Name: Metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora i regulacji transkrypcji mysiego Bcrp1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora w mysim genie Bcrp1 przy użyciu analiz in silico i testów reporterowych z lucyferazą. Technika ta pozwala badać regulację ekspresji mRNA w różnych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta nagrodami Merit Review dla Douglasa D. Rossa i Arifa Hussaina z Departamentu Spraw Weteranów.

1. Przewidywanie in silico alternatywnych pierwszych eksonów Bcrp1 przy użyciu analizy BLAST bazy danych EST myszy
Uwaga: Ten protokół opisuje, jak przeszukiwać bazę danych znaczników sekwencji wyrażonej przez myszy (EST) w poszukiwaniu EST o podobieństwie sekwencji do eksonu 2 Bcrp1 (który zawiera miejsce rozpoczęcia translacji), a następnie jak wyrównać pasujące sekwencje EST do sekwencji genomowych, aby ustalić ich lokalizację w genie myszy Bcrp1 względem końca 5' eksonu Bcrp1 2.
<ol>
	<li>Uzyskaj sekwencję dla mysiego eksonu Bcrp1 2, wprowadzając identyfikator sekwencji referencyjnej mRNA (NM_011920.3) w oknie wyszukiwania przeglądarki Ensembl Genome Browser17, kliknij "GO". Na następnym ekranie wybierz sekwencję o pełnej długości (zawiera 16 eksonów):
	<ol>
		<li>Na następnym ekranie ("Wyświetlanie oparte na transkrypcji") wybierz "16 eksonów". Spowoduje to wyświetlenie ekranu zawierającego sekwencję wszystkich eksonów Bcrp1. Ekson 2 Bcrp1 będzie miał odczyt "5'-AAAGGC...TATCAA-3". Uzyskane wyniki będą podobne do tych pokazanych w odnośniku 18.</li>
		<li>Kliknij opcję "Pobierz sekwencję". Na następnym ekranie wybierz format FASTA, a następnie kliknij "Podgląd". Na następnym ekranie skopiuj sekwencję podglądu eksonu 2 do schowka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do strony głównej BLAST19 na stronie internetowej National Center for Biotechnology Information (NCBI)20.
	<ol>
		<li>Wybierz genom "Myszy". Wklej sekwencję eksonu 2 ze schowka do pola zapytania.</li>
		<li>Wybierz "EST" z listy rozwijanej bazy danych, zoptymalizuj pod kątem "bardzo podobnych sekwencji", a następnie wybierz "BLAST". Czas działania zajmie kilka minut. Po zakończeniu przebiegu BLAST pojawi się strona "Wyniki".</li>
		<li>Pod nagłówkiem "Opisy" na stronie "Wyniki" wybierz "WSZYSTKIE", następnie "Pobierz", a następnie "FASTA (pełna sekwencja)" z listy rozwijanej, a następnie wybierz "Kontynuuj". Pojawi się plik .txt; otwórz i skopiuj cały plik do schowka. Plik .txt zawiera sekwencje wszystkich EST o wysokim podobieństwie sekwencji do mysiego eksonu Bcrp1 exon2, ale nie ich położenie w stosunku do eksonu 2 w genie Bcrp1. 
		Uwaga: Analiza przeprowadzona 15 kwietnia 2015 r. zidentyfikowała 14 mysich EST, które pokrywały się z eksonem Bcrp1 2. Są one wymienione w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj lokalizację sekwencji EST, która znajduje się od 5' do eksonu 2 w genie Bcrp1. Mysi gen Bcrp1 znajduje się w chromosomie 6 contig NC_000072.6 (GI:372099104).
	<ol>
		<li>Na stronie głównej BLAST pod nagłówkiem "Specialized Blast" wybierz "Wyrównaj dwie (lub więcej) sekwencje za pomocą BLAST (bl2seq)".</li>
		<li>Wklej plik tekstowy ze schowka do pola zapytania i wprowadź 372099104 w polu sekwencji tematu. Zoptymalizuj pod kątem "bardzo podobnych sekwencji" w obszarze wyboru programu i uruchom BLAST.</li>
		<li>Gdy pojawi się okno wyników, wyświetl wyrównania graficznie, klikając "Grafika" w oknie "Wyrównania". Użyj strzałek w prawo i w lewo oraz powiększ, aby ustawić ostrość na Bcrp1/Abcg2 i wyrównaniach sekwencji.</li>
		<li>Zapisz wyrównania sekwencji: wybierz "WSZYSTKIE" w polu "Opisy", a następnie z listy rozwijanej "pobierz" wybierz "Tabela trafień (CSV)", a następnie kliknij "kontynuuj". Ten plik zawiera wyrównanie sekwencji eksonu 2 Bcrp1 i wyrównanie wszystkich sekwencji EST z podobieństwem sekwencji do eksonu Bcrp1 w stosunku do numeracji nukleotydów w kontigu chromosomu 6 myszy. Każda kompletna sekwencja EST może generować wiele wyrównań obejmujących obszary 5' i 3' do eksonu 2, w tym sekwencje nakładające się na ekson 2 Bcrp1.</li>
		<li>Ponieważ pozycja końca 5' eksonu 2 będzie odpowiadać nukleotydowi 58,655,638 w kontigu chromosomu 6, oznacz to jako +1, a następnie oblicz pozycję częściowych sekwencji każdego EST 5' do 58,655,638. Wyniki dla 14 EST podano w tabeli 1. 
		Uwaga: Uważaj, aby analizować sekwencje EST, które mają od 5' do +1 (tj. mają ujemną wartość nukleotydów) jako potencjalne pierwsze eksony. Na przykład w dwóch EST, które wyrównały się z eksonem 2 Bcrp1 pokazanym w tabeli 1 (AI647825 i AI664571), pozostała sekwencja wynosiła 3' do eksonu 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena alternatywnej funkcji promotora Bcrp1
<ol>
	<li>Projektowanie konstrukcji reporterowych dla promotorów Bcrp1 E1U, E1A, E1B i E1C 
	<ol>
		<li>Korzystając z sekwencji E1U uzyskanej z przeszukiwania bazy danych EST, oznacz pierwszy nukleotyd 5' E1U jako +1.</li>
		<li>Uzyskać klon sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) mysiego chromosomu 6, który zawiera sekwencję genu Bcrp1/Abcg2 i sekwencję co najmniej 100 kb przed genem Bcrp1/Abcg2 (patrz Wykaz materiałów i wyposażenia).
		<ol>
			<li>Zidentyfikuj odpowiedni wektor reporterowy, taki jak plazmid reporterowy lucyferazy pGL3-Basic.</li>
			<li>Określ wiele miejsc klonowania w wektorze reportera. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII i HindIII to miejsca endonukleazy restrykcyjnej w miejscu wielokrotnego klonowania wektora pGL3-Basic, w orientacji od 5' do 3'. 
			Uwaga: Sekwencja miejsc trawienia jest dostępna w katalogach produktów firm produkujących enzymy restrykcyjne.</li>
			<li>Zidentyfikuj wszystkie miejsca trawienia w eksonie E1U i regionie 2 kb 5' E1U za pomocą programów, takich jak DNA5. Zidentyfikuj co najmniej dwa miejsca mineralizacji w miejscu wielokrotnego klonowania pGL3-Basic, które nie zostały znalezione w E1U lub regionie nadrzędnym 2 kb. 
			Uwaga: Pamiętaj, aby wybrać miejsce ograniczenia wielu miejsc klonowania dla startera do przodu, który znajduje się przed tym, który został wybrany dla startera odwrotnego, aby upewnić się, że wkładka będzie we właściwej orientacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj startery do przodu i do tyłu do PCR, które zawierają sekwencje dla wybranych miejsc endonukleazy restrykcyjnej pGL3-zasadowej z wieloma miejscami klonowania, korzystając z komercyjnych usług syntezy genów/starterów lub oprogramowania do selekcji starterów (patrz Lista materiałów i sprzętu). Wybierz starter do przodu znajdujący się ~2 kb przed sekwencją E1U i starter odwrotny w sekwencji E1U. Startery użyte w poprzednich pracach autorów zawierały miejsce SacI w starterze do przodu i miejsce NheI w starterze odwrotnym i amplifikowały region genomu od około -1,906 do +64 z pierwszym nukleotydem 5' E1U określonym jako +1 (patrz krok 2.1.1 powyżej) i są podane w odnośniku 16.
		<ol>
			<li>PCR amplifikuje region genomowy E1U przy użyciu tych starterów, 0,01 do 1 μg BAC i głównej mieszanki PCR zawierającej polimerazy Taq o wysokiej wierności (patrz Wykaz materiałów i sprzętu) z denaturacją w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, a następnie 35 do 40 cykli PCR, z przedłużeniem w temperaturze 72 °C (2 min) oraz temperaturami wyżarzania i topnienia w oparciu o charakterystykę topnienia zastosowanych starterów. 
			Uwaga: Zastosowanie polimeraz Taq o wysokiej wierności jest niezbędne do sekwencjonowania regionów promotora o wysokiej zawartości GC. W przypadku stosowania dużych fragmentów genomowego DNA, takich jak BAC, jako matrycy, drugorzędowa struktura genomowego DNA może utrudniać wiązanie starterów PCR. Jeśli pojawi się ten problem, lepsze wyniki PCR można uzyskać, jeśli długa matryca genomowego DNA zostanie delikatnie ścięta przez sonikację przed reakcją PCR.</li>
			<li>Sprawdź długość amplifikowanego produktu PCR, porównując z drabinką DNA o wielkości 1 kb przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym 0,8% TAE.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trawić otrzymany produkt PCR i wektor pGL3-Basic, używając endonukleaz restrykcyjnych specyficznych dla miejsc trawienia restrykcyjnego, wprowadzonych do starterów do przodu i do tyłu, zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z enzymami trawienia restrykcyjnego.
		<ol>
			<li>Oczyść reakcje trawienia za pomocą komercyjnego żelu SV i zestawu PCR Clean-Up Systems (patrz Lista materiałów i sprzętu), zgodnie z protokołemzestawu 21.
			<ol>
				<li>Sprawdź trawienie i linearyzację wektora, porównując go z nieoszlifowanym wektorem za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie przeciąć i oczyścić strawione pasmo DNA wektora. Zmierzyć stężenie oczyszczonego produktu PCR i oczyszczonego wektora za pomocą spektrometrii UV (patrz Wykaz materiałów i sprzętu).</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować konstrukt reporterowy E1U poprzez ligację oczyszczonego, trawionego enzymem restrykcyjnym produktu PCR i wektora reporterowego lucyferazy świetlika pGL3-Basic (zawartego w zestawie do oznaczania reporterowego; patrz wykaz materiałów i wyposażenia) przy wstawieniu: proporcje wektorów 11, 21 i 31, używając "zestawu do szybkiej ligacji ligazy DNA T4" zgodnie z instrukcją zestawu22, w ten sposób powstał konstrukt reporterowy E1U, nazwany pGL3-E1U.
		<ol>
			<li>Użyj plazmidu pGL3-E1U, aby przekształcić bakterie w klonalnie rozszerzający się pGL3-E1U, postępując zgodnie z instrukcjami w zestawie do klonowania TA (patrz Lista materiałów i sprzętu).</li>
			<li>Potwierdź orientację i wierność wkładki za pomocą analizy sekwencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj konstrukcje reporterowe dla E1A, E1B i E1C przy użyciu podobnej metodologii jak dla E1U. Potwierdzić wierność wkładek poprzez sekwencjonowanie jak w sekcji 2.1.5.2. 
		Uwaga: Insercje promotora dla E1A, E1B i E1C powinny wynosić około −1,875/+10, −1,847/+60 i −1,904/+83 w stosunku do pierwszego nukleotydu 5' (oznaczonego jako +1) odpowiednio E1A, E1B lub E1C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metody oznaczania reporterowego 
	Uwaga: Ogólna strategia testów reporterowych: przypuszczalny promotor (region 5' w górę) genu jest wstawiany do miejsca wielokrotnego klonowania pustego wektora "reporterowego", który zawiera "gen reporterowy" (np. lucyferazę świetlika) poniżej miejsca klonowania wielokrotnego. Wektor jest następnie transfekowany do komórek eukariotycznych, które wyrażają interesujący nas gen. Czynniki transakcyjne, które promują ekspresję genu zainteresowania w tych komórkach, powinny aktywować promotor w transfekowanym wektorze reporterowym, powodując ekspresję lucyferazy świetlika, którą można łatwo określić ilościowo za pomocą testu luminescencji.
	<ol>
		<li>Wybierz odpowiednią linię komórkową, która ma być używana w teście reporterowym. 
		Uwaga: Aby ocenić aktywność alternatywnego konstruktu reporterowego promotora E1U, konieczne jest transfekcję tego konstruktu do komórek, które wyrażają Bcrp1 pod kontrolą promotora E1U. Mysia linia komórkowa Sertoliego TM4 (patrz Lista materiałów i sprzętu) wykazuje ekspresję białka Bcrp1 i mRNA Bcrp1 zawierającego E1U, a także E1A, E1B i E1C5. Jako kontrolę negatywną rozważ użycie linii komórkowej, która nie wykazuje ekspresji białka Bcrp1 ani mRNA.</li>
		<li>Hodowla komórek TM4 na 24-dołkowych płytkach o początkowej gęstości 200 000 komórek/basenik w mieszaninie 1:1 pożywki F12 Ham's i modyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco z 1,2 g/l wodorowęglanu sodu, 15 mM HEPES uzupełnionych 5% surowicą końską, 2,5% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 j.m./ml), i streptomycyny (100 μg/ml), w temperaturze 37 °C, 5% CO2, jak opisano wcześniej5.</li>
		<li>Sześć godzin po umieszczeniu komórek w hodowli, transfekować komórki konstruktem delecji 0,2 μg pustego wektora zasadowego pGL3 lub 0,2 μg wektora pGL3 zawierającego −1,906/+64 E1U lub −1,875/+10 E1A lub −1,847/+60 E1B lub −1,904/+83 E1C Bcrp1 konstruktem delecji wraz z 4 ng pRL-TK (wektor eksprymujący lucyferazy Renilla) jako kontrola wewnętrzna, przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do transfekcji DNA i protokołuproducenta 23 (patrz Wykaz materiałów i sprzętu).</li>
		<li>30 godzin po transfekcji usunąć pożywkę wzrostową z hodowanych transfekowanych komórek. Umyj komórki raz 200 μl PBS, a następnie usuń roztwór myjący.
		<ol>
			<li>Zmierz aktywność lucyferazy świetlika i Renilla za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołami producenta24.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyraź aktywność dla każdej probówki jako stosunek aktywności lucyferazy świetlika podzielony przez kontrolę wewnętrzną (Renilla luciferase); ogólne wyniki są zwykle wyrażane jako aktywność każdego konstruktu reporterowego w stosunku do aktywności komórek transfekowanych pustym wektorem podstawowym pGL3, któremu podaje się wartość 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+transcriptional+modulation%3A+large-scale+identification+and+characterization+of+putative+alternative+promoters+of+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes.</a> Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Doyle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidrug+resistance+transporter+from+human+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).</li>
<li>Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+breast+cancer+resistance+protein+%28BCRP%2FABCG2%29+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance.</a> Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).</li>
<li>Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+resistance+protein+%28Bcrp%29+and+the+testis--an+unexpected+turn+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events.</a> Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcrp1+transcription+in+mouse+testis+is+controlled+by+a+promoter+upstream+of+a+novel+first+exon+%28E1U%29+regulated+by+steroidogenic+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).</li>
<li>Maliepaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+distribution+of+the+breast+cancer+resistance+protein+transporter+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues.</a> Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).</li>
<li>Fetsch, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+ABCG2+mitoxantrone+resistance-associated+protein+in+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues.</a> Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+breast+cancer+resistance+protein+in+microvessel+endothelium+of+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain.</a> Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).</li>
<li>Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+ABCB1+and+ABCG2+in+human+placental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue.</a> Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).</li>
<li>Xiong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2+is+upregulated+in+Alzheimer%27s+brain+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+may+act+as+a+gatekeeper+at+the+blood-brain+barrier+for+Abeta%281-40%29+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides.</a> J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).</li>
<li>Woodward, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+urate+transporter%2C+ABCG2%2C+with+a+common+functional+polymorphism+causing+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).</li>
<li>Huls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+resistance+protein+transporter+ABCG2+is+expressed+in+the+human+kidney+proximal+tubule+apical+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane.</a> Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+5%27+untranslated+region+variants+of+BCRP+mRNA+are+differentially+expressed+in+drug-selected+cancer+cells+and+in+normal+human+tissues%3A+implications+for+drug+resistance%2C+tissue-specific+expression%2C+and+alternative+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage.</a> Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).</li>
<li>Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+alternative+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by alternative promoters.</a> FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).</li>
<li>Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mouse+Abcg2+mRNA+during+hematopoiesis+is+regulated+by+alternative+use+of+multiple+leader+exons+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).</li>
<li>Natarajan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+major+alternative+promoter+regulating+Bcrp1%2FAbcg2+expression+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine.</a> Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).</li>
<li>Ensembl Genome Browser. , 
 <a target="_blank" href="http://Ensembl.org">http://Ensembl.org</a> (2015).</li>
<li>Transcript-based Display from Ensembl. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822">http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822</a> (2015).</li>
<li>Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , 
 <a target="_blank" href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome</a> (2015).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information (NCBI). , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov">http://www.ncbi.nlm.nih.gov</a> (2015).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wizard%C2%AE+SV+Gel+and+PCR+Clean-Up+System+-+INSTRUCTIONS+FOR+USE+OF+PRODUCT%22">Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT</a>. , (2009).</li>
<li>New_England_Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Ligation+Kit+Protocol+-+M2200S%22">Quick Ligation Kit Protocol - M2200S</a>. , (2014).</li>
<li>Roche. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XtremeGENE+HP+DNA+Transfection+Reagent+Protocol+-+Manual+version+1.0%29%22">XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0)</a>. , (2010).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Protocol+for+the+use+of+the+Dual-Luciferase+Reporter+Assay%22">Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay</a>. , (2009).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>VanBuren, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+verification%2C+and+initial+annotation+of+the+NIA+mouse+7.4K+cDNA+clone+set%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set.</a> Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).</li>
<li>Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+subtraction%3A+two+approaches+to+facilitate+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery.</a> Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+mouse+transcriptome+based+on+functional+annotation+of+60%2C770+full-length+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs.</a> Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).</li>
<li>Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+controls%3A+the+role+of+alternative+promoters+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes.</a> Trends Genet. (11), 640-648 (2009).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross i University of Maryland w Baltimore posiadają prawa patentowe do BCRP u ludzi.

Większość zaprezentowanych metod i reprezentatywnych wyników opisano w poprzedniej pracy pt. "Transkrypcja Bcrp1 w jądrach myszy jest kontrolowana przez promotor przed nowym pierwszym eksonem (E1U) regulowanym przez czynnik steroidogenny-1", która została opublikowana w 2013 r.5. Oprócz reprezentatywnych wyników przedstawionych tutaj, poprzedni artykuł zawierał szacunki alternatywnego wykorzystania pierwszego eksonu przy użyciu metodologii 5'-RACE PCR i RT-PCR. Ponadto przeprowadzono identyfikację <em...

Ponad połowa ludzkich genów jest regulowana przez alternatywne promotory1. Każdy alternatywny promotor może zawierać elementy regulacyjne, które mogą różnić się od tych w innych alternatywnych promotorach. Promotor (promotory) stosowany w jednej tkance może różnić się od tych stosowanych w innej tkance. Na przykład, możliwe jest, że aktywacja danego szlaku sygnałowego może wyzwolić alternatywny promotor dla genu wykorzystywanego w jednej tkance, ale nie mieć wpływu ani tłumić oddzielnego alternatywnego promotora dla tego samego genu, który jest wykorzystywany w innej tkance.
Ekspresja genu Bcrp1 jest regulowana przez alternatywne promotory. Bcrp1 to mysi ortolog ludzkiego genu białka oporności na raka piersi (BCRP). BCRP jest transporterem kasetowym wiążącym ATP (ABC), formalnie oznaczonym jako ABCG2 2,3. Jako białko wierzchołkowej błony komórkowej, BCRP/Bcrp1 działa w celu wypływu szerokiej gamy substratów naturalnych i ksenobiotycznych 3,4. U ludzi i myszy BCRP / Bcrp1 ulega silnej ekspresji w farmakologicznie istotnych narządach, takich jak wątroba (kanały żółciowe), jelita i nerki, a także w narządach z barierą krew-tkanka, takich jak łożysko, mózg i jądra 2,5-12. Ekspresja BCRP/Bcrp1 w krwiotwórczych i innych komórkach macierzystych, w tym w nowotworowych komórkach macierzystych, może powodować oporność tych komórek na ksenobiotyki i chemioterapeutyki przeciwnowotworowe3.
We wczesnych pracach mających na celu zrozumienie regulacji ekspresji BCRP w normalnych i nowotworowych komórkach, przeprowadzono analizę 5' szybkiej amplifikacji końców cDNA (5'-RACE) mRNA BCRP w celu określenia jego dokładnego miejsca rozpoczęcia transkrypcji13. Nie tylko znaleziono wiele miejsc początkowych transkrypcji; Napotkano również trzy alternatywne formy pierwszego eksonu, który w BCRP jest nieprzetłumaczony. Te alternatywne pierwsze eksony – oznaczone jako E1a, E1b, E1c – ulegały różnej ekspresji w różnych tkankach ludzkich. Dwa dodatkowe warianty pierwszego eksonu zostały odkryte podczas przeszukiwania ludzkiej bazy danych EST przez BLAST przy użyciu drugiego eksonu BCRP13. Cztery dopasowania ujawniły pierwszy ekson >70 kb w górę od eksonu 2, które zostały oznaczone jako E1u; cztery inne dopasowania ujawniły mRNA BCRP, które całkowicie nie miały pierwszego eksonu, które zostały oznaczone jako E1-13. Obecność alternatywnych eksonów lidera jest uważana za przejaw użycia alternatywnych promotorów14.
U myszy opisano cztery alternatywne pierwsze eksony Bcrp1, które mogą odpowiadać alternatywnym promotorom, które regulują transkrypcję Bcrp1 w różnych tkankach myszy; te eksony/promotory są oznaczone jako E1U, E1A, E1B i E1C, i znajdują się w przybliżeniu 70, 58, 15 i 5 kb przed eksonem Bcrp1 2 5,15. Stwierdzono, że izoforma mRNA E1A jest dominująca w mysich krwiotwórczych komórkach macierzystych, sercu, płucach, śledzionie i mózgu, podczas gdy izoforma E1B ulegała ekspresji w jelicie myszy, komórkach wątroby płodu i erytroidalnych komórkach prekursorowych w szpiku kostnym 5,15. Wykazano, że promotor przed E1B jest głównym alternatywnym promotorem regulującym transkrypcję Bcrp1 w jelicie myszy, regulowanym przynajmniej częściowo, przez białko wiążące element odpowiedzi fosfocyklicznej AMP (p-CREB) i element odpowiedzi CREB unikalny dla tego alternatywnego promotora Bcrp116. Izoforma mRNA E1C ulega ekspresji głównie w dorosłej mysiej wątrobie i nerkach5. Izoforma E1U jest niewykrywalna w większości badanych tkanek, z wyjątkiem mysich jąder, gdzie jest dominującą izoformą o ekspresji5. Bcrp1 wyrażany w jądrach szczurów znajduje się zarówno w komórkach somatycznych (ścisłe połączenia śródbłonka, okołokanalikowe komórki mięśniowe i komórki Sertoliego), jak i rozrodczych (w śródbłonku nasienia, gdzie może chronić spermatydy w późnym stadium4). Region przed E1U zawiera funkcjonalny element odpowiedzi na steroidogenny czynnik-1 (SF-1)5. MRNA i białko Bcrp1 są znacznie zmniejszone w jądrach myszy z nokautem SF-1 specyficznych dla komórek Sertoliego, co sugeruje, że ekspresja Bcrp1 w mysich komórkach Sertoliego jest kontrolowana przez SF-15.
Protokoły przedstawiły szczegółowe metody wykrywania alternatywnych pierwszych eksonów Bcrp1 in-silico, oraz ustanowienia opartych na lucyferazie testów reporterowych dla przypuszczalnych promotorów przed alternatywnymi pierwszymi zidentyfikowanymi eksonami.

<table><tr><tbody><td colspan="4">KOMERCYJNE MATERIAŁY I ZESTAWY BIOLOGICZNE:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE</td><td>kit Ambion Inc., Austin, TX, obecnie dostępny przez Life Technologies</td><td>Zestaw AM1700</td><td>5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TOPO TA</td> Life <td>Technologies</td><td>K450001</td><td>Ten zestaw zawiera TOP10 chemicznie kompetentnych bakterii E. coli.</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji ligazy DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart wysokiej wierności Taq- polimeraza DNA</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Zawiera wysokiej jakości mieszankę enzymów polimerazy Taq</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA XtremeGENE HP</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania podwójnej lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Zawiera pGL3-podstawowy pusty wektor reporterowy (lucyferaza świetlika), wektor ekspresji lucyferazy renilla pRLTK i inne wektory kontrolne.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Do miniprepu plazmidu - izolacja i oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych</td></tr><tr><td>Wektor pCR2.1</td><td>część zestawu</td><td></td><td></td>do klonowania TOPO TA</tr><tr><td>pGL3-podstawowa lucyferazy zawierająca wektor</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Wektor eksprymujący lucyferazy Renilla</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczny chromosom bakteryjny</td><td>Centrum Zasobów BACPAC, dla dzieci s Szpital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 i RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI/CHEMIKALIA/MEDIA/MATERIAŁY</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; System czyszczenia żelem SV i PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Przydatny do oczyszczania produktów PCR po trawieniu z endonukleazami restrykcyjnymi</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>software Projekt Ensembl</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>W ramach projektu Ensembl tworzone są bazy danych genomów kręgowców i innych gatunków eukariotycznych, a informacje te są bezpłatnie udostępniane w internecie.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obróbki strumieniowo-ściernej</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Sieć& PAGE_TYPE=Oprogramowanie BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Przydatne do projektowania starterów do</td></tr><tr><td>bazy danych nukleotydów 5'-RACE PCR NCBI</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 mysie komórki Sertoliego</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&handel;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Jest to stosunkowo tani, ręcznie obsługiwany luminometr. Tego samego producenta dostępne są również zautomatyzowane systemy, które wykorzystują płytki 96-dołkowe.</td></tr><tr><td>Spektrofotometry NanoDrop</td><td>firmy Thermo Scientific, Inc.</td>Spektrofotometr <td>NanoDrop 2000</td><td>może wykorzystywać bardzo małe ilości próbki</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV / VIS DU 800 i oprogramowanie do analizy kwasów nukleinowych II</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora i regulacji transkrypcji mysiego bcrp1

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Ekspresja genów w różnych tkankach jest często kontrolowana przez alternatywne promotory, które skutkują syntezą mRNA z unikalnymi - zwykle nietranslowanymi - pierwszymi eksonami. Bcrp1 (Abcg2), mysi ortolog białka oporności na raka piersi transportera ABC (BCRP, ABCG2), ma co najmniej cztery alternatywne promotory, które są oznaczone przez odpowiadające im cztery alternatywne pierwsze wytworzone eksony: E1U, E1A, E1B i E1C. W niniejszym artykule przedstawiono protokoły in-silico w celu przewidywania alternatywnego użycia promotora dla Bcrp1. Ponadto opisano metody oznaczania reporterowego w celu wytworzenia konstruktów reporterowych dla alternatywnych promotorów oraz określenia funkcjonalności przypuszczalnych promotorów przed zidentyfikowanymi alternatywnymi pierwszymi eksonami.

Identyfikacja wykorzystania alternatywnych promotorów1 genu Bcrp w jądrach myszy poprzez analizę eksonów liderowych
Podczas przeszukiwania bazy danych EST w NCBI (kwiecień 2015) zgodnie z krokami opisanymi w Protokole 1, zidentyfikowane ESTs, które były ciągłe z końcem 5' eksonu 2 w mRNA Bcrp1 , przedstawiono w Tabeli 1, wraz z ich pozycją w DN...

Na przykładzie mysiego transportera ABC Bcrp1 (Abcg2) przedstawiono protokoły in-silico do wykrywania alternatywnego użycia promotorów w genach ulegających ekspresji w tkankach myszy oraz do oceny funkcjonalności alternatywnych promotorów zidentyfikowanych za pomocą testów reporterowych.

Metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora i regulacji transkrypcji mysiego Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Ogólnym celem tego zestawu protokołów jest wykrycie alternatywnych pierwszych egzonów w mRNA genu, takiego jak Bcrp1, oraz ustanowienie opartych na lucyferazie testów reporterowych dla domniemanych promotorów znajdujących się powyżej zidentyfikowanych alternatywnych pierwszych egzonów. Zastosowane metody in-silico mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transkrypcji i regulacji, takie jak sposób kontrolowania ekspresji mRNA w różnych tkankach. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie publicznie dostępnych danych genetycznych do identyfikacji alternatywnych pierwszych egzonów w mRNA badanego genu, co wskazuje na wykorzystanie alternatywnych promotorów.Niniejsza metoda przygotowania konstruktów reporterowych i przeprowadzania testów reporterowych może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regulacji genów, takie jak aktywność funkcjonalna domniemanych promotorów alternatywnych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy uzyskać sekwencję egzonu 2 genu Bcrp1 myszy, wpisując identyfikator referencyjnej sekwencji mRNA w oknie wyszukiwania przeglądarki genomu Ensembl, a następnie kliknąć Go. Następnie należy wybrać pełną sekwencję zawierającą 16 egzonów. Kliknij opcję Download sequence.Następnie wybierz format FASTA i kliknij Preview. Na następnym ekranie skopiuj podgląd sekwencji eksonu 2 do schowka. Przejdź do strony głównej BLAST w serwisie NCBI.Wybierz genom myszy (Mouse genome). Wklej z schowka sekwencję eksonu 2 do pola zapytania. Następnie z rozwijanej listy Database wybierz ESTs.Zoptymalizuj ustawienia dla sekwencji bardzo podobnych (Highly similar sequences), a następnie wybierz BLAST. Po zakończeniu analizy BLAST pojawi się strona z wynikami. W sekcji Opisy (Descriptions) na stronie wyników zaznacz opcję Wszystkie (All), następnie Pobierz (Download), wybierz format FASTA z rozwijanego menu, a na koniec kliknij Kontynuuj (Continue).Pojawi się plik txt. Otwórz go i skopiuj całą jego zawartość do schowka. Aby zidentyfikować położenie sekwencji EST znajdującej się na końcu 5' względem eksonu 2 w genie Bcrp1, wybierz opcję Align two sequences using BLAST na stronie głównej BLAST w podsekcji Specialized BLAST.Wklej plik tekstowy z schowka do pola zapytania i wpisz 372099104 w polu Subject Sequence. W sekcji Program Selection wybierz optymalizację dla Highly similar sequences i uruchom BLAST. Po pojawieniu się okna z wynikami wyświetl dopasowania graficznie, klikając Graphics w oknie Alignments.Użyj strzałek prawego i lewego kierunku oraz powiększenia, aby skupić się na Bcrp1/ABCG2 i dopasowaniach sekwencji. Następnie zapisz dopasowania sekwencji, wybierając opcję All w polu Descriptions. Z rozwijanego menu Download wybierz Hit Table, a następnie kliknij Continue.Ponieważ pozycja końca 5' eksonu 2 odpowiada nukleotydowi 58 655 638 w kontigu chromosomu 6, przyjmuje się ją za pozycję +1, a następnie oblicza pozycję częściowych sekwencji każdego EST znajdujących się powyżej (5') nukleotydu 58 655 638. Krytycznym krokiem w tej procedurze jest przewidywanie wielu pierwszych eksonów. W ten sposób identyfikowane są alternatywne promotory.Wykorzystując sekwencję E1U uzyskaną z bazy danych EST, wyznacz pierwsze pięć nukleotydów primera E1U jako pozycję plus jeden. Uzyskaj klon wsteczny chromosomu szóstego myszy, który zawiera sekwencję genu Bcrp1/ABCG2 oraz sekwencję obejmującą co najmniej 100 kilobaz upstream od genu Bcrp1/ABCG2. Następnie zidentyfikuj odpowiedni wektor reporterowy, taki jak plazmid reporterowy lucyferazy pGL3-Basic.Określ miejsca w polilinkerze (MCS) wektora reporterowego. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII oraz HindIII to miejsca cięcia endonukleaz restrykcyjnych w polilinkerze wektora pGL3-Basic w orientacji od końca 5' do 3'. Następnie zaznacz region o długości dwóch kilobaz powyżej eksonu E1U i wklej sekwencję do programu DNA5, a następnie uruchom program.Wyświetlone zostaną szczegóły pojedynczych i wielokrotnych miejsc cięcia. Następnie, w arkuszu programu Excel, należy porównać listę miejsc cięcia w regionie E1U z MCS w wektorze pGL3-Basic. W dalszej kolejności należy przygotować startery bezpośrednie i odwrotne do PCR, zawierające miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych, korzystając z komercyjnych usług syntezy starterów genów lub oprogramowania do projektowania starterów.Wybierz starter bezpośredni zlokalizowany około dwóch kilobaz powyżej sekwencji E1U oraz starter odwrotny w obrębie sekwencji E1U. Następnie przeprowadź amplifikację genomowego regionu E1U, wykorzystując te startery, 0,1 µg Bak oraz PCR Master Mix zawierający polimerazę taq o wysokiej wierności. Następnie zweryfikuj długość amplifikowanego produktu PCR, porównując go z drabiną DNA 1 kb za pomocą elektroforezy żelowej na 0,8% żelu agarozy w buforze TAE.Następnie produkt PCR oraz wektor pGL3-Basic poddaj trawieniu za pomocą endonukleaz restrykcyjnych specyficznych dla miejsc restrykcyjnych wprowadzonych do starterów forward i reverse. Następnie zweryfikuj trawienie produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wytnij z żelu agarozowego trawione DNA wektora oraz prążek PCR o wielkości dwóch kilobaz.Następnie wyizoluj trawiony DNA wektora oraz prążek PCR o wielkości dwóch kilobaz z wycinków żelu, korzystając z komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu i produktów PCR SV. Zmierz stężenie oczyszczonego produktu PCR oraz oczyszczonego wektora za pomocą spektrometrii UV. Następnie przygotuj konstrukt reporterowy E1U poprzez ligację oczyszczonego, trawionego enzymami restrykcyjnymi produktu PCR oraz wektora reporterowego pGL3-Basic z lucyferazą świetlika, używając zestawu do szybkiej ligacji T4 DNA ligase, otrzymując w ten sposób konstrukt reporterowy E1U o nazwie pGL3 E1U.Na tym etapie należy hodować komórki TM4 w płytkach 24-dołkowych przy początkowej gęstości 200 000 komórek na dołek. Sześć godzin po wysianiu komórek należy przeprowadzić transfekcję 0,2 µg wektora MP pGL3-Basic lub 0,2 µg wektora pGL3 wraz z 4 ng pRL-TK jako kontrolą wewnętrzną. Trzydzieści godzin po transfekcji należy usunąć pożywkę wzrostową z transfekowanych komórek.Przemyj komórki PBS, a następnie usuń roztwór płuczący. Po tym etapie zmierz aktywność lucyferazy świetlika oraz Renilla przy użyciu komercyjnego zestawu. Aktywność dla każdej probówki wyraź jako stosunek aktywności lucyferazy świetlika do kontroli wewnętrznej.Ten etap potwierdza aktywność funkcjonalną promotora specyficznego dla jąder. Przedstawiono tutaj analizę reporterową dla promotorów Bcrp1 E1U, E1A, E1B i E1C w liniach komórkowych TM4, które są całkowicie pochodzenia komórkowego. Dane wyrażono jako luminescencję lucyferazy świetlika znormalizowaną do luminescencji lucyferazy Renilla.Gwiazdka oznacza istotną różnicę w stosunku do kontroli z wektorem MP pGL3. Wykres ten przedstawia wpływ mutacji elementu odpowiedzi SF-1 w konstrukcie reporterowym Bcrp1 E1U na aktywność lucyferazy. Konstrukty reporterowe Bcrp1 z domniemanym regionem wiązania SF-1 przetransfekowano do komórek TM4 z wymuszoną ekspresją SF-1 oraz bez niej.Na rysunku litera a oznacza istotną różnicę w stosunku do kontroli z pustym wektorem pGL3; litera b oznacza statystycznie istotną różnicę w porównaniu z konstruktem promotora E1U w komórkach transfekowanych wektorem. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wyborze odpowiedniej linii komórkowej do testu reporterowego. Linia komórkowa powinna wykazuje ekspresję badanego genu pod kontrolą promotora w konstrukcie reporterowym.Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościwe RT-PCR, w celu ułatwienia oceny wykorzystania alternatywnych promotorów w wielu próbkach tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przewidywać wykorzystanie alternatywnych promotorów dla interesującego genu oraz jak określić funkcjonalność tego promotora.

methods-to-discover-alternative-promoter-usage-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Poznaj metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora w mysim genie Bcrp1 przy użyciu analiz in silico i testów reporterowych z lucyferazą. Technika ta pozwala badać regulację ekspresji mRNA w różnych tkankach.

Metody odkrywania alternatywnego wykorzystania promotora i regulacji transkrypcji mysiego Bcrp1

Przeglądaj więcej filmów