Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów
24 maja 2016
Pomijanie eksonów jest obecnie najbardziej obiecującą opcją terapeutyczną dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Aby rozszerzyć możliwości zastosowania u pacjentów z DMD i zoptymalizować stabilność/funkcję powstałych skróconych białek dystrofiny, opracowano podejście z pominięciem wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych i zademonstrowaliśmy ogólnoustrojowe ratowanie dystrofiny w modelu psów.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie skuteczności i toksyczności pomijania wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych lub AONs w psim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a lub DMD. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w badaniach translacyjnych nad terapią pomijania eksonów antysensownych, takie jak to, czy oligonukleotydy antysensowne mogą indukować wielokrotne pomijanie eksonów i niszczyć ekspresję dystrofii w dużym modelu zwierzęcym. Główną zaletą wykorzystania modelu psa w badaniu jest to, że wyniki terapeutyczne u większych zwierząt można bardziej wiarygodnie ekstrapolować na pacjentów z DMD.
Chociaż pomijanie eksonów jest bardzo obiecującą terapią DMD, może być również stosowane w innych chorobach genetycznych, takich jak wrodzona dystrofia mięśniowa i dystrofia mięśniowa obręczowo-kończynowa. Demonstracja eksperymentów in vitro zostanie przeprowadzona przez dr Yoshitsugu Aoki, naszego szefa laboratorium, a demonstracja eksperymentów in vivo zostanie wykonana przez dr Mutsuki Kuraoka, doktora habilitowanego z mojego wydziału. Po zaprojektowaniu AON zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 6-dołkowych płytek do wysiewu od jednego do pięciu razy od 10 do jednej trzeciej na centymetr kwadratowy mioblastów CXMD na centymetr kwadratowy w trzech mililitrach DMEM z 10% FBS i 1% paciorkowcem.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż zlewają się w 60 do 80%. Gdy komórki osiągną pożądaną konfluencję, użyj zredukowanej pożywki surowicy, aby rozcieńczyć kationowy odczynnik do transfekcji liposomów do całkowitej objętości 100 mikrolitrów i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 do 45 minut. Następnie, za pomocą zredukowanej pożywki surowicy, rozcieńczyć AON do końcowej objętości 100 mikrolitrów.
Połączyć rozcieńczony odczynnik do transfekcji z rozcieńczonymi AONs i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. W międzyczasie usuń pożywkę z komórek i użyj świeżej pożywki do trzykrotnego umycia komórek. Następnie dodaj 0,8 mililitra pożywki do mieszaniny transfekcji, a następnie dodaj cały roztwór do świeżo umytych komórek.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie dodaj pożywkę różnicującą lub DM do komórek i inkubuj przez okres do 10 dni, aby nastąpiło różnicowanie. Zaczynając od trzeciego dnia, sprawdź zróżnicowanie.
Aby przeprowadzić transfekcję morfoliny mioblastów psów, należy przeprowadzić hodowlę mioblastów CXMD, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Podgrzej koktajl morpholinos w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj odczynnik do dostarczania peptydów i dostosuj morfolino do końcowego stężenia od trzech do sześciu mikromolów.
Następnie użyj DM, aby zastąpić pożywkę w mioblastach i dodaj morfolino do każdej studzienki w końcowym stężeniu jednego mikromola. Inkubować przez 16 do 18 godzin. Następnie, aby zebrać komórki do ekstrakcji RNA, dodaj jeden mililitr tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu do komórek, aby oderwać je od płytki.
Po inkubacji komórek w temperaturze pokojowej przez 10 minut przenieś komórki do 1,5-mililitrowych probówek. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aż będą widoczne trzy oddzielne warstwy: warstwa RNA, warstwa białka i warstwa DNA. Wirować do probówek w temperaturze 12 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.
Następnie usuń wierzchnią warstwę supernatantu i przenieś do probówki zawierającej 500 mikrolitrów izopropanolu. Zakręć probówkami supernatantu przed usunięciem supernatantu i uratowaniem osadu RNA. Użyj etanolu do umycia osadu i odwiruj w temperaturze 8 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Odwróć rurkę na 15 minut, aby odparować pozostały etanol przed dodaniem 15 do 30 mikrolitrów wody wolnej od RNaz. Następnie użyj spektroskopii UV-Vis przy 260 nanometrach, aby określić ilościowo RNA. Aby przeprowadzić RT-PCR, wymieszaj ze sobą następujące odczynniki i dodaj wodę do końcowej objętości 25 mikrolitrów.
Umieść próbki w termocyklerze i uruchom następujący program. Po zakończeniu cyklu przechowuj produkt w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub 20 stopni Celsjusza. Aby wykonać wstrzyknięcie domięśniowe, po przygotowaniu zwierzęcia do zabiegu i znieczuleniu go zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą skalpela przeciąć skórę około pięciu centymetrów wzdłuż kości piszczelowej czaszki lub CT.To oznaczyć miejsca wstrzyknięcia, użyć igły chirurgicznej i nici chirurgicznej do zszycia powięzi głębokiej, wykonując dwa znaczniki ściegu w odstępach dwucentymetrowych.
