Name: Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę przeskakiwania wieloeksonowego przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w modelu psa z dystrofią mięśniową Duchenne. Terapia ta przywraca ekspresję dystrofiny bez istotnej toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberty, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, oraz Instytut Badań nad Zdrowiem Kobiet i Dzieci (WCHRI).

Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez Gene Tools, LLC.

Przeskakiwanie eksonów jest obiecującą techniką terapeutyczną w leczeniu DMD. Zarówno eksperymenty in vitro , jak i in vivo wykazały, że pomijanie wielu eksonów jest wykonalne. W tym miejscu omówiono zastosowanie modelu psa CXMD. Po pierwsze, AON zostały zaprojektowane przy użyciu programów Rescue-ESE i ESEfinder do celowania w eksony dystrofiny 6 - 8. Do transfekcji mioblastów CXMD wykorzystano chemię 2'OMePS AON, a do eksperymentów in vivo wybrano chemię szkieletu AON. vPMO są bardziej skuteczne niż niezmodyfikowane PMO, ale ze względu na ich wyższą toksyczność nie nadają się do wstrzykiwań ogólnoustrojowych. Ekstrakcję RNA, RT-PCR i sekwencjonowanie cDNA przeprowadzono na mioblastach CXMD. Psy, którym wstrzyknięto koktajl PMO, zostały ocenione klinicznie w celu oceny ewentualnej poprawy objawów klinicznych. Po humanitarnej eutanazji psów pobrano próbki mięśni i przygotowano je do kriosekcji. Uważa się, że okres półtrwania białka dystrofiny indukowany przez AON wynosi około 1 - 2 miesięcy. W tym badaniu wykorzystano młode dorosłe psy, chociaż eksperymenty te można przeprowadzić z nowonarodzonymi psami i starszymi psami (>5 lat). Przygotowane skrawki mięśni wykorzystano do oceny histopatologii i oceny ratowania białka dystrofiny przez Western blot i immunohistochemię48.
Ważne jest, aby upewnić się, że objętość roztworu PMO jest prawidłowa przed wstrzyknięciem; Niezastosowanie się do tego będzie miało znaczący wpływ na wyniki. Podczas wstrzyknięć domięśniowych wymagane jest wystarczające ciśnienie, aby dostać się do włókien mięśniowych. Monitorowanie stanu zdrowia psa i inspekcja miejsca operacji są ważne dla rozwiązywania problemów. W celu monitorowania stanu zdrowia zwierząt należy przeprowadzać cotygodniowe badania krwi i ważenie. Po eutanazji zwierzęcia i przygotowaniu próbek mięśni, krytycznym krokiem w celu zapewnienia czułości w wykrywaniu białka dystrofiny jest użycie zarówno żelu Tris-acetat, jak i metody półsuchego blottingu podczas procedury Western blot.
Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, mioblasty traktowane Ex6A, Ex6B, Ex8A i koktajlem (zawierającym Ex6A, Ex6B, Ex8A i Ex8B) wytwarzały produkty DMD w ramce. Ponieważ Ex8B nie wytwarzał produktów pomijanych przez egzony, nie był używany w kolejnych eksperymentach in vivo . Sekwencjonowanie cDNA wykazało, że nastąpiło przeskakiwanie eksonów 6 - 9, a immunocytochemia z barwieniem DYS-2 wykazała przywróconą ekspresję dystrofiny w leczonych próbkach. Psy leczone AON wykazały znaczny wzrost włókien dystrofinowo-dodatnich. Wskazuje to, że eksony 6 - 8 były pomijane i wytwarzano skrócone białko. Ilość włókien dystrofinowo-dodatnich wzrastała, gdy stosowano koktajl AON i była proporcjonalna do dawki AEN. Immunobloty wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny u psów leczonych morfoliną układową. Mięśnie szkieletowe miały zmienny poziom włókien dystrofiny; Jednak tkanka serca leczona morfoliną wykazała niewielką poprawę ekspresji dystrofiny. Ponieważ dystrofina ma wysoką masę cząsteczkową (427 kDa), wykrycie małych ilości dystrofiny może być trudne. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zastosowano żel Tris-acetate oraz metodę transferu półsuchego. Barwienie HE wykazało poprawę histopatologii u psów leczonych morfoliną. Włókna jądrowe (CNF) są oznaką niezdrowych mięśni i reprezentują cykle degeneracji i regeneracji mięśni. Psy leczone morfoliną CXMD wykazały zmniejszenie odsetka CNF w porównaniu z psami nieleczonymi CXMD. Ocena kliniczna wykazała poprawę objawów, takich jak zwiększona zdolność chodzenia i biegania, u zwierząt leczonych morfoliną. Uważa się, że twardość mięśni odzwierciedla atrofię mięśni, dlatego została uwzględniona w schemacie klasyfikacji 59. Oceniano twardość mięśni ud (kończyn tylnych); jednak wykluczyliśmy mięśnie sartoriusa czaszki, ponieważ mają one tendencję do wykazywania hipertrofii, a nie atrofii w CXMD. Leczone psy wykazywały niższe oceny i miały szybsze czasy w teście biegowym na 15 m. Lepsze czasy w teście 15 m wskazują na poprawę funkcji mięśni 40. Wyższe ogólne wyniki oceny wskazują na zły stan zdrowia i zwiększony zanik mięśni.
Chociaż wyniki te są obiecujące, pomijanie wielu eksonów nadal wiąże się z wieloma wyzwaniami, które będą musiały zostać pokonane, zanim technika ta będzie miała zastosowanie kliniczne. Tkanka serca nadal wykazuje zmniejszony wychwyt AON, prawdopodobnie z powodu różnicy w transporcie komórkowym między tkanką sercową a tkanką szkieletową. Nie zaobserwowano żadnych skutków toksycznych u zwierząt przy obecnych schematach dawkowania; jednak należy wykonać więcej pracy w celu oceny toksyczności długoterminowej, zanim stosowanie koktajli AON będzie mogło przejść do badań klinicznych. Trudno jest uzyskać zgodę na leki koktajlowe AEN, ponieważ agencje regulacyjne definiują każdą sekwencję AON jako unikalny lek. Oznacza to, że każda sekwencja w koktajlu musiałaby być indywidualnie testowana pod kątem bezpieczeństwa, co wymagałoby więcej czasu i więcej pieniędzy. Kolejną przeszkodą w stosowaniu przeskakiwania wieloeksonów w warunkach klinicznych jest duża ilość pośrednich produktów białkowych wytwarzanych o nieznanych funkcjach. Białka te mogą potencjalnie prowadzić do nieprzewidywalnych skutków ubocznych, w zależności od indywidualnej mutacji 22. Ponadto wzorce mutacji dostępne w obecnych dystroficznych modelach psów są ograniczone. Istnieje niewiele naturalnie występujących mutacji i nie wszystkie mutacje są przydatne do badania pomijania wielu eksonów. Dystroficzny model świni zapowiada się na dobrą alternatywę dla przyszłych badań nad pomijaniem eksonów DMD 33, 34.
Modele psów DMD mają pewne zalety w porównaniu z innymi modelami DMD. Ponieważ jest to większy model zwierzęcy, możliwa jest ocena kliniczna i rezonans magnetyczny, co pozwala na bardziej szczegółową analizę. Ponieważ psy są dużymi zwierzętami, są również bardziej odpowiednie do badań toksykologicznych i lepiej reprezentują chorobę człowieka w porównaniu z modelem mysim. Modele psów mają również sekwencje genów DMD , które są bardziej podobne do ludzi 23, 34, 45.
