Name: Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę oceny swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro w mieszanych kulturach komórek nowotworowych i fibroblastów. Technika ta umożliwia rozdzielenie odpowiedzi komórek nowotworowych od nienowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pani Alster, Pan Honrath i Dr Jiang są doceniani za wyjątkową pomoc techniczną. Doceniany jest również dr Volz i grupa badawcza dr Dandri za zapewnienie dostępu do ich cyfrowego urządzenia do PCR.

1. Przygotowanie kultury mieszanej zawierającej zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe
<ol>
	<li>Użyj komórek nowotworowych z ustalonej linii komórkowej MPNST S4625. Używaj fibroblastów jako komórek nienowotworowych6,7</li>
	<li>Hodowla zarówno komórek nowotworowych, jak i fibroblastów w standardowym pożywce DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (BSA), 3 mM glutaminą, 0,1 mM 2-merkaptoetanolem, 500 U/ml penicyliny, 500 g/ml streptomycyny i 1 mM pirogronianu sodu w temperaturze 37 °C i 5% CO25-7. Podczas konfluencji poniżej zbiegu zbierz komórki z 0,05% trypsyny i policz je za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wymieszaj 400 komórek nowotworowych i 1600 komórek nienowotworowych razem w każdym dołku 96-dołkowej płytki hodowlanej w 0,2 ml pożywki. Biorąc pod uwagę szybszy wzrost komórek nowotworowych w okresie leczenia wynoszącym 5 dni, początkowy odsetek komórek nowotworowych ustalono na 25%. Ustawić 4 powtórzenia dla każdego stężenia leku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5%CO2 O/N.</li>
</ol>
2. Leczenie farmakologiczne
<ol>
	<li>Stosować nilotynib jako lek testowy. Przygotować roztwory podstawowe 0, 2, 4 i 20 mM nilotynibu w DMSO. Rozcieńczyć każdy z nich 200-krotnie w 5 ml pożywki DMEM, podając 2-krotnie skoncentrowane roztwory leków o stężeniu 0, 10, 20 i 100 μM6,7.</li>
	<li>Usunąć 0,1 ml pożywki z każdej studzienki i dodać 0,1 ml pożywki zawierającej lek. Końcowe stężenia wynoszą 0, 5, 10 i 50 μM. Kontynuować inkubację komórek w pożywce zawierającej lek przez 5 dni.</li>
	<li>Pod koniec zabiegu należy obejrzeć przyczepione komórki za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i zrobić zdjęcia. Odessać pożywkę, przemyć ocalałe komórki adhezyjne raz 0,2 ml PBS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie DNA do Digital PCR
<ol>
	<li>Lizuj komórki za pomocą HotShot8.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl alkalicznego roztworu do lizy (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) do każdej studzienki. Uszczelnij studzienki folią. Inkubować płytkę w temperaturze 95 °C w suszarce lub na płycie grzewczej przez 30 minut. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że na powierzchni studzienek nie pozostały już żadne nienaruszone komórki. W przypadku, gdy komórki nie uległy całkowitej lizie, wydłuż czas podgrzewania lub dodaj detergent. Jednokrotne zamrożenie ich w temperaturze -20 °C również zwiększa pękanie komórek.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu neutralizującego (40 mM Tris-HC, pH 4,0) do każdego dołka. Przenieść wszystkie lizaty do studzienek w kształcie litery U na płytce PCR i suszyć w cyklerze do PCR w temperaturze 95 °C przez 10 do 30 minut. Rozpuść lizaty w 20 μl wody destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie za pomocą dializy kroplowej9
	<ol>
		<li>Stosować filtry membranowe o średniej wielkości porów 0,025 μm.</li>
		<li>Umieść filtr na wodzie destylowanej błyszczącą stroną do góry w studzienkach z 12-dołkową płytą. Zwilż filtr na 5 minut. Zwróć uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza między filtrem a wodą.</li>
		<li>Ostrożnie odpipetować odtworzone lizaty z każdej próbki z kroku 3.1.4 na każdy z 4 obszarów filtra. Przykryj płytkę i dializuj przez 30 do 60 minut.</li>
		<li>Zassaj wodę spod filtra, nie przewracając filtra ani nie naruszając kropli.</li>
		<li>Przenieś krople lizatu do studzienek nowej płytki PCR. Wysuszyć krople DNA, ogrzewając je w temperaturze 95 °C przez 10 do 30 minut w cyklerze PCR. Rozpuść lizaty w 10 μl wody.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cyfrowy PCR
<ol>
	<li>Zamrożone składniki, takie jak DNA, bufor i mieszanina testowa, rozmrozić w temperaturze pokojowej, odwirować przez 10 sekund z maksymalną siłą dowolnej dostępnej wirówki (na przykład miniwirówki VWR), a następnie utrzymać je na lodzie.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem DNA (tabela 1). Weź pod uwagę objętość martwą i oblicz mieszaninę główną o około 10% większą niż wymagana ilość. 