Bardzo ważne jest, aby oznaczyć miejsce wstrzyknięcia nitką, ponieważ pozwala to na dokładniejsze wykonanie biopsji. Następnie, za pomocą igły o rozmiarze 27G, wstrzyknij pożądane stężenie AONs do mięśnia i pozostaw igłę na jedną minutę. Następnie, aby wykonać otwartą biopsję mięśnia, użyj skalpela chirurgicznego, aby usunąć kawałek tkanki mięśniowej o długości około dwóch centymetrów z mięśnia CT.
Połóż powięź mięśniową z powrotem na mięśniu i użyj wchłanialnej nici 000, aby zamknąć tkankę. Następnie użyj nylonowej nici 000, aby zamknąć skórę. Za pomocą igły podać domięśniowo wstrzyknięcie 0,02 miligrama na kilogram chlorowodorku buprenorfiny.
Aby wstrzyknąć koktajl zawierający równe ilości każdego AON do żyły kończyny, trzymając zwierzę zgodnie z protokołem tekstowym, należy wprowadzić igłę żylną do żyły kończyny. Za pomocą pompy infuzyjnej lub sterownika strzykawkowego wstrzyknąć łącznie 50 mililitrów w tempie 2,5 mililitra na minutę przez 20 minut, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Powtarzaj wstrzyknięcia co tydzień lub co dwa tygodnie, ponieważ ekspresja dystrofiny będzie się kumulować przy wielokrotnych wstrzyknięciach.
Aby wykonać cotygodniowe badania krwi w celu zbadania toksyczności, użyj igły, aby pobrać trzy mililitry krwi z jednej z żył podskórnych kończyny przedniej lub tylnej. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, uwzględnij następujące oceny. Przeprowadzić dalsze analizy zgodnie z protokołem tekstowym.
Mioblasty transfekowano różnymi warunkami leczenia 2'OMePS w celu porównania skuteczności każdego AON. Pokazany tutaj żel reprezentuje próbki RT-PCR z RNA pobrane cztery dni po zabiegu. Pasma znajdujące się wyżej na żelu reprezentują produkty DMD poza ramką i były obserwowane w nieleczonych mioblastach traktowanych Ex8A i Ex8B.
Ex6A, Ex6B, Ex8A i mioblasty potraktowane koktajlem wykazały produkty w ramce. Sekwencjonowanie cDNA potwierdziło, że ekson od 6 do 9 został pominięty. Jak widać na tym rysunku, immunocytochemia wykazała, że komórki psa leczone AON miały zwiększoną zawartość włókien dystrofiny dodatniej w porównaniu z próbkami nieleczonymi.
Aby porównać skuteczność różnych warunków leczenia AEN, psom CXMD wstrzyknięto Ex6A lub koktajl Ex6A, Ex6B i Ex8A w różnych dawkach. Próbki mięśni barwione pod kątem DYS1 wykazują wzrost ekspresji dystrofiny w próbkach traktowanych koktajlami, a włókna dodatnie dystrofiny zwiększają się wraz z dawką dystrofiny. Po wstrzyknięciach ogólnoustrojowych psy z CXMD leczone koktajlem wykazywały zwiększoną ekspresję dystrofiny w porównaniu z psami z NT CXMD, zarówno w próbkach CT, jak i mięśnia sercowego.
Jednak mięśnie szkieletowe leczone AON wykazywały znacznie wyższą ekspresję dystrofiny w porównaniu z leczonym mięśniem sercowym. Ponadto leczone psy z CXMD wykazały poprawę histopatologii ze znacznym spadkiem włókien jądrowych centralnie w porównaniu z psami z NT CXMD. Po opanowaniu, zarówno eksperymenty in vitro, jak i in vivo można przeprowadzić w ciągu kilku godzin, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie monitorować stan zdrowia psa. Po jego opracowaniu, ogólnoustrojowe pomijanie eksonów utorowało drogę naukowcom w tej dziedzinie do rozpoczęcia badań klinicznych na ludziach u pacjentów z DMD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak leczyć psy oligonukleotydami antysensownymi.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje skuteczność i toksyczność pomijania wielu eksonów z wykorzystaniem koktajlu oligonukleotydów antysensownych (AON) w psim modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Wyniki wykazują systemowe przywrócenie ekspresji dystrofiny, co podkreśla potencjał tej metody terapeutycznej dla pacjentów z DMD.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Terapia genowa
- Dystrofia mięśniowa
Wstęp
- Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężkim zaburzeniem genetycznym.