Chociaż jest to technicznie trudne, podejście polegające na pomijaniu wielu eksonów może ostatecznie przynieść korzyści >90% pacjentów z DMD 24. To sprawia, że jest to znacznie lepsza alternatywa dla pomijania pojedynczego eksonu, ponieważ pomijanie pojedynczego eksonu ma zastosowanie tylko do niewielkiej podgrupy pacjentów. Ponadto pomijanie wielu eksonów pozwoli nam wybrać wzorce delecji, które optymalizują funkcjonalność skróconych białek dystrofiny. Na przykład delecja eksonów DMD 45 - 55 wiąże się z wyjątkowo łagodnymi objawami lub osobami bezobjawowymi 14,19,60-63. Przeskakiwanie wielu eksonów eksonów 45 - 55 wykazano już w mysim modelu DMD z delecją eksonu 52 (mdx52) przy użyciu ogólnoustrojowych wstrzyknięć vPMO 22,26. Stosowanie koktajlowych vPMO wykazano również w innych postaciach dystrofii mięśniowej, takich jak wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy (FCMD). FCMD jest spowodowany uwięzieniem eksonów, w którym nieprawidłowy splicing mRNA jest spowodowany insercją retrotranspozonu. Wykazano, że vPMO ratują wzorzec splicingu zarówno w mysim modelu FCMD, jak i w ludzkich liniach komórkowych 64. Chemie nowej generacji AON, wykazujące wyższą skuteczność i niższą toksyczność, ułatwiłyby skuteczne zastosowanie podejścia z pominięciem wielu eksonów do zastosowań klinicznych. Ponadto przeskakiwanie wielu eksonów może być potencjalnie stosowane w innych zaburzeniach genetycznych, takich jak dysferlinopatie 24, 65.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest recesywną chorobą mięśni sprzężoną z chromosomem X, charakteryzującą się postępującym osłabieniem mięśni, po raz pierwszy opisaną przez dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD jest powszechną chorobą genetyczną dotykającą około 1 na 3500 chłopców na całym świecie, przy czym każdego roku rodzi się około 20 000 dotkniętych nią dzieci 2,3. Rozwój motoryczny jest opóźniony, a zaburzenia chodu obserwuje się we wczesnym dzieciństwie 4, a następnie uzależnienie od wózka inwalidzkiego około wczesnych nastolatków. Śmierć zwykle następuje w wieku od 20 do 30 lat z powodu niewydolności oddechowej lub serca 5-8 lat. Obecnie nie ma lekarstwa na DMD. Leczenie glikokortykosteroidami może do pewnego stopnia spowolnić postęp zwyrodnienia mięśni, ale wiąże się ze znaczącymi skutkami ubocznymi, w tym otyłością i cukrzycą 2,7,8. DMD wynika z mutacji w genie dystrofiny (DMD), co prowadzi do utraty funkcjonalnego białka dystrofiny. DMD jest niezwykle dużym genem z ponad 2 milionami par zasad i 79 eksonami 9,10. Mutacje delecji, nonsensu i duplikacji prowadzące do mutacji poza ramką są najczęstszą przyczyną fenotypu DMD. Regiony eksonów 3 - 9 i eksonów 45 - 55 są określane jako "hotspoty mutacji", ponieważ większość pacjentów ma mutacje delecyjne w tych częściach genu, co prowadzi do niefunkcjonalnej dystrofiny u pacjentów z DMD 3,9,11-16. Dystrofina funkcjonuje w kompleksie dystrofina-glikoproteina (DGC), który odgrywa główną rolę w stabilizacji błony mięśniowej. N- i C-końce są najważniejszymi domenami dla funkcji, podczas gdy centralna domena pręcików odgrywa mniej ważną rolę 3,9,17. Obserwacja łagodnego fenotypu związanego z dystrofią mięśniową Beckera (BMD), która wynika głównie z mutacji w obrębie genu DMD, zainspirowała zastosowanie pomijania eksonów w leczeniu DMD. Pacjenci z BMD mają skrócone, ale funkcjonalne białko dystrofiny, które utrzymuje oba końce 3,6,18. Teoretycznie przeskakiwanie eksonów może przywrócić ramkę odczytu, co skutkuje skróconymi, ale funkcjonalnymi białkami dystrofiny podobnymi do tych obserwowanych w BMD 3,19.
Wiele typów antysensownych oligonukleotydów (AON) zostało przetestowanych w badaniach klinicznych, w tym 2'O-metylowane fosforotioniany(2'OMePS) i oligomery morfolino-oligomerów fosforodiamidanu (PMO). Zbadano pomijanie eksonów 51 i 53 przy użyciu tych AON i chociaż wyniki są obiecujące, pomijanie pojedynczych eksonów ma ograniczone zastosowanie, ponieważ jest specyficzne dla mutacji 3, 19, 20,21, 22-26. Pozostają również pytania o stabilność powstałych skróconych białek dystrofiny wytwarzanych z pominięcia pojedynczego eksonu 22,23. Ponadto niektórzy pacjenci wymagają pominięcia więcej niż jednego eksonu w celu przywrócenia ramki odczytu 3. Chociaż technicznie trudniejsze, pomijanie wielu eksonów jest jedną z metod, która może rozwiązać te problemy 3,19. Przeskakiwanie wielu eksonów zostało wcześniej wykazane w dystroficznym liniach komórkowych psów i ludzi in vitro. Dodatkowo, mysie i psie modele dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X (CXMD) mdx52 zostały wykorzystane w badaniach in vivo 22,24-27. Użyto tutaj psów rasy beagle z dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMDJ), ponieważ ramka odczytu CXMDJ może zostać przywrócona przez pominięcie wielu eksonów eksonów 6 i 8 lub dodatkowych eksonów (np. eksonów 3 - 9) (ryc. 1). CXMD oparty na beagle ma ten sam wzorzec mutacji, co model dystrofii mięśniowej Golden Retriever (GRMD), ale beagle są mniejsze i tańsze w utrzymaniu ze względu na ich rozmiar ciała, co stanowi użyteczny model dla DMD 28,29. Psy z CXMD bardziej naśladują ludzki fenotyp DMD niż mniejsze modele zwierzęce, takie jak gryzonie, i są bardziej wiarygodne w ocenach toksykologicznych 3,22,30,31 (Figura 2). Psy z CXMD wykazują postępujący rozpad mięśni, zaburzenia chodu oraz problemy z sercem i układem oddechowym podobne do tych obserwowanych w DMD. W porównaniu z pomijaniem pojedynczych eksonów, pomijanie wielu eksonów ma zastosowanie do znacznie większego odsetka pacjentów. Spośród trzech najczęstszych typów mutacji (delecje, nonsens i duplikacje), 80 - 98% pacjentów może być leczonych poprzez pomijanie wielu eksonów 14,32,33, podczas gdy 45% wszystkich pacjentów z DMD może odnieść korzyści ze specyficznego pomijania egzonów 45 - 55 3,19,22,34.
Wraz z rozwojem modyfikowanych morfolinów, poprawiła się skuteczność koktajli AON w ułatwianiu pomijania eksonów. Bogate w argininę, penetrujące komórki, sprzężone z peptydami PMO (PPMO) i vivo-morpholinos (vPMO) to substancje chemiczne AEN, które znacznie poprawiły zdolność i stabilność przenikania do komórek 3,35-38. Utrzymują się obawy dotyczące długoterminowej toksyczności AEN; Poczyniono jednak znaczne postępy. Modyfikacje chemiczne wprowadzone do morfolinosów znacznie zmniejszają efekty niezamierzone, a badania przedkliniczne nie wykazały znaczących skutków toksycznych 3,22,39,40. Pozostałym wyzwaniem dla pomijania wielu eksonów jest obecny wymóg, aby każdy pojedynczy AON był testowany pod kątem toksyczności samodzielnie, jako pojedynczy lek, a nie razem jako koktajl 3,19,22,41,42. W badaniach DMD obejmujących zarówno jedno-, jak i wieloeksonowe pomijanie ukierunkowane na serce, nastąpiła niewielka poprawa w dystroficznej tkance serca. Uważa się, że skuteczność morpholinos w sercu jest niska ze względu na słabą zdolność przenikania do komórek. PPMO sprzężone z peptydami poprawiły zdolność AON-ów do przenikania do komórek serca, zwiększając ilość funkcjonalnego białka dystrofiny uratowanego w sercu 3,19,38.
Tutaj nasze podejście do koktajli AON jest szczegółowo omówione, w tym projektowanie sekwencji AON za pomocą oprogramowania ESEfinder 43. Opisano również protokoły eksperymentów na psach z przeskakiwaniem wieloeksonowym. Beagle CXMDJ zostały użyte do eksperymentów z pominięciem eksonów 6 i 8. Przeskakiwanie wielu eksonów w modelu CXMD u psów daje obiecujące wyniki, ale nadal istnieją wyzwania, które należy pokonać, zanim będą miały zastosowanie kliniczne.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfekcja mioblastów psów&nbsp; </mocna></td></tr><tr><td>3 ml płytki 6-dołkowe</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofektyna&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Całkowita objętość 100 ml w pożywce opti-MEM w stosunku 2:1 dla lipofektyny. 10 ml lipofektyny na 5 mg RNA.&nbsp;</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) i Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica dla koni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>streptomycyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfekcja morfolino mioblastów psów 
Cały materiał z MePS Transfekcja mioblastów psów do hodowli</td></tr><tr><td>morfolinos antysensownych&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg morfoliny w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Ekstrakcja i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/płytkę</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Etanol&nbsp;</td>Spektrometr UV <td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Starter do przodu w eksonie 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>Odwrócony starter w eksonie 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTCTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 &#956; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw RT-PCR&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>komplementarne sekwencjonowanie DNA (cDNA)&nbsp; </td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sekwencjonowania cyklu Terminator v3.1&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Zastrzyki domięśniowe lub otwarta biopsja mięśni</td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td> chirurgiczne <td>Nożyczki, skalpel, igła, nić chirurgiczna&nbsp;</td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodofory&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>chloroheksydyna</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Serwety chirurgiczne&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peelingi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maseczka do twarzy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nakrycie głowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiopental sodu&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Laboratoria Isoflurane</td><td>Abbott&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Morfoliny antysensowne&nbsp;</td><td>Gene-tools</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Rozcieńczyć do końcowej objętości 100 l w pożywce opti-MEM.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg morfolinosu w stężeniu 32 mg/ml w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>27&nbsp; G Igły</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr>chlorowodorek <td></td><td></td><td></td><td>buprenorfiny</td></tr><tr><td>Depresor do języka&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cefaleksyna</td><td></td><td>15 do 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cefazolina</td><td></td><td>15 do 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina&nbsp;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorku buprenorfiny&nbsp;</td><td>0,02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Zastrzyki ogólnoustrojowe</mocna></td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna strzykawki&nbsp;</td><td>Muromachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Igły do montażu na miejscu</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; G Igły&nbsp;</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silna>Kliniczna ocena psów</td></tr><tr><td>Kamera wideo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoper&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Rezonans magnetyczny (MRI)&nbsp; </td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Cewka <td></td><td></td><td></td>kończyn <td>ludzkich o średnicy 18 cm/długości 18 cm</td></tr><td colspan="4"><silny>Pobieranie i przygotowanie mięśni (sekcja zwłok)Tiopental sodu&nbsp;<tr></td></tr><tr><td></td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Laboratoria Isoflurane</td><td>Abbott&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr>Guma <td></td><td></td><td>tragakantowa</td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Ciekły azot&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krążki korkowe</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do suchego lodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&ndash; szkiełka powlekane</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Microsystem&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>CM1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Immunohistochemia</silny>&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Nowokastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Rozcieńczenia 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Nowokastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>Rozcieńczenia 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 koza antymysz IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2,500 rozcieńczenia</td></tr><tr><td>Alexa 594 koza antymysz IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2,500 rozcieńczenia</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Zawiera środek montażowy</td></tr><tr><td>Kozia surowica&nbsp;</td><td>Komora wilgotnościowa Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Laboratorium Naukowe&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnia komorowa&nbsp;</td><td>Laboratorium&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>154453 Okulary nakrywkowe&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis barierowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm przy 20-krotnym powiększeniu.</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </mocna></td></tr> <tr><td>woda destylowana&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator ręczny&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 razy; Bufor ładowania SDS Laemmli&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,1 mln Tris&ndash; HCl (pH 6,6), 2% (w/v) SDS, 2% (0,28&nbsp; M) beta-merkaptoetanol, 20% glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Żele SDS&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td><td>5% żele SDS o rozdzielczości 5%</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>membrana 3-8%</td></tr><tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr> Bufor <tr><td>do pracy metanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 razy;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris-Base, 1,920 mM Glycine</td></tr><tr><td>Running Buffer (1&razy;)</td><td></td><td></td><td>10% 10&krotny bufor, 20% metanol&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05% PBS/Animacja 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 000 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3 razy; 200 ml do prania</td></tr><tr><td>PBST/5% mleka w proszku&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładowania/próbki do Western blotting</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor koktajlu proteazy&nbsp;</td><td></td><td></td> Bufor katodowy Roche 11836153001 <td></td></tr><tr><td></td> 0,025 M podstawa Tris + 40&nbsp;<td></td><td></td><td> mM Kwas 6-aminokapronowy + 20%</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> anodowy metanolu <td>0,03 M Tris Base + 20%</td></tr><tr><td>Metanol Skoncentrowany bufor</td><td></td><td></td> anodowy <td>0,3 M Tris zasada + 20% metanol</td></tr><tr><td>przeciwciało desminy&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Nowokastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>Rozcieńczenia 1:150&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td> ImageJ</tr></tbody></table>

przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem x u psów

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych śmiertelnych chorób genetycznych na świecie, spowodowaną mutacjami w genie dystrofiny (DMD). Przeskakiwanie eksonów wykorzystuje krótkie cząsteczki podobne do DNA/RNA zwane oligonukleotydami antysensownymi (AON), które przywracają ramkę odczytu i wytwarzają krótsze, ale funkcjonalne białka. Terapia z pominięciem eksonów napotyka jednak dwie poważne przeszkody: ograniczoną możliwość zastosowania (tylko 13% pacjentów może być leczonych pojedynczym lekiem AEN) oraz niepewną funkcję skróconych białek. Problemy te zostały rozwiązane za pomocą podejścia koktajlowego AON. Podczas gdy około 70% pacjentów z DMD może być leczonych przez pomijanie pojedynczych eksonów (wszystkie eksony łącznie), można potencjalnie leczyć ponad 90% pacjentów z DMD, jeśli można zrealizować pomijanie wielu eksonów za pomocą koktajlowych leków antysensownych. Psi model psiej dystrofii sprzężonej z chromosomem X (CXMD), którego fenotyp jest bardziej podobny do ludzkich pacjentów z DMD, został wykorzystany do przetestowania skuteczności ogólnoustrojowej i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów w eksonach 6 i 8. Model psa CXMD zawiera mutację miejsca splicingu w intronie 6, co prowadzi do braku eksonu 7 w mRNA dystrofiny. Aby przywrócić ramkę odczytu w CXMD, wymagane jest pominięcie wielu eksonów 6 i 8; dlatego CXMD jest dobrym średniej wielkości modelem zwierzęcym do testowania skuteczności i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów. W obecnym badaniu zaprojektowano koktajl antysensownych morfolinos ukierunkowanych na ekson 6 i ekson 8, który przywrócił ekspresję dystrofiny w mięśniach szkieletowych na całym ciele. Przedstawiono metody transfekcji/iniekcji oligonukleotydów koktajlowych oraz ocenę skuteczności i bezpieczeństwa przeskakiwania wieloeksonowego w modelu psa CXMD.

Badania In Vitro
Mioblasty poddano transfekcji w różnych warunkach traktowania 2'OMePS, aby porównać skuteczność każdego AON. Przeprowadzono traktowanie pojedynczymi AON w stężeniu 60 nM dla każdego z: Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B, a także traktowanie koktajlem zawierającym 60 nM każdej z 4 sekwencji AON. Próbki RNA pobrano cztery dni po transfekcji. Po reakcji RT-PCR próbki z każdego traktowania naniesiono na żel wraz z próbkami nietraktowanymi (NT). Prążki położone wyżej na żelu reprezentują produkty DMD z przesunięciem ramki odczytu; prążki te zaobserwowano w mioblastach NT, traktowanych Ex8A oraz Ex8B. Mioblasty traktowane Ex6A, Ex6B, Ex8A oraz koktajlem wykazały produkty w ramce odczytu. W przypadku koktajlu oraz Ex6A/B uzyskano 10% produktów w ramce, podczas gdy dla Ex8A uzyskano jedynie 30% produktów w ramce (Rysunek 7). W celu potwierdzenia pominięcia eksonu i przywrócenia ramki odczytu przeprowadzono sekwencjonowanie cDNA; wyniki wykazały, że eksony 6–9 zostały rzeczywiście pominięte (Rysunek 7). Immunohistochemia wykazała, że psy traktowane AON miały zwiększoną liczbę włókien dystrofina-dodatnich w porównaniu z próbkami NT (Rysunek 8).
Badania in vivo
Aby porównać efektywność różnych warunków terapii AON, psom rasy CXMD (w wieku od 0,5 do 5 lat) podano jednorazowo wstrzyknięcie 1,2 mg Ex6A lub koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A w różnych dawkach. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu pobrano próbki mięśni i zabarwiono je przeciwciałem DYS-1, aby porównać liczbę włókien dystrofinowych dodatnich. Wszystkie próbki traktowane koktajlem wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z próbkami NT. Liczba włókien dystrofinowych dodatnich wzrastała wraz z dawką AON (Rysunek 9). Po systemowym wstrzyknięciu próbki mięśni psów typu dzikiego (WT), NT oraz psów CXMD traktowanych koktajlem zabarwiono DYS-1 (Rysunek 10). Psy CXMD traktowane koktajlem wykazały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z psami NT CXMD, zarówno w próbkach mięśnia CT, jak i mięśnia sercowego. Jednak w mięśniach szkieletowych (CT) traktowanych AON stwierdzono znacznie wyższą ekspresję dystrofiny niż w traktowanym mięśniu sercowym. Analiza immunoblottingowa porównująca mięśnie WT, NT oraz mięśnie traktowane różnymi koktajlami morfolino doprowadziła do tych samych wniosków. W traktowanych próbkach mięśni szkieletowych zaobserwowano również szeroki zakres ekspresji dystrofiny (Rysunek 10). Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) wykazało, że traktowane psy CXMD wykazywały poprawę histopatologiczną, ze znacznym spadkiem liczby włókien z jądrem centralnym (CNF) w porównaniu z psami NT CXMD (Rysunek 1). Wskazuje to na intensywniejsze procesy degeneracji/regeneracji u psów NT, co jest objawem patologii mięśni dystroficznych. Ponadto traktowane psy osiągały szybsze czasy biegu i lepsze wyniki w klinicznej skali oceny. Psy CXMD traktowane uzyskały lepsze wyniki niż psy NT CXMD we wszystkich kategoriach (Rysunek 12).
<img alt="Schemat splicingu mRNA; prawidłowe i dystroficzne mRNA psa oraz proces pomijania eksonu po zastosowaniu AO." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Wzorzec mutacji psa z CXMD oraz strategie pomijania eksonów 6–8 z użyciem koktajlu antysensownego. Psy z CXMD posiadają punktową mutację w eksonie 6, co prowadzi do utraty eksonu 7 w mRNA dystrofiny u tych psów. Skutkuje to przesunięciem ramki odczytu mRNA i utratą produkcji białka dystrofiny. Zaprojektowano krótkie sekwencje AON, które wiążą się z eksonami 6 i 8, co prowadzi do skutecznego pominięcia eksonów 6–8 podczas splicingu mRNA. Szary pasek u psów traktowanych koktajlem AON reprezentuje krótkie sekwencje AON. Ekson 9 koduje domenę zawiasową i czasami jest spontanicznie wycinany podczas splicingu przy zastosowaniu AON przeciwko eksonom 6 i 8. Powstałe mRNA koduje białka dystrofiny, które są krótsze, ale funkcjonalne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie objawów dystrofii mięśniowej u beagli typu dzikiego i CXMD w wieku jednego roku, schemat." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Główne objawy kliniczne u rocznego psa z wrodzoną dystrofią mięśniową sprzężoną z chromosomem X (CXMD). Przedstawiono rocznego psa rasy beagle typu dzikiego oraz psa z CXMD. Zajęcie mięśni proksymalnych, kończyn oraz mięśni skroniowych jest zazwyczaj obserwowane od 2. miesiąca życia. Przykurcze stawowe i przemieszczenie miednicy są widoczne od 4. miesiąca życia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Weterynaryjny zabieg chirurgiczny, przygotowanie do znieczulenia, narzędzia chirurgiczne, konfiguracja opieki nad zwierzęciem." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Znieczulenie ogólne psa. A) Iniekcje domięśniowe i biopsje mięśni wykonuje się w narkozie ogólnej z użyciem izofluranu. B) Unieruchomienie zwierzęcia do iniekcji systemowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Skany MRI porównujące rozwój mózgu myszy w zależności od genotypu w czasie; WT, NT, 2703MA, 201MA." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) osobników typu dzikiego, nieleczonych CXMD oraz leczonych CXMD. Obrazy MRI kończyny tylnej w 3. i 5. miesiącu życia u psów WT oraz NT z CXMD. Przedstawiono dwa przykładowe obrazy MRI kończyny tylnej psów z CXMD przed (1 tydzień przed pierwszą iniekcją) i po iniekcji AON. Pies 2703MA był leczony 7 razy w tygodniu dawką 20 mg/kg koktajlu morfolino. Pies 201MA był leczony poprzez 5 iniekcji dożylnych w tygodniu w dawce 120 mg/kg koktajlu morfolino. Psy z grupy kontrolnej i leczonej były dopasowane pod względem wieku. U psów leczonych obserwuje się zmniejszenie sygnałów T2. Obrazy opracowano za zgodą Yokoty. i wsp. (copyright 209, John Wiley &amp; Synowie) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna kończyny psa w celu pobrania tkanek; obejmuje nacięcie oraz przygotowanie próbek." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Procedura biopsji mięśnia u psa. A) Kończyna dolna jest unieruchomiona w celu wykonania biopsji mięśnia. B) Kończynę dolną przytrzymuje się za pomocą pęsety. C) Odsłonięto mięsień CT. W celu pobrania próbek mięśni z miejsc wstrzyknięcia zastosowano technikę biopsji otwartej. Do zabezpieczenia próbek biopsyjnych użyto nici. D) Próbki mięśni na gumie tragakantowej po sekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat układu transferu białek, przedstawiający warstwowe materiały do Westernu w polu elektrycznym." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Metoda transferu półsuchego. Przedstawiono schemat półsuchej metody transferu w technice Western blotting. Trzy arkusze papieru nasączone stężonym buforem anodowym umieszcza się przy terminalu ujemnym; na nich układa się kolejne 3 arkusze nasączone buforem anodowym. Membranę PVDF namaczano w metanolu, a następnie w buforze anodowym, po czym położono ją na wierzchu sześciu arkuszy papieru. Żel, uprzednio namoczony w buforze katodowym, delikatnie kładzie się na membranie PVDF. Na koniec na żelu układa się 3 arkusze papieru nasączone buforem katodowym. Na górze umieszcza się terminal dodatni. Przez 1 godzinę przez układ przepuszczany jest prąd o natężeniu 40 mA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy PCR i chromatogram sekwencjonowania; analiza edycji genów; dopasowanie eksonów." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7. Pomijanie eksonów w mioblastach CXMD. Mioblasty CXMD przetransfekowano samymi sekwencjami Ex6A, Ex6B, Ex8A lub Ex8B albo koktajlem wszystkich czterech. W przypadku pojedynczych sekwencji zastosowano stężenie 60 nM, natomiast dla koktajlu użyto 60 nM każdej z sekwencji. A) Leczenie 2'OMePS w psich mioblastach CXMD. Próbki traktowane Ex6A, Ex6B oraz koktajlem wykazują silne prążki w oczekiwanej pozycji transkryptów z pominiętym eksonem w ramce odczytu. Ex8A wykazuje prążek o średnim natężeniu, Ex8B wykazuje słaby prążek, a NT nie wykazuje prążka w pozycji zgodnej z ramką odczytu. B) Sekwencjonowanie cDNA z próbek traktowanych samą sekwencją Ex6A, 4 dni po transfekcji. Ilustracje opracowano za zgodą Yokoty. i in. (copyright 209, John Wiley &amp; Synowie) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna porównująca wzrost komórek w grupach WT, Cocktail, Ex6A oraz NT; skala 50 μm." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Zwiększona ekspresja dystrofiny w mioblastach CXMD po transfekcji 2'-ometylowanym fosforotioanem (2'OMePS). Mioblasty CXMD poddano transfekcji samym Ex6A lub koktajlem 2'OMePS. Przedstawiono barwienie DYS-2 (czerwone) i DAPI (niebieskie). Mioblasty poddane działaniu preparatu porównano z mioblastami typu dzikiego (WT) oraz niepoddanymi działaniu preparatu (NT). Obrazy zostały opracowane za zgodą Yokoty. i in. (prawa autorskie 209, John Wiley &amp; Synowie) 40Skala = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna próbek tkanek; WT, NT, Ex6A, koktajl. Porównanie morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Przywrócenie ekspresji dystrofiny za pomocą domięśniowych zastrzyków z morfolinami u psów CXMD. Do mięśni CT psów CXMD wstrzyknięto albo sam Ex6A, albo koktajl składający się z Ex6A, Ex6B i Ex8A. Przedstawiono barwienie dystrofiny (DSY-1) u psów typu dzikiego (WT), psów CXMD nieleczonych (NT) oraz leczonych. Psy otrzymywały albo 1,2 mg samego Ex6A, albo 1,2 mg koktajlu. Obrazy opracowano za zgodą Yokoty. i inni (copyright 209, John Wiley &amp; Synowie) 40Skala = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza tkanki mięśniowej u osobników typu dzikiego, CXMD oraz leczonych PMO; obejmuje obrazy mikroskopowe i wyniki elektroforezy żelowej." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rycina 10. Zwiększona ekspresja dystrofiny po systematycznym leczeniu koktajlem morfolino u psów z zespołem CXMD. Do porównania ekspresji dystrofiny u psów typu dzikiego (WT) (kontrola pozytywna), nieleczonych (NT) (kontrola negatywna) oraz psów z CXMD leczonych koktajlem morfolino w dawce 120 mg/kg (po 40 mg/kg każdego AON) wykorzystano barwienie na dystrofinę (DYS-1). Koktajl morfolino zawierał Ex6A, Ex6B i Ex8A. Psy otrzymywały ten koktajl w zastrzykach dożylnych 5 razy w tygodniu. A) Porównanie ekspresji dystrofiny w mięśniach piszczelowych przednich (CT) psów WT, NT oraz psów leczonych. B) Porównanie ekspresji dystrofiny w tkance serca psów NT oraz psów leczonych koktajlem morfolino. C) Przedstawiono immunoblot dla dystrofiny z desminą jako kontrolą załadunku dla psów WT, NT oraz psów leczonych koktajlem morfolino. W przypadku psów leczonych pokazano następujące mięśnie: triceps ramienny (TB), biceps ramienny (BB), przeponę (DIA), przełyk (ESO), CT, mięsień przywodziciel (ADD), mięsień prostownik długi palców (EDL), mięsień żwacza (MAS) oraz serce. Obrazy zaadaptowano za zgodą Yokoty. i wsp. (prawa autorskie 209, John Wiley &amp; Synowie) 40Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela porównawcza histologiczna tkanki nieleczonej i leczonej; zmiany w strukturze komórkowej po leczeniu." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Poprawa obrazu histopatologicznego u psów z CXMD leczonych przez 7 tygodni koktajlem morfolinowym w dawce 240 mg/kg. Psom rasy CXMD w wieku od pół roku do pięciu lat wstrzykiwano dożylnie koktajl morfolinowy (Ex6A, Ex6B i Ex8A) w dawce 240 mg/kg raz w tygodniu przez 7 tygodni. Czternaście dni po ostatnim wstrzyknięciu pobrano mięśnie przełyku i wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Barwienie HE mięśni przełyku psów CXMD niepoddanych leczeniu (NT) oraz leczonych koktajlem morfolinowym (Treated) (obiektyw 40X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Równowaga statyczna; wpływ iniekcji PMO na wynik gradacji; wykres liniowy; analiza badawcza." src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rycina 12. Poprawa wyników oceny klinicznej i czasu biegu na dystansie 15 m po zastosowaniu morfolino. Psy traktowane morfolinami porównano z nietraktowanymi (NT) psami z tego samego miotu. Słupki błędów na wykresie oznaczają SEM. A) Przed i po leczeniu obliczono całkowitą punktację w badaniu klinicznym, a następnie porównano zwierzęta traktowane z nietraktowanymi psami z tego samego miotu. B) Porównanie czasów przebiegnięcia dystansu 15 m u psów traktowanych oraz NT. C) Analogicznie jak w B, jednak wykorzystano młodsze psy. Ryciny zostały zaadaptowane za zgodą Yokoty. it al. (copyright 209, John Wiley &amp; Synowie) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligonukleotyd antysensowny </td>
			<td>Sekwencja nukleotydowa </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex6A </td>
			<td>GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex6B</td>
			<td>ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex8A</td>
			<td>CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Projektowanie oligonukleotydów antysensownych.

Pomijanie eksonów jest obecnie najbardziej obiecującą opcją terapeutyczną dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Aby rozszerzyć możliwości zastosowania u pacjentów z DMD i zoptymalizować stabilność/funkcję powstałych skróconych białek dystrofiny, opracowano podejście z pominięciem wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych i zademonstrowaliśmy ogólnoustrojowe ratowanie dystrofiny w modelu psów.

Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie skuteczności i toksyczności pomijania wielu eksonów przy użyciu koktajlu oligonukleotydów antysensownych (AON) w psim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach translacyjnych nad terapią pomijania eksonów za pomocą strategii antysensownej, np. czy oligonukleotydy antysensowne mogą indukować pomijanie wielu eksonów i znosić ekspresję dystrofiny w modelu dużego zwierzęcia. Główną zaletą zastosowania modelu psiego w badaniu jest fakt, że wyniki terapeutyczne u większych zwierząt można w sposób bardziej wiarygodny ekstrapolować na pacjentów z DMD.Choć pomijanie eksonów jest bardzo obiecującą terapią w przypadku DMD, może ono zostać zastosowane również w innych chorobach genetycznych, takich jak wrodzona dystrofia mięśniowa oraz dystrofia mięśni obręczy barkowej i miednicznej. Prezentację eksperymentów in vitro przeprowadzi dr Yoshitsugu Aoki, kierownik naszego laboratorium, a prezentację eksperymentów in vivo przeprowadzi dr Mutsuki Kuraoka, stażysta podoktorski z mojego oddziału. Po zaprojektowaniu AON zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć płytek 6-dołkowych do wysiania mioblastów CXMD w zagęszczeniu od 1 do 5 × 10³ na cm² w 3 mL DMEM z dodatkiem 10% FBS i 1% pen-strep.Inkubować komórki w temperaturze 37°C aż do osiągnięcia 60–80% konfluencji. Po osiągnięciu pożądanej konfluencji, użyć pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby rozcieńczyć odczynnik do transfekcji kationowymi liposomami do całkowitej objętości 100 µl, a następnie pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30–45 minut. Następnie, za pomocą pożywki z obniżoną zawartością surowicy, rozcieńczyć AON do objętości końcowej 100 µl.Połącz rozcieńczony odczyn do transfekcji z rozcieńczonymi AON, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. W międzyczasie usuń pożywkę z komórek i przemyj komórki trzy razy świeżą pożywką. Następnie dodaj 0,8 ml pożywki do mieszaniny do transfekcji, a potem przenieś cały roztwór do świeżo przemytych komórek.Inkubować w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Następnie dodać do komórek pożywkę różnicującą (DM) i inkubować do 10 dni, aby nastąpiła różnicowanie. Począwszy od około trzeciego dnia, sprawdzać stopień różnicowania.Aby przeprowadzić transfekcję morpholino mioblastów psa, należy hodować mioblasty CXMD zgodnie z procedurą przedstawioną wcześniej w tym filmie. Podgrzać koktajl morpholino w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Następnie dodać odczynnik dostarczający peptydy i dostosować stężenie morpholino do stężenia końcowego od 3 do 6 µM.Następnie należy użyć DM do wymiany pożywki w mioblastach i dodać morpholino do każdej studni do stężenia końcowego 1 µM. Inkubować przez 16 do 18 godzin. Następnie, w celu zebrania komórek do ekstrakcji RNA, dodać do nich 1 mL tiocyjanianu guanidynium-fenolu-chloroformu, aby odłączyć je od płytki.Po inkubowaniu komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przenieś je do probówek o pojemności 1,5 ml. Do każdej probówki dodaj 200 µL chloroformu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aż pojawią się trzy oddzielne warstwy: warstwa RNA, warstwa białek i warstwa DNA. Wirowarkuj probówki z prędkością 12 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.Następnie należy usunąć górną warstwę nadsączu i przenieść ją do probówki zawierającej 500 µL izopropanolu. Przed usunięciem nadsączu i zabezpieczeniem osadu RNA probówki z nadsączem należy odwirować. Osad należy przemyć etanolem, a następnie centrifugować przy 8, 000 ×g i 4 °C przez pięć minut.Odwracaj probówkę przez 15 minut, aby odparować pozostały etanol, a następnie dodaj od 15 do 30 µL wody wolnej od RNaz. Następnie, wykorzystując spektroskopię UV-Vis przy 260 nm, określ ilość RNA. Aby przeprowadzić RT-PCR, wymieszaj następujące odczynniki i dodaj wodę do uzyskania objętości końcowej 25 µL.Umieść próbki w termocyklerze i uruchom poniższy program. Po zakończeniu cyklu produkt należy przechowywać w temperaturze 4°C lub 20°C. Aby wykonać wstrzyknięcie domięśniowe, po przygotowaniu zwierzęcia do zabiegu i znieczuleniu go zgodnie z protokołem tekstowym, użyj skalpela, aby naciąć skórę wzdłużnie na długości około 5 cm nad mięśniem piszczelowym przednim (cranial tibial, CT). W celu oznaczenia miejsc wstrzyknięcia użyj igły i nici chirurgicznej, aby przeszyć powięź głęboką, wykonując dwa szwy znacznikowe w odstępach 2 cm.Bardzo ważne jest zaznaczenie miejsca iniekcji za pomocą nici, co pozwala na dokładniejsze wykonanie biopsji. Następnie, używając igły o rozmiarze 27G, wstrzyknij pożądaną stężenie AONs do mięśnia i pozostaw igłę na jedną minutę. Następnie, aby przeprowadzić otwartą biopsję mięśnia, użyj skalpela chirurgicznego, aby usunąć fragment tkanki mięśniowej o długości około dwóch centymetrów z mięśnia CT.Nałóż powięź mięśniową z powrotem na mięsień i użyj wchłanialnej nici 000 do zamknięcia tkanki. Następnie użyj nici nylonowej 000 do zamknięcia skóry. Za pomocą igły podaj domięśniowo iniekcję buprenorfiny chlorowodorku w dawce 0,02 mg/kg.Aby wstrzyknąć koktajl zawierający równe ilości każdego AON do żyły kończyny, należy, trzymając zwierzę zgodnie z protokołem tekstowym, wprowadzić kaniulę do żyły kończyny. Używając pompy infuzyjnej lub sterownika strzykawki, wstrzyknąć łącznie 50 mililitrów z prędkością 2,5 mililitra na minutę przez 20 minut, zgodnie z instrukcjami producenta. Iniekcje powtarzać co tydzień lub co dwa tygodnie, ponieważ ekspresja dystrofiny będzie narastać przy wielokrotnych podaniach.Aby przeprowadzić cotygodniowe badania krwi w celu oceny toksyczności, należy za pomocą igły pobrać 3 mL krwi z jednej z żył podskórnych kończyny przedniej lub tylnej. Zgodnie z instrukcjami producenta należy wykonać następujące analizy. Dalsze analizy należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym.Mioblasty poddano transfekcji w różnych warunkach traktowania 2'OMePS, aby porównać skuteczność każdego AON. Przedstawiony tutaj żel reprezentuje próbki RT-PCR z RNA pobranego cztery dni po traktowaniu. Prążki położone wyżej na żelu reprezentują produkty DMD z przesunięciem ramki odczytu i były widoczne w nietraktowanych mioblastach oraz tych traktowanych Ex8A i Ex8B.Próbki Ex6A, Ex6B, Ex8A oraz mioblasty traktowane koktajlem wykazały produkty w ramce odczytu. Sekwencjonowanie cDNA potwierdziło pominięcie eksonów od 6 do 9. Jak widać na tej rycinie, immunocytochemia wykazała, że komórki psa traktowane AON posiadały zwiększoną liczbę włókien dystrofina-dodatnich w porównaniu z próbkami nietraktowanymi.Aby porównać skuteczność różnych warunków leczenia AON, psom rasy CXMD wstrzyknięto Ex6A lub koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A w różnych dawkach. Próbki mięśni barwione pod kątem DYS1 wykazują wzrost ekspresji dystrofiny w próbkach traktowanych koktajlem, a liczba włókien dystrofina-dodatnich wzrastała wraz z dawką dystrofiny. Po wstrzyknięciach systemicznych u psów CXMD traktowanych koktajlem zaobserwowano zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu do psów NT CXMD, zarówno w próbkach CT, jak i mięśnia sercowego.Jednakże w mięśniach szkieletowych traktowanych AON zaobserwowano znacznie wyższą ekspresję dystrofiny w porównaniu z traktowanym mięśniem sercowym. Dodatkowo u leczonych psów CXMD stwierdzono poprawę obrazu histopatologicznego ze znacznym zmniejszeniem liczby włókien z jądrem centralnym w porównaniu z psami CXMD grupy NT. Po opanowaniu techniki, oba rodzaje eksperymentów – in vitro oraz in vivo – mogą zostać przeprowadzone w ciągu kilku godzin, pod warunkiem ich prawidłowej realizacji.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uważne monitorowanie stanu zdrowia psa. Po opracowaniu tej metody systemowe pomijanie eksonów utorowało drogę badaczom w tej dziedzinie do rozpoczęcia badań klinicznych z udziałem pacjentów z DMD. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak leczyć psy za pomocą oligonukleotydów antysensownych.

multi-exon-skipping-using-cocktail-antisense-oligonucleotides-canine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wykazano, że różne oligonukleotydy antysensowne (AON) indukują inkluzję eksonów (modulacja splicingu) i ratują ekspresję SMN w rdzeniowym zaniku mięśni (SMA). W tym miejscu opisujemy protokół lipotransfekcji AON w celu indukcji inkluzji eksonu w genie SMN2 oraz metody oceny w celu określenia skuteczności w fibroblastach pacjentów z SMA.

Ocena inkluzji eksonów indukowanej przez oligonukleotydy antysensowne przełączające splicing w fibroblastach pacjentów z SMA

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.

Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Ustrukturyzowany protokół jest prezentowany dla testu komórkowego jako test funkcjonalny do przewidywania rokowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej (CDS). Test można wykonać na świeżych lub mrożonych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), a procedura zostaje zakończona w ciągu 4 dni.

Protokół testu komórkowego do prognozowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej

Ekstrakcja DNA ze śliny może stanowić łatwo dostępne źródło DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, z niewielką lub żadną degradacją/fragmentacją.  Protokół ten zapewnia zoptymalizowane parametry pobierania/przechowywania śliny i ekstrakcji DNA, aby były wystarczającej jakości i ilości dla dalszych testów DNA o wysokich wymaganiach jakościowych.

Pobieranie i ekstrakcja DNA śliny do sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Poznaj metodę przeskakiwania wieloeksonowego przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w modelu psa z dystrofią mięśniową Duchenne. Terapia ta przywraca ekspresję dystrofiny bez istotnej toksyczności.

Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów (Wideo) | JoVE Journal

Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów

Przeglądaj więcej filmów