowane endoksylanazą w celu wytworzenia mieszaniny RE znakowanego 2AB i oligosacharydów redukujących region wewnętrzny. W drugim podejściu KOH-sol Fr jest hydrolizowany endoksylanazą, aby najpierw wytworzyć mieszaninę oligosacharydów, które są następnie znakowane 2AB. Enzymatycznie uwolnione ((nie)znakowane) oligosacharydy zarówno z W, jak i KOH-sol Fr są następnie metylowane, a szczegółowa analiza strukturalna zarówno natywnych, jak i metylowanych oligosacharydów jest przeprowadzana przy użyciu kombinacji MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS i ESI-MSn. Trawiene endoksylanazą KOH-sol AX charakteryzują się również magnetycznym rezonansem jądrowym (NMR), który również dostarcza informacji o konfiguracji anomerycznej. Techniki te można zastosować do innych klas polisacharydów przy użyciu odpowiednich endohydrolaz.

Trawienie endoksylanazą AX-ów rozpuszczalnych w wodzie (W-sol) znakowanych 2AB generuje mieszaninę oligosacharydów RE znakowanych 2AB oraz szereg oligosacharydów nieznakowanych (bez znacznika 2AB) pochodzących z wewnętrznych regionów łańcucha ksylanu (Rysunek 1; na podstawie pracy Ratnayake et al.2). Następnie stosuje się szereg metod chromatograficznych w celu frakcjonowania złożonej mieszaniny izomerów. W końcowym etapie wykorzystuje się techniki MS ...

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Ogólnym celem jest charakterystyka sekwencji glikozalnych końca redukującego oraz regionów wewnętrznych heteroksylanów poprzez znakowanie oryginalnego cukru z końca redukującego rozpuszczalnych w wodzie heravenaksylanów i poddanie ich działaniu endoksylanazy w celu wytworzenia mieszaniny oznakowanych oligosacharydów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie glikomiki, takie jak zmiany w strukturze subtelnej oligosacharydów lub polisacharydów w odpowiedzi na zaplanowany rozwój wzrostu, a także stresory abiotyczne i biotyczne. Główną zaletą tej metody jest opis zintegrowanego podejścia do sekwencjonowania sekwencji końca redukującego, jak i sekwencji regionów wewnętrznych dowolnego glikanu lub polisacharydu.Przygotować jedno molarne roztwór cyjanoborowodorku sodu w jednym mililitrze wody. Następnie rozpuścić 27,2 mg odczynnika 2AB w roztworze cyjanoborowodorku sodu, podgrzewając do 65 °C i dostosowując pH mieszaniny reakcyjnej do pH 5,5 za pomocą 10% kwasu octowego. Dodać 200 µL mieszaniny reakcyjnej do jednego miligrama rozpuszczalnych w wodzie arabinoksylanów w zakręcanej probówce szklanej i wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex.Inkubować próbkę przez dwi

sequencing-plant-wall-heteroxylans-using-enzymic-chemical-methylation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Obecny protokół opisuje procedury używane do badania i charakteryzowania enzymów związanych ze ścianą komórkową, głównie β-1,3-glukanazy i peroksydazy, w roślinach pszenicy. Ich poziom aktywności wzrasta podczas interakcji pszenica - RWA i bierze udział w odpowiedzi obronnej roślin poprzez wzmocnienie ścian komórkowych, co zniechęca mszyce do żerowania.

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Poznaj metodę sekwencjonowania heteroksylanów ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem spektrometrii mas i rezonansu magnetycznego. Technika łączy znakowanie końców redukcyjnych z hydrolizą enzymatyczną.

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy) (Wideo) | JoVE Journal

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Przeglądaj więcej filmów