- Pomijanie eksonów (exon skipping) stanowi obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu DMD.
- Koktajle AON mogą indukować pomijanie wielu eksonów.
- Wykorzystanie modelu psiego pozwala na lepszą ekstrapolację wyników na pacjentów ludzkich.
Cel badania
- Ocena skuteczności pomijania wielu eksonów w modelu dużego zwierzęcia.
- Ocena potencjalnej toksyczności AON w warunkach in vivo.
- Zbadanie możliwości zastosowania pomijania eksonów w innych chorobach genetycznych.
Zastosowane metody
- Transfekcja mioblastów CXMD za pomocą AON z wykorzystaniem liposomów kationowych.
- Podawanie AON in vivo poprzez wtryskiwanie domięśniowe i infuzję żylną.
- Ekstrakcja RNA i RT-PCR w celu analizy ekspresji dystrofiny.
- Cotygodniowe badania krwi w celu monitorowania toksyczności w modelu psim.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja pominięcia wielu egzonów w potraktowanych mioblastach.
- Obserwowane systemiczne przywrócenie ekspresji dystrofiny w modelu psim.
- Wykazanie wykonalności terapii AON w DMD.
- Brak istotnej toksyczności u potraktowanych zwierząt.
Wnioski
- Pomijanie wielu eksonów z wykorzystaniem AON jest realną strategią terapeutyczną w przypadku DMD.
- Wyniki wspierają dalsze badania kliniczne u pacjentów.
- Podejście to może przynieść korzyści również w innych genetycznych zaburzeniach mięśniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Pomijanie wielu eksonów z wykorzystaniem koktajlu oligonukleotydów antysensownych (AONs) w psim modelu dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X wypełnia krytyczną lukę translacyjną w rozwoju terapii dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Podejście to umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez dotyczących systemowej skuteczności i bezpieczeństwa w modelu dużego zwierzęcia, co bezpośrednio wpływa na pewność predykcyjną i rozwój portfolio terapeutyków opartych na pomijaniu eksonów. Metoda ta wspiera strategiczne podejmowanie decyzji na styku walidacji celu i redukcji ryzyka przedklinicznego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących pomijania wielu eksonów w systemie istotnym dla danej choroby.
- Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez przywrócenie ekspresji dystrofiny w modelu dużego zwierzęcia.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do translacji na pacjentów z DMD.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy biologiczne do ilościowej oceny skuteczności pomijania eksonów.
- Ułatwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki odczytom z RT-PCR oraz immunocytochemii.
- Umożliwia wiarygodne porównanie koktajli AON oraz pojedynczych terapii AON w celu dalszego przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biomarkerami istotnymi dla choroby poprzez ilościowe określenie stopnia przywrócenia dystrofiny w mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym.
- Zapewnia ciągłość od walidacji in vitro do systemowego podania in vivo oraz oceny bezpieczeństwa.
- Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile skuteczności i toksyczności w modelu translacyjnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji związku wiodącego oraz walidacji przedklinicznej, umożliwiając testowanie skuteczności i bezpieczeństwa pomijania wielu eksonów w modelu dużego zwierzęcia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących pomijania wielu eksonów i wyjaśnia mechanizmy biologiczne przywracania dystrofiny.
- Przesiewanie: Dostarcza wyników ilościowego RT-PCR i immunobarwienia w celu odtwarzalnej oceny skuteczności.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie warunków leczenia oraz zależności między dawką a odpowiedzią.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z gotowością do badań klinicznych poprzez wykazanie systemowej poprawy w modelu istotnym dla danej choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia reużywalny schemat postępowania w celu oceny koktajli oligosyntezy antysensownej w różnych modelach chorób genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w strategiach pomijania eksonów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły oceny skuteczności i toksyczności in vitro oraz in vivo.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji go/no-go oraz alokacji kapitału w programach pomijania wielu eksonów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na oligonukleotydy antysensowne dla DMD i wskazań pokrewnych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej, pracy ze zwierzętami oraz projektowania oligosuklinukleotydów antysensownych.
- Wymaga dostępu do RT-PCR, immunocytochemii oraz infrastruktury do przeprowadzania operacji na zwierzętach.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych pomiarów skuteczności i toksyczności.
- Adaptacja do innych modeli genetycznych może wymagać optymalizacji protokołu pod kątem docelowych eksonów i dróg podania.
- Uważne monitorowanie stanu zdrowia oraz nadzór etyczny są niezbędne w badaniach na dużych zwierzętach.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts
2:59
Morpholino Transfection of Dog Myoblasts and RNA Extraction
5:18
Intramuscular Injections or Open Muscle Biopsy
6:42
Systemic Injections
7:39
Results: Multi-exon Skipping Using Antisense Oligonucleotides in the Dystrophin Gene in Dogs
9:37
Conclusion
