Name: Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów z NSCLC przy użyciu podwójnego traktowania enzymatycznego. Technika ta eliminuje zanieczyszczenia mikroRNA, umożliwiając dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało również sfinansowane przez grant MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.

1. Izolacja egzosomów
Uwaga: Izolacja egzosomów z próbek osocza została przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta i poprzez dodanie leczenia RNAza: (wszystkie te kroki muszą być wykonane przy użyciu środków ochrony osobistej i środowiska oraz zgodnie z określoną procedurą prawną dotyczącą manipulacji próbkami biologicznymi).
<ol>
	<li>Pobrać 1 ml osocza z każdej próbki, przechowywanej w temperaturze -80 °C, i umieścić ją na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej; przejście to jest obowiązkowe w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować nową probówkę o masie 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 100 ng/ml RNAzy do supernatantu i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji krążących RNA.</li>
	<li>Przenieść całe leczone osocze do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 0,5 objętości 1x PBS.</li>
	<li>Odwirować próbkę w celu wymieszania roztworów.</li>
	<li>Dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K (dołączonego do zestawu) do próbki.</li>
	<li>Wzniecić próbkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 0,2 objętości buforu wytrącającego egzosomy do próbki i wymieszać roztwory przez inwersję.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 30 minut, a następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane egzosomy.</li>
	<li>Dodaj wybrany bufor do osadu egzosomu w celu ponownego zawieszenia egzosomów. Dobór bufora zależy od planowanej dalszej analizy, w tym przypadku:
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl 1x PBS w celu przeprowadzenia analizy TEM.</li>
		<li>Dodaj 346,5 μl specyficznego buforu do lizy do ekstrakcji RNA (z zestawu komercyjnego) (UWAGA: zagrożenie chemiczne).</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu do lizy do ekstrakcji białek (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml) w celu przeprowadzenia analizy Western Bloting. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawieszone egzosomy należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy Western Blot
Uwaga: W celu scharakteryzowania wyizolowanych nanopęcherzyków, zaleca się western blot z przeciwciałami przeciwko ALIX i TSG101 (dobrze znane markery egzosomalne).
<ol>
	<li>Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w buforze do lizy należy umieścić go na lodzie na 1 godzinę w celu rozpuszczenia błony egzosomalnej.</li>
	<li>Odwirować lizat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki bez naruszania osadu.</li>
	<li>Określ ilościowo całkowitą zawartość białka egzosomalnego za pomocą testu Bradforda lub innych metod i załaduj 50 μg białek na studzienkę w żelu Tris/Glycine SDS - 8% poliakrylamidowym. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Oddzielić białka (i odpowiedni marker masy cząsteczkowej) w 8% elektroforezie żelowej SDS-PAGE z buforem do biegania (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS) przez 1 godzinę i 30 minut przy 120 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Przenieść białko do membrany nitrocelulozowej przez elektroblotty z buforem do zimnego transferu o temperaturze 4 °C (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu) przez 1 godzinę przy stałym napięciu 50 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Zablokuj membranę na 1 godzinę w powolnym mieszaniu z 5% beztłuszczowym suchym mlekiem w 1x TBS -Tween 0,1%.</li>
	<li>Umyj membranę 4 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1%.</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko ALIX i TSG101 (po jednym na błonę) do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę O/N w powolnym mieszaniu.</li>
	<li>Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę przez 1 godzinę w powolnym mieszaniu.</li>
	<li>Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.</li>
	<li>Wykryj wybrane białko za pomocą analizy chemiluminescencyjnej 11.</li>
</ol>
3. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy TEM
Uwaga: W celu wizualizacji izolowanych egzosomów przeprowadzono analizę TEM (Transmission Electron Microscopy).
<ol>
	<li>Umieść ~ 10 μg (wcześniej oznaczone ilościowo za pomocą testu Bradforda) próbki nienaruszonych egzosomów zawieszonych w 1x PBS na parafilmie i umieść na próbce kroplę formvar pokrytej węglem siatki niklowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.</li>
	<li>Umyj kratkę 5 razy, umieszczając ją na pięciu kroplach ultraczystej wody o pojemności 30 μl.</li>
	<li>Utrwal próbkę, dodając kroplę 2,5% aldehydu glutarowego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) przez 10 minut.</li>
	<li>Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj kroplę 2% octanu uranylu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i umieść na niej siatkę na 15 minut w celu kontrastu próbki.</li>
	<li>Osadź próbkę na kropli 0,13% metylocelulozy (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i 0,4% octanu uranylu i inkubuj siatkę na wierzchu kropli przez 10 minut.</li>
	<li>Delikatnie usuń nadmiar płynu papierem absorpcyjnym i susz kratkę przez 5 minut powlekaną stroną do góry.</li>
	<li>Zbadaj siatkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego12.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i kwantyfikacja egzosomalnego RNA
Uwaga: Zdecydowaliśmy się przeprowadzić całkowitą ekstrakcję RNA z próbek egzosomalnych za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta: (UWAGA: zagrożenia chemiczne, zapoznaj się z protokołem i wytycznymi producenta).
<ol>
	<li>Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w 346,5 μl buforu do lizy, dodać 3,5 μl β-merkaptoetanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i energicznie wirować; to przejście jest obowiązkowe w celu zniszczenia błon lipidowych.</li>
	<li>Dodać lizat do kolumny myjącej w probówce zbiorczej i odwirować przy 11 000 × g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić kolumnę i przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodaj 350 μl 70% etanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i mieszaj przez wirowanie przez 5 sekund.</li>
	<li>Załadować lizat do kolumny rozdzielczej i odwirować przez 30 sekund w temperaturze 8 000 × g. Po odwirowaniu odrzucić przepływający płyn i przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Załadować 350 μl buforu odsalającego i odwirować o stężeniu 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływowy przepływ i wrzucić kolumnę z powrotem do tej samej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 95 μl mieszaniny reakcyjnej DNazy I (10 μl odtworzonej DNazy I + 90 μl buforu DNazy dla każdej próbki) na membranę krzemionkową kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu płuczącego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływ i umieścić kolumnę w tej samej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 2 min. Umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml bez RNAz.</li>
	<li>Eluuj RNA w 40 μl wody wolnej od RNAzy i odwiruj przy 11 000 × g przez 1 minutę, aby uzyskać wysokie stężenie RNA w tej małej objętości.</li>
	<li>Natychmiast umieścić eluowany RNA na lodzie, aby zapobiec potencjalnej degradacji lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ ilościowo zawartość RNA. Uwaga: W tym przypadku kwