Name: Wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli PilG u Xylella fastidiosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji ruchliwości drgań Xylella fastidiosa za pomocą nano-mikrofluidycznej komory przepływowej. Technika ta umożliwia szczegółową obserwację ruchu bakterii i charakteryzację genów odpowiedzialnych za patogeniczność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służbę Badań Rolniczych. Nazwy handlowe lub produkty handlowe w tej publikacji są wymienione wyłącznie w celu dostarczenia konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

1. Peryferyjne obrzeża kolonii bakteryjnej
<ol>
	<li>Hoduj X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type22, mutant delecji pilG XfΔpliG (przy użyciu wcześniej opisanej strategii delecji23) i jego komplementarny XfΔpliG-C (przy użyciu wcześniej opisanej strategii komplementacji genetycznej opartej na chromosomach24) na płytkach agarowych PD225 w temperaturze 28 °C przez 5-7 dni.</li>
	<li>Celuofan (1 x 1 cm2) należy umieścić w autoklawie w wodzie o temperaturze 121 °C (249 °F) przez 15 minut. Podnieś jeden kawałek celofanu, spuść wodę, dotykając jednego rogu celofanu na pustej szalce Petriego, ostrożnie połóż celofan na 15% powierzchni agaru i wysusz na powietrzu.</li>
	<li>Zbieraj pojedyncze kolonie X. fastidiosa za pomocą sterylnych, zaokrąglonych wykałaczek i aseptycznie umieszczaj komórki na wysterylizowanym arkuszu celofanu nałożonym na 15% powierzchni agaru w płytkach agarowych. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Zbadaj morfologię krawędzi kolonii za pomocą mikroskopu preparacyjnego z soczewką obiektywową 2X i soczewką okularową 10X. Sfotografuj peryferyjne obrzeża wokół kolonii.</li>
</ol>
2. Mikroskopia i mikroprzepływowe komory przepływowe
<ol>
	<li>Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych przy użyciu procedur fotolitograficznych podobnych do wcześniej opisanych5,18. Zaprojektuj cztery równoległe kanały za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo na głównej płytce krzemowej przy użyciu standardowych metod litograficznych26.</li>
	<li>Stwórz komory mikroprzepływowe z wzorca wafli krzemowych z polidimetylosiloksanem (PDMS). Wlać niespolimeryzowany PDMS na wafel krzemowy i utwardzić go w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę. Odklej replikę PDMS od wzorca wafli i przytnij replikę PDMS ostrzem do rozmiaru 22 mm x 40 mm takiego samego rozmiaru jak szklane szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Wystaw replikę PDMS, szklane szkiełko nakrywkowe (22 x 40 mm2) i szkiełko mikroskopowe (51 x 76 mm2) na działanie plazmy powietrznej o mocy 30 W przez 2 minuty27. Umieść korpus PDMS między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a szklanym mikroskopem, aby zbudować komorę mikroprzepływową.</li>
	<li>Wywierć otwór (o średnicy 5.5 mm) przez PDMS na każdym końcu kanału z wzorem. Pokrój rurkę z gumy silikonowej na długość 12-20 cm. Włóż jeden koniec rurki z gumy silikonowej (średnica zewnętrzna 5,1 mm, średnica wewnętrzna 2,1 mm, ścianka 0,8 mm) do każdego końca kanałów repliki PDMS i uszczelnij go niespolimeryzowanym PDMS w temperaturze 60 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Podłącz drugi koniec rurki do kolczastego końca plastikowych złączy luer. Zmontowane komory mikroprzepływowe owinąć folią aluminiową i sterylizować w autoklawie przez 20 min.</li>
	<li>Zebrać komórki bakteryjne typu dzikiego X. fastidiosa, zmutowanego XfΔpliG i komplementarnego XfΔpliG-C poprzez skrobanie, używając jednorazowych pętli zaszczepiających z płytek pożywki PD2. Dostosuj gęstość komórek do gęstości optycznej 0,05 przy 600 nm w bulionie PD2, jak opisano wcześniej23. Zebrać roztwór komórek bakteryjnych do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zamontuj urządzenie mikroprzepływowe na odwróconym stoliku mikroskopowym. Podłączyć rurkę wlotową do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej bulion PD2. Dopasować strzykawkę gazoszczelną o pojemności 5 ml do pompek strzykawkowych.</li>
	<li>Podłącz rurkę wylotową do zbiornika na odpady. Utrzymuj natężenie przepływu medium na poziomie 0,2 μl min-1 przez 30 minut, aby ustabilizować system.</li>
	<li>Podłączyć rurki z bocznym wlotem do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej roztwór komórek bakteryjnych. Przepłucz roztwór komórek bakteryjnych przez gumową rurkę, aż dojdziesz do kanału. Utrzymuj natężenie przepływu medium wynoszące 0,2 μl min-1 przez kolejne 30 minut, aby wypłukać niezwiązane komórki z komory przed pobraniem obrazu.</li>
	<li>Zamontuj migawkę mikroskopu pod częścią mikroskopu dostosowaną do pola widzenia, aby kontrolować światło. Podłącz roletę do systemu sterowania migawką i podłącz system sterowania migawką do komputera.</li>
	<li>Zamontuj kamerę cyfrową do portu wideo mikroskopu i podłącz ją do komputera. Uruchom oprogramowanie do nagrywania poklatkowego, wybierz z menu funkcję "migawka" i automatycznie rozpoznaj zainstalowaną migawkę jako domyślną w oprogramowaniu, aby nawiązać połączenia z migawką za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Wybierz funkcję "aparat cyfrowy" z menu oprogramowania do nagrywania poklatkowego, aby automatycznie rozpoznać aparat cyfrowy jako domyślne urządzenie przechwytujące w oprogramowaniu i nawiązać komunikację z aparatem cyfrowym za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Zlokalizuj komórki bakteryjne w jednym z kanałów za pomocą optyki z kontrastem fazowym 20x, a następnie przełącz się na soczewkę obiektywu 40x przed zarejestrowaniem obrazu.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do nagrywania poklatkowego, wybierz z menu funkcję "akwizycja obrazu" przy użyciu parametrów domyślnych, aby uzyskać obrazy z mikroskopu. Następnie otwórz funkcję "Acquire time-lapse" i ustaw przedział czasowy na 30 sekund5,18,28 na czas 6-24 godzin, w zależności od eksperymentu potrzebnego do zaobserwowania ruchliwości drgań X. fastidiosa5,18,28. Kliknij "OK", aby rozpocząć nagrywanie poklatkowe. Kliknij "Funkcja stosu" z menu, wybierz "zapisz jako", aby ułożyć obrazy w folderze docelowym na komputerze po zakończeniu nagrywania.</li>
	<li>W przypadku wielu kanałów rejestruj obrazy poklatkowe z pierwszego kanału co 30 sekund przez 6 godzin. Przesuń soczewkę obiektywu mikroskopu do następnego kanału, aby zlokalizować komórki docelowe. Powtórz funkcję poklatkową, jak opisano powyżej, aby sekwencyjnie przechwytywać obrazy w każdym z czterech kanałów, jeśli eksperyment jest skonfigurowany do wykorzystania czterech kanałów. Kontynuuj robienie zdjęcia poklatkowego nawet przez trzy kolejne dni. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w temperaturze pokojowej (23 ± 2 °C).</li>
	<li>Skompiluj obrazy poklatkowe do pliku wideo za pomocą oprogramowania do obrazowania poklatkowego. Uruchom oprogramowanie do nagrywania poklatkowego, kliknij "Funkcja stosu" w menu i wybierz "otwórz funkcję stosu", aby otworzyć stos files z komputera.</li>
	<li>Uruchom funkcję "Make movie" z modułu stosu, zaznaczając wszystkie obrazy i wybierając format wyjściowy "AVI". Kliknij "zapisz jako", aby zapisać plik wideo w folderze docelowym na komputerze.</li>
	<li>Wybierz skompilowane filmy z folderu docelowego na komputerze i odtwórz je. Następnie obserwuj ruchliwość pojedynczych komórek poprzez wynikową wizualizację drgającej aktywności ruchliwości komórek bakteryjnych w wygenerowanych plikach wideo.</li>
</ol>

<ol><li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li>
<li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%2C+a+regional+problem+or+global+threat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li>
<li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%3A+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li>
<li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+and+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility%2C+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li>
<li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li>
<li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li>
<li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li>
<li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+%27stick-and-roll%27+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion%2C+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li>
<li>Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).</li>
<li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li>
<li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li>
<li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li>
<li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Operon%2C+Pil-Chp%2C+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li>
<li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemoreceptors%3A+High-performance+signaling+in+networked+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li>
<li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li>
<li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa%3A+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li>
<li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li>
<li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+Media+for+the+Pierce%27s+Disease+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-%28dimethylsiloxane%29+and+their+chemical+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li>
<li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym badaniu scharakteryzowaliśmy zachowanie ruchowe mutanta X. fastidiosa PilG XfΔpilG i jego komplementarnych szczepów XfΔpilG-C w nowo zaprojektowanych wielokanałowych równoległych nanokanałowych komorach mikroprzepływowych. Nowo zaprojektowane komory mikroprzepływowe mogą mieć do czterech równoległych komór o szerokości nanokanału 100 μm, w porównaniu z wcześniejszymi konstrukcjami z tylko jednym kanałem o szerokości 50 μm18. Ulepszony, szerszy nanokanał ułatwi...

Xylella fastidiosa to Gram-ujemna, niewiciowa, patogenna bakteria, która powoduje szereg ważnych ekonomicznie chorób upraw, w tym chorobę Pierce'a u winorośli (Vitis vinifera L.)1,2, 3. Bakteria ta jest ograniczona do naczyń ksylemu przewodzących wodę. Zakażenie winorośli powoduje zablokowanie naczyń ksylemu i powoduje stres wodny oraz niedobory żywieniowe3. Udana kolonizacja zależy od zdolności bakterii do przemieszczania się z początkowego miejsca infekcji do reszty rośliny3. Ruchliwość drgań jest sposobem niezależnego od wici ruchu bakterii poprzez rozciąganie, przyczepianie i chowanie polarnych pili IV typu4, które zostały scharakteryzowane u X. fastidiosa5,6,7.
Ruchliwość drgań została zaobserwowana za pomocą pęsety laserowej i mikroskopii sił atomowych (AFM) 8,9,10. Stosując te techniki, drgające ruchy generowane przez pilus typu IV N. gonorrhoeae i P. aeruginosa charakteryzowano poprzez fluorescencyjne znakowanie pilusów i mikroskopijne rejestrowanie ich ruchów. Chociaż obie metody szczegółowo opisują siłę adhezyjną poszczególnych bakterii, procedury są skomplikowane i czasochłonne9,10. Komory mikroprzepływowe wykorzystano do obserwacji długodystansowej migracji pojedynczych komórek, a także małych agregatów komórek bakteryjnych5,6. Komory te zostały zaprojektowane jako mikrofabrykowany nano-kanał w płytce zintegrowanej z systemem rejestracji obrazu poklatkowego11,12,13,14. Urządzenia z komorami mikroprzepływowymi oferują kilka korzyści w badaniu zachowania ruchowego i interakcji komórka-komórka bakterii: (i) zapewniają zintegrowaną platformę z możliwością korzystania z wielu kanałów; (ii) może badać ruchy i agregacje pojedynczych komórek w nanoskalowych cechach bakterii; (iii) umożliwia bezpośrednią rejestrację obrazów mikroskopowych komórek bakteryjnych i analizę poklatkową, (iv) zapewnia długoterminowe obserwacje przestrzenne i czasowe poszczególnych i/lub populacji bakterii w mikrośrodowisku; (v) natężenie przepływu pożywki hodowlanej w kanale może być precyzyjnie kontrolowane i (vi) do każdego doświadczenia wymagana jest tylko bardzo mała objętość (1 ml) pożywki hodowlanej.
Ostatnio, system przepływu mikroprzepływowego został wykorzystany do badania zachowań komórek bakteryjnych w różnych mikrośrodowiskach 14,15,16. Przyczepność i przyczepność powierzchniową E. coli15, X. fastidiosa16 i Acidovorax citrulli14 do powierzchni szklanych oceniano za pomocą komór mikroprzepływowych. Analizowano agregację i tworzenie biofilmu, w którym pośredniczą pilusy typu IV Acidovorax citrulli 14. Co więcej, ruch A. citrulli obserwowany w warunkach przepływu wykazał, że pilus typu IV może odgrywać ważną rolę w kolonizacji i rozprzestrzenianiu się A. citrulli w naczyniach ksylemu w warunkach przepływu soków. Drgające ruchy komórek Pseudomonas aeruginosa i X. fastidiosa z powodzeniem zaobserwowano pod prądem płynu w mikroprefabrykowanej komorze przepływowej5,6,17. Stwierdzono, że mutanty pilB i pilQ X. fastidiosa z niedoborem pilusa typu IV głęboko zmieniają prędkość ruchliwości drgań w warunkach przepływu w urządzeniach mikroprzepływowych5,6,18. Badania przeprowadzone nad adhezją i ruchliwością bakterii w urządzeniach mikroprzepływowych wykazały, że komory mikroprzepływowe są szczególnie odpowiednie do analizy ruchliwości drgań i migracji bakterii za pośrednictwem pili in vitro. Wyniki te wyjaśniają mechanizm migracji za pośrednictwem drgawek, który ułatwia przyczepianie się do komórek, agregację i kolonizację w organizmie gospodarza, ostatecznie prowadząc do infekcji ogólnoustrojowej.
Operon Pil-Chp X. fastidiosa zawiera pilG, pilI, pilJ, pilL, chpB i chpC, które kodują ścieżki transdukcji sygnału20. Chemoreceptory transbłonowe wiążą bodźce chemiczne w domenie peryplazmatycznej i aktywują kaskadę sygnalizacyjną w swojej części cytoplazmatycznej, aby ostatecznie kontrolować ruchliwość drgań bakterii. W operonie Pil-Chp X. fastidiosa, białko fosfo-wahadłowe PilG jest homologiem CheY. U E. coli i P. aeruginosa CheY jest regulatorem odpowiedzi w systemach chemotaksji, które oddziałują z białkami motorycznymi wici19,21. Chociaż wkład operonu Pil-Chp w zjadliwość X. fastidiosa został niedawno zbadany20, rola pilG w operonie chemotaksji w odpowiedzi na sygnały środowiskowe i na regulowane/motoryczne pilusy typu IV X. fastidiosa jest niejasna. Aby wyjaśnić wgląd regulatora chemotaksji pilG w aktywność ruchliwości drgań X. fastidiosa, stosuje się komorę mikroprzepływową do oceny ruchliwości drgań X. fastidiosa. PilG X. fastidiosa charakteryzuje sięporównaniem fenotypów mutanta delecyjnego XfΔpliG, komplementarnego szczepu XfΔpliG -C i jego dzikiego typu in vitro. Wyniki podkreślają rolę pilG w ruchliwości drgań X. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>Biology materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</sup</td></tr><tr><td>>pilG mutant delecji Xf&Delta; pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., et al., 2007 26</td></tr><tr><td>pilG szczep komplementarny Xf&Delta; pliG-C&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., et al. 1998 23</td></tr><tr><td>Materiały fizyczne i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle inokulacyjne</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>procedury ilościowe, takie jak zbieranie bakterii</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 silikonowe zestawy elastomerowe</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 kamera cyfrowa</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Nagrywanie obrazu, wideo i pomiar&nbsp;</td></tr><tr><td>Linia rur</td><td>Edgewood, NY</td><td></td>#T4300 <td>Podłączona do strzykawki i komory mikroprzepływowej</td></tr><tr><td>Plastikowe złącza luer</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Podłączone do strzykawki i komory mikroprzepływowej</td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>Natężenie przepływu można regulować podczas pracy pompy.</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>gazoszczelne, Hemilton Company, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>Zapewnij płynący bulion</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Olympus IMT-2</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Obserwacja i rejestracja obrazu</td></tr><tr><td>Kamera cyfrowa SPOT-RT</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Nagrywanie obrazu, wideo i pomiar</td></tr><tr><td>Migawka mikroskopu</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>Kamera sterująca" s czas naświetlania</td></tr><tr><td>System sterowania migawką mikroskopu</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Jednokanałowy sterownik migawki zatwierdzony przez CE/UL/CSA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaMorph Image</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Przetwarzanie obrazu w super rozdzielczości w czasie rzeczywistym&nbsp;</td></tr></tbody></table>

wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli pilg u xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa to Gram-ujemna, niewiciowa bakteria, która powoduje szereg ważnych ekonomicznie chorób roślin. Ruchliwość drgań zapewnia X. fastidiosa środek do przemieszczania się i kolonizacji wewnątrz rośliny na duże odległości, przyczyniając się do patogenności X. fastidiosa. Ruchliwość drgań X. fastidiosa jest obsługiwana przez pilusy typu IV. Pilusy typu IV Xylella fastidiosa są regulowane przez pilG, regulator chemotaksji w operonach Pil-Chp kodujących białka, które są zaangażowane w szlaki transdukcji sygnału. Aby wyjaśnić rolę PilG w drgającej ruchliwości X. fastidiosa, opracowano mutant XfΔpilG z niedoborem pilG i jego komplementarny szczep XfΔpilG-C zawierający natywny PilG. Komory mikroprzepływowe zintegrowane z systemem rejestracji obrazu poklatkowego wykorzystano do obserwacji ruchliwości drgań w XfΔpilG, XfΔpilG-C i jego dzikim szczepie. Korzystając z tego systemu rejestracji, pozwala na długoterminowe obserwacje przestrzenne i czasowe agregacji, migracji pojedynczych komórek i populacji bakterii poprzez ruchliwość drgań. Szczep X. fastidiosa typu dzikiego i komplementarny XfΔpilG-C wykazywał typowe cechy ruchliwości drgań bezpośrednio obserwowane w mikroprzepływowych komorach przepływowych, podczas gdy zmutowany XfΔpliG wykazywał fenotyp z niedoborem drgań. Badanie to pokazuje, że pilG przyczynia się do drgań X. fastidiosa. Mikroprzepływowa komora przepływowa służy jako środek do obserwacji ruchliwości drgań.

Obecność obwodowej frędzli kolonii, wskazująca na ruch typu twitching motility zapośredniczony przez pilusy typu IV, zaobserwowano w koloniach szczepu dzikiego X. fastidiosa oraz komplementarnego szczepu XfΔpliG-C (Rysunek 1). Mutant XfΔpliG nie wykazywał jednak obecności frędzli wokół obwodu kolonii (Rysunek 1). Obrazowanie poklatkowe komórek bakteryjnych w nano-mikroprzepływowych komorach przepływowych wykazało, że ru...

W tym badaniu, nano-mikroprzepływowa komora przepływowa została wykorzystana do wizualizacji i funkcjonalnego scharakteryzowania drgań Xylella fastidiosa, bakterii wywołującej chorobę Pierce'a u winorośli.

Wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli PilG u Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Nadrzędnym celem niniejszego protokołu jest funkcjonalna charakterystyka genów odpowiedzialnych za ruch typu twitching u bakterii z wykorzystaniem nanomikrofluidycznej komory przepływowej zintegrowanej z systemem rejestracji obrazów time-lapse. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fenotypu bakterii i związanej z nim funkcji genów, takie jak ruch typu twitching u bakterii. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie precyzyjnej obserwacji w kontrolowanej temperaturze procesu migracji i agregacji pojedynczych komórek oraz populacji. Procedurę tę zaprezentuje dr Xiangyang Shi, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Stosując ustandaryzowaną strategię delecji, należy wyhodować dziki typ Temecula Xylella fastidiosa, mutanty z delecją pilG oraz szczep komplementacyjny, wszystko na płytkach agarowych z podłożem PD2. Bakterie należy inkubować w temperaturze 28

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Poznaj metodę wizualizacji ruchliwości drgań Xylella fastidiosa za pomocą nano-mikrofluidycznej komory przepływowej. Technika ta umożliwia szczegółową obserwację ruchu bakterii i charakteryzację genów odpowiedzialnych za patogeniczność.

Wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli PilG u Xylella fastidiosa

Przeglądaj więcej filmów