	UWAGA: Użyj podkładów i sond używanych w zestawie komercyjnym.</li>
	<li>Wprowadzić mieszaninę wzorcową do wirowania, odwirowywać przez 10 sekund z maksymalną siłą dowolnej dostępnej wirówki (na przykład miniwirówki firmy VWR) i dozować 15 μl do każdego dołka na płytce 96-PCR. Dodać cały lizat (który zawiera DNA) z każdej próbki do studzienek zawierających mieszaninę główną. Przenieść 20 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do studzienki po stronie próbki wkładu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dozować 70 μl oleju z generatora kropelek do każdej studzienki po stronie olejowej wkładu. Zamknij wkład uszczelką i umieść całe ustawienie w generatorze kropel. Rozpocznij generowanie kropel.</li>
	<li>Przenieść 40 μl kropelki roztworu do dołków 96-dołkowej płytki PCR. Uszczelnij płytkę folią i umieść ją w cyklerze do PCR. Ustaw temperaturę pokrywy na 105 °C, a szybkość narastania na 2 °C/sek. Przeprowadzić PCR, korzystając z ustawień podanych w Tabeli 2. Po przeprowadzeniu PCR przenieść płytkę do czytnika kropelek i rozpocząć odczyt. Alternatywnie płytkę można przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin.</li>
</ol>
5. Obliczanie proporcji komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Załaduj cyfrowe dane PCR i wykonaj automatyczną analizę.</li>
	<li>Kontroluj wyniki każdego testu ręcznie, sprawdzając jednowymiarowy i dwuwymiarowy rozkład dodatnich i ujemnych kropel i upewnij się, że są one dobrze oddzielone, a linie progowe znajdują się we właściwych pozycjach. Wyklucz z dalszej analizy wyniki niespełniające kryteriów, na przykład brak wyraźnego oddzielenia kropel dodatnich i ujemnych. Skopiuj wynikowy współczynnik NF1/RPP30 do arkusza Excela.</li>
	<li>Oblicz proporcję komórek nowotworowych jako: 2 x (1- NF1/RPP30).</li>
</ol>
6. Zależna od dawki zmiana proporcji komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Dla każdego stężenia leku należy obliczyć średnią i odchylenie standardowe od 4 kontrprób. Wykreślić średnie i odchylenia standardowe w stosunku do stężeń leków.</li>
</ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li>
<li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li>
<li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li>
<li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography-Methods%22%5BJournal%5D)">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li>
<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

Procedura jest chroniona patentem (10 2013 221 452, Niemcy)

Kluczowym krokiem w tym genetycznym i komórkowym narzędziu do oceny swoistości leku in vitro jest określenie proporcji komórek nowotworowych przy użyciu jednej lub więcej cech genetycznych specyficznych dla nowotworu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych cech fenotypowych7, cechy genetyczne są specyficzne, stabilne i łatwe do ilościowego określenia. Na przykład mutacja specyficzna dla nowotworu lub zmiana liczby kopii jest obecna wyłącznie w komórkach nowotworowych, ale nie w komórkach nienowotworowych. Takie piętno genetyczne można wiarygodnie i precyzyjnie określić ilościowo, na przykład za pomocą cyfrowego PCR, jak wykazano w tym badaniu.
W przypadku cyfrowego PCR wysoka czystość DNA nie jest niezbędna. Konieczne jest jednak odsalanie i usuwanie cząsteczek hamujących, co można osiągnąć za pomocą dializy kroplowej przy użyciu odpowiedniego filtra. Połączenie lizy i dializy kropelkowej jest proste i szybkie, nie wymaga specjalnych narzędzi i dlatego można je przeprowadzić w każdym standardowym laboratorium. Jeśli komórki nie pękają prawidłowo, można rozważyć dodatkowe leczenie, takie jak zamrożenie komórek w temperaturze -20 °C, dodanie detergentu i/lub użycie proteazy.
W niniejszym badaniu heterozygotyczną delecję genu NF1 wykorzystano jako cechę specyficzną dla nowotworu do oceny ilościowej. Podobnie można również wykorzystać delecje innych genów lub loci. Co więcej, mutacje mogą być również wykorzystywane do ilościowego określania komórek nowotworowych. W takim przypadku cyfrowe testy PCR dla zmutowanych i normalnych alleli muszą zostać szeroko zwalidowane, aby zapewnić ich swoistość dla każdego z nich.
Zależna od dawki proporcja komórek nowotworowych stanowi wskazanie do specyficzności lub selektywności leku. Co więcej, umożliwia również ekstrakcję odpowiedzi komórek nowotworowych z odpowiedzi wszystkich komórek mieszanej kultury na lek (ryc. 4). Ta strategia ekstrakcji stanowi rozwiązanie problemu technicznego związanego z wykorzystaniem kultur pierwotnych (które zawierają zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe) do testowania leków.
Genetyczne i komórkowe narzędzie in vitro zademonstrowane w niniejszym badaniu może zatem mieć potencjał aplikacyjny (1) w odkrywaniu leków, gdzie stanowi platformę do oceny swoistości lub selektywności leków in vitro oraz (2) w spersonalizowanej opiece onkologicznej, gdzie umożliwia testowanie leków w hodowlach pierwotnych, a w konsekwencji może przyczynić się do selekcji leków w chemioterapii uzupełniającej4. Co więcej, za pomocą tego narzędzia można badać mechanizm farmakologiczny leku, ponieważ podczas leczenia farmakologicznego można zaobserwować pewne zmiany genetyczne lub wielokrotne zmiany genetyczne.
Trudnością w stosowaniu zindywidualizowanych kultur pierwotnych jest brak uniwersalnej cechy genetycznej do ilościowego oznaczania komórek nowotworowych. Jednak przy dzisiejszym postępie w sekwencjonowaniu całego genomu, najczęściej zmieniane geny i regiony są znane z powszechnych nowotworów. Na przykład wśród nowotworów głowy i szyi 71%, 23% i 22% ma mutacje w genach TP53, FAT1 i CDKN2A , a 60%, 34% i 26% ma delecje w regionach genów CDKN2A, STK11 i PTEN, odpowiednio10. Badanie przesiewowe od 5 do 10 takich genów i/lub regionów za pomocą sekwencjonowania celowanego i/lub cyfrowego PCR prawdopodobnie zidentyfikuje zatem jedną lub więcej zmian genetycznych, które można wykorzystać do ilościowego określenia komórek nowotworowych w uzyskanej hodowli pierwotnej. Innym ograniczeniem jest często niewystarczająca liczba wyciętych guzów do założenia pierwotnych kultur.
Pomimo korzystnych cech i obiecującego potencjału aplikacyjnego narzędzia do badań in vitro opartego na genach i komórkach, należy pamiętać o jego ograniczeniach i podkreślać jego charakter in vitro . Na przykład zróżnicowane działanie lub cytotoksyczność leku na komórki nowotworowe może wynikać raczej z różnic w typach komórek (fibroblasty vs. komórki Schwanna) lub ich różnego pochodzenia (od różnych osób). Silniejszy wpływ leku na komórki nowotworowe niż na komórki nienowotworowe można również wytłumaczyć faktem, że te pierwsze rosną szybciej niż te drugie. Co najważniejsze, zachowanie komórek in vitro różni się od zachowania komórek w ludzkim ciele, a co za tym idzie, wyniki oceny in vitro często nie odzwierciedlają rzeczywistej sytuacji klinicznej lub odzwierciedlają ją tylko częściowo. W związku z tym skuteczność, cytotoksyczność i swoistość leków uzyskanych dla hodowanych komórek mają raczej charakter biomarkerów, ale nie mają takiej wiarygodności, jak przedklinicznie mierzona skuteczność antybiotyków. Niemniej jednak przejście od linii komórkowych do kultur mieszanych i/lub kultur pierwotnych jest krokiem naprzód w ocenie działania leku i swoistości/selektywności in vitro. Dzięki szeroko zakrojonym wysiłkom możliwe jest znalezienie warunków in vitro , które umożliwiają rozsądną korelację danych z in vitro z rzeczywistymi reakcjami pacjentów, przynajmniej w przypadku niektórych leków.

Terapeutyczne efekty leków przeciwnowotworowych na komórki nowotworowe są związane z różnymi niepożądanymi efektami toksycznymi na komórkach nienowotworowych. Skutki toksyczne są trudne do oceny w laboratorium, głównie ze względu na brak odpowiednich narzędzi1. Hodowle komórkowe zawierające zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe stanowiłyby potencjalne źródło in vitro do oceny swoistości lub selektywności leku, co może rzucić światło na toksyczność kliniczną. Jednak konwencjonalne testy in vitro, takie jak testy proliferacji lub żywotności, mierzą wpływ leku na wszystkie komórki, ale nie mogą podzielić wpływu na część na komórki nowotworowe i część na komórki nienowotworowe. Na przykład 50% zmniejszenie całkowitej liczby komórek w kulturze składającej się z 50% komórek nowotworowych i 50% komórek nienowotworowych może oznaczać śmierć wszystkich komórek nowotworowych, śmierć wszystkich komórek nienowotworowych lub, co bardziej prawdopodobne, śmierć części obu w różnych proporcjach. 
Również z powodu tego problemu technicznego, pierwotne hodowle, które zawierają komórki zrębu guza i nienowotworowe, często nie nadają się do testowania leków. Z drugiej strony, ze względu na tę heterogeniczność komórkową, kultury pierwotne znacznie bardziej przypominają swoje pierwotne guzy niż komórki klonalne w ustalonych liniach komórkowych2. Co ważniejsze, posiewy pierwotne są specyficzne dla pacjenta i mogą umożliwiać zindywidualizowane testy narkotykowe2-4.
Zasadniczą kwestią jest zatem opracowanie metody określania proporcji komórek nowotworowych w mieszanych kulturach, w tym w kulturach pierwotnych. W odpowiedzi na to wyzwanie opracowano rozwiązanie genetyczne, które opiera się na określeniu ilościowego stosunku cechy genetycznej specyficznej dla nowotworu do uniwersalnej sekwencji referencyjnej. Na podstawie tego stosunku można obliczyć proporcję komórek nowotworowych w mieszanej kulturze. 
To badanie ilustruje procedurę genetycznego i komórkowego narzędzia do oceny specyficzności leków przeciwnowotworowych, w tym (1) przygotowanie mieszanej kultury z komórek nowotworowych o ustalonej linii i nienowotworowych fibroblastów, (2) traktowanie mieszanej kultury testowym lekiem, (3) przygotowanie DNA do cyfrowego PCR, (4) określanie stosunku heterozygotycznej delecji specyficznej dla nowotworu do sekwencji referencyjnej za pomocą cyfrowego testu PCR z podwójną sondą, (5) obliczanie proporcji komórek nowotworowych przy każdym stężeniu leku oraz (6) obliczanie zależnej od dawki zmiany proporcji komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>Filtr membranowy o średnicy 25 mm</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>Do testu ddPCR do dializy kroplowej</td></tr> dla <tr><td>NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td> Test ddPCR <td>znakowany FAM</td></tr><tr><td>dla RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td> QX200 <td>z oznaczeniem HEX</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>W badaniu wykorzystano poprzednią wersję QX, która nie jest już dostępna. Zamiennikiem jest QX200</td></tr><tr><td>Olej kropelkowy</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kartridżowy</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Folia przebijana</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Przedstawiono procedurę oceny specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe. Kluczowym elementem jest ilościowe określenie specyficznej dla nowotworu zmiany genetycznej w stosunku do sekwencji uniwersalnej za pomocą cyfrowego testu PCR z dwiema sondami, a następnie obliczenie proporcji komórek nowotworowych. Test przeprowadza się na hodowli zawierającej komórki nowotworowe ustalonej linii i wzbogacone komórki nienowotworowe. Mieszaną kulturę traktuje się testowym lekiem w różnych stężeniach. Po zabiegu DNA jest przygotowywane bezpośrednio z ocalałych komórek adhezyjnych w studzienkach z 96-dołkowymi płytkami przy użyciu prostej i niedrogiej metody i poddawane cyfrowemu testowi PCR z podwójną sondą w celu pomiaru specyficznej dla nowotworu zmiany genetycznej i uniwersalnej sekwencji referencyjnej. W niniejszej demonstracji heterozygotyczna delecja genu NF1 jest wykorzystywana jako specyficzna dla nowotworu zmiana genetyczna i gen RPP30 jako gen odniesienia. Za pomocą stosunku NF1/RPP30 obliczono proporcję komórek nowotworowych. Ponieważ zależna od dawki zmiana proporcji komórek nowotworowych stanowi wskazanie in vitro do specyficzności leku, ten genetyczny i komórkowy test in vitro prawdopodobnie będzie miał potencjał zastosowania w odkrywaniu leków. Ponadto, w przypadku spersonalizowanej opieki onkologicznej, to genetyczne i komórkowe narzędzie może przyczynić się do optymalizacji chemioterapii uzupełniającej poprzez testowanie skuteczności i swoistości potencjalnych leków przy użyciu pierwotnych kultur poszczególnych nowotworów.

Jakość DNA przygotowanego przy użyciu połączonej metody HotShot/Drop-Dialysis jest wystarczająca do satysfakcjonującego przeprowadzenia cyfrowej PCR (Rysunek 1B). Dla 2 000 fibroblastów uzyskano około 3 000 ± 500 kropli pozytywnych, co odpowiada 75% z oczekiwanych 4 000 kopii (dwie kopie w jednej komórce). W niniejszym badaniu komórki nowotworowe pochodziły z ustalonej linii MPNST S462, o której wiadomo, że posiada heterozygotyczną delecję genu NF15. To 50-procentowe zmniejszenie dawki genu zostało wyraźnie wykryte za pomocą podwójnego testu cyfrowej PCR (Rysunek 1B). W przeciwieństwie do tego, w fibroblastach zmierzono dwie kopie tego genu. Ta różnica genetyczna między komórkami nowotworowymi a nienowotworowymi umożliwia obliczenie proporcji komórek nowotworowych w kulturach mieszanych (Rysunek 2). Poprzez pomiar względnej dawki genu NF1 w stosunku do RPP30, proporcję komórek nowotworowych w kulturze mieszanej można określić dla każdego stężenia leku (Rysunek 3).
<img alt="Ustawienie cyfrowego PCR z detekcją fluorescencyjną i wykresy słupkowe porównawcze dla NF1, RPP30 w komórkach." src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Cyfrowy PCR. (A) ilustracja zasady działania. (B) analiza z użyciem podwójnej sondy wykazuje zmniejszoną ilość genu docelowego (NF1) w komórkach nowotworowych MPNST S462 w stosunku do genu referencyjnego (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający proporcję komórek nowotworowych w stosunku do błędu konfiguracji, ukazujący analizę danych z wyników obliczeń liczby komórek." src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obliczona proporcja komórek nowotworowych. Komórki nowotworowe i nie-nowotworowe zmieszano w różnych stosunkach i wysiano do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Po nocnej inkubacji w celu adhezji komórki poddano lizie metodą HotShot/Drop-dialysis, a odsolone lizaty poddano cyfrowej PCR, co pozwoliło uzyskać stosunek NF1/RPP30. Na podstawie tego stosunku obliczono proporcję komórek nowotworowych w każdym dołku. Średnią i odchylenie standardowe proporcji komórek nowotworowych obliczono z 4 powtórzeń dla każdej zaplanowanej proporcji. Obliczone proporcje komórek nowotworowych (oś Y) naniesiono względem proporcji zaplanowanych (oś X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe komórek nowotworowych przy różnych dawkach nilotynibu oraz wykres odpowiedzi komórkowej." src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zależna od dawki zmiana proporcji komórek nowotworowych. (A) zależna od dawki redukcja widocznych żywych komórek. (B) proporcja komórek nowotworowych (średnia i odchylenie standardowe z 4 powtórzeń) obliczona na podstawie stosunku NF1: RPP30, która malała w zakresie 0 - 10 µM. Przy najwyższej dawce 50 µM pozostało niewiele żywych komórek, co prawdopodobnie wynika z toksycznego efektu dla wszystkich komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres żywotności komórek nowotworowych i nienowotworowych w zależności od stężenia leku, dane dPCR, obliczanie żywotności." src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Oddzielenie odpowiedzi komórek nowotworowych od odpowiedzi komórek nienowotworowych. (A) żywotność i/lub proliferację wszystkich komórek można zmierzyć za pomocą konwencjonalnych testów; proporcję komórek nowotworowych można określić przy użyciu procedury przedstawionej w niniejszym badaniu. (B) wykorzystując oba parametry, odpowiedź wszystkich komórek w kulturze mieszanej na lek można podzielić na odpowiedź komórek nowotworowych oraz odpowiedź komórek nienowotworowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 reakcja</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">2 x ddPCR supermix</td>
			<td style="width:171px;">12</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">Mieszanina testowa dla NF1</td>
			<td style="width:171px;">1.2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">Mieszanina testowa dla RPP30</td>
			<td style="width:171px;">1.2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">HaeIII</td>
			<td style="width:171px;">0.6</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:147px;">Suma częściowa</td>
			<td style="width:171px;">15</td>
			<td style="width:99px;">Mieszanina główna (Master mix)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:147px;">DNA</td>
			<td style="width:171px;">9</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:147px;">Suma całkowita</td>
			<td style="width:171px;">24</td>
			<td style="width:99px;">Końcowa mieszanina PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1 Przygotowanie podwójnej reakcji ddPCR
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Działanie</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Aktywacja polimerazy</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Denaturacja DNA</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Przyłączanie/elongacja</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dezaktywacja polimerazy</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Przytrzymać (opcjonalnie)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2 Ustawienia termocyklera PCR

Celem tego protokołu jest ocena specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu mieszanych kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena zależnej od dawki zmiany proporcji komórek nowotworowych w hodowli zawierającej zarówno komórki nowotworowe, jak i nietumorowe. Metoda ta stanowi narzędzie oparte na analizie genetycznej do oceny efektu in vitro oraz swoistości leków przeciwnowotworowych. Posiada ona potencjał aplikacyjny w procesie odkrywania leków oraz w spersonalizowanej opiece onkologicznej.Główną zaletą tej metody jest to, że podczas testowania leku przeciwnowotworowego w hodowli zawierającej zarówno komórki nowotworowe, jak i nietumorowe, odpowiedź komórek nowotworowych można oddzielić od odpowiedzi komórek nietumorowych. Procedurę tę zaprezentuje Eena, technik z mojego laboratorium. Rozpocznij procedurę od hodowli komórek nowotworowych oraz fibroblastów w standardowym medium DMA w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez noc.Przy subkonfluencji zebrać komórki za pomocą 0,05% trypsyny i policzyć je przy użyciu hemocytometru. Następnie w każdym dołku 96-dołkowej płytki hodowlanej zmieszać 400 komórek nowotworowych i 1 600 komórek nienowotworowych w 0,2 mL medium, przygotowując cztery powtórzenia dla każdego stężenia leku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.Następnie należy przygotować roztwory zapasowe Nilotinibu w DMSO o stężeniach 0, 2, 4 i 20 mM. Każdy z nich należy rozcieńczyć 200-krotnie w 5 mL pożywki DMA, otrzymując dwukrotnie stężone roztwory leku o stężeniach 0, 10, 20 i 100 uM. Następnie z każdej studzienki należy odpiąć 0,1 mL pożywki.Dodaj 0,1 mL pożywki zawierającej lek i kontynuuj inkubację komórek przez pięć dni. Po zakończeniu traktowania obejrzyj przytwierdzone komórki za pomocą mikroskopu kontrastowego i wykonaj zdjęcia. Odessać pożywkę i raz przemyć przeżyłe komórki adhezyjne 0,2 mL PBS.Aby zlizować komórki metodą HotSHOT, należy dodać 50 uL roztworu do lizy alkalicznej do każdej studni. Studnie należy uszczelnić folią. Następnie płytkę inkubuje się w temperaturze 95 degrees Celsius w inkubatorze lub na płycie grzejnej przez 30 minut.Po 30 minutach należy sprawdzić pod mikroskopem, czy na powierzchni studni nie pozostały żadne nienaruszone komórki. W przypadku niepełnej lizy komórek należy wydłużyć czas ogrzewania lub dodać detergent. Jednorazowe zamrożenie próbek w temperaturze 20 Celsius degrees również wspomaga rozpad komórek.Następnie do każdej studni dodaje się 50 uL roztworu neutralizującego, po czym wszystkie lizaty przenosi się do studni w kształcie litery U płytki PCR i suszy w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 do 30 minut. Następnie lizaty należy zrekonstytuować w 20 uL wody destylowanej. Aby odsolić DNA za pomocą dializy kropelkowej, należy podzielić filtr membranowy o średnicy 25 mm na cztery obszary i ponumerować te obszary.Umieścić filtry na wodzie destylowanej błyszczącą stroną do góry w dołku płytki 12-dołkowej. Następnie ostrożnie nanieść 20 uL zrekonstytuowanego lizatu na filtr. Przykryć płytkę i dializować przez 30 do 60 minut.Następnie odessać wodę znajdującą się pod filtrem, nie odwracając go i nie naruszając kropli. Przenieść krople lizatu do dołków nowej płytki PCR. Następnie wysuszyć krople DNA, podgrzewając płytkę w temperaturze 95 °C przez 10 do 30 minut w termocyklerze PCR.Następnie rozpuść lizaty w 10 uL wody. Dalej przygotuj master mix zawierający wszystkie składniki z wyjątkiem DNA do reakcji cyfrowego PCR z podwójną sondą. Wymieszaj master mix na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przez 10 sekund z maksymalną siłą w wirówce i nanieś 15 uL mieszaniny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR.Do dołków zawierających mieszaninę główną dodać lizat z każdej próbki. Przenieść 20 uL każdej mieszaniny reakcyjnej do dołka po stronie próbek w kartridżu w temperaturze pokojowej. Następnie do każdego dołka po stronie oleju w kartridżu dozować 70 uL oleju do generatora kropel.Zamknij kasetę za pomocą uszczelki i umieść cały zestaw w generatorze kropel przed rozpoczęciem generowania kropel. Następnie przenieś 40 uL roztworu kropel do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR. Uszczelnij płytkę folią i umieść ją w termocyklerze PCR.Następnie ustaw temperaturę pokrywy na 105 °C oraz szybkość narastania temperatury na 2 °C/s. Po zakończeniu przenieś płytkę do czytnika kropel i rozpocznij odczyt. Alternatywnie płytkę można przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin.Teraz należy wczytać dane z cyfrowego PCR i przeprowadzić automatyczną analizę. Przejrzyj próbki ręcznie, aby upewnić się, że kropelki pozytywne i negatywne są wyraźnie oddzielone. Wyklucz z dalszej analizy próbki, w których nie występuje wyraźny podział na kropelki pozytywne i negatywne.Skopiuj otrzymany stosunek NF1 do RPP30 do arkusza Excel. Następnie oblicz proporcję komórek nowotworowych. Dla każdego stężenia leku oblicz średnią i odchylenie standardowe z czterech powtórzeń, a następnie nanieś średnie i odchylenia standardowe na wykres w zależności od stężeń leku.Przedstawiono tutaj zależną od dawki redukcję widocznych żywych komórek. Udział komórek nowotworowych, obliczony na podstawie stosunku NF1 do RPP30, malał w zakresie od 0 do 10 uM. Przy najwyższej dawce 50 uM pozostało niewiele żywych komórek, co prawdopodobnie wynika z toksycznego wpływu na wszystkie komórki.Żywotność i proliferację wszystkich komórek można zmierzyć za pomocą konwencjonalnych testów, natomiast proporcję komórek nowotworowych można określić stosując procedurę zaprezentowaną w niniejszym badaniu. Wykorzystując te dwa parametry, całkowitą odpowiedź komórkową na lek w kulturze mieszanej można podzielić na odpowiedź komórek nowotworowych i odpowiedź komórek nienowotworowych. Cała procedura testowa może zostać przeprowadzona w ciągu jednego tygodnia, wliczając w to pięciodniowy okres traktowania lekiem.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stosunek genu docelowego do genu referencyjnego jest zmienny. Obserwowany zakres jest bardzo wąski, mieści się między 0 a 1, dlatego kluczowa jest precyzja. Należy maksymalnie zminimalizować różnice między próbkami oraz błędy w ich obchodzeniu.Postępując zgodnie z tą procedurą, można również wykorzystać kultury pierwotne zawierające zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe, aby przetestować działanie i swoistość leków przeciwnowotworowych. Co więcej, można w ten sposób precyzyjnie ocenić wpływ leku na określoną subpopulację komórek o zdefiniowanej zmianie genetycznej. Mam nadzieję, że ten film pomoże Państwu zrozumieć, jak wykorzystać cechę genetyczną do określenia proporcji komórek nowotworowych w próbce lub w kulturze zawierającej zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Receptorowe kinazy tyrozynowe są ektopowo wyrażane w wielu nowotworach i zostały zidentyfikowane jako cele terapeutyczne w ostrej białaczce. W artykule opisano skuteczną strategię oceny przedklinicznej inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Opisano metodę syntezy wrażliwych na powietrze tytanowych i wanadowych środków przeciwnowotworowych, wraz z oceną ich aktywności cytotoksycznej w stosunku do ludzkiej linii komórek rakowych za pomocą testu MTT.

Przeciwnowotworowe kompleksy metalowe: synteza i ocena cytotoksyczności za pomocą testu MTT

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Tutaj prezentujemy przedkliniczne badania przesiewowe przeciwnowotworowych kumaryn z wykorzystaniem hodowli 3D i danio pręgowanego.

Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak ocenić synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych za pomocą równania indeksu kombinacji Chou i Talalay.

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Poznaj metodę oceny swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro w mieszanych kulturach komórek nowotworowych i fibroblastów. Technika ta umożliwia rozdzielenie odpowiedzi komórek nowotworowych od nienowotworowych.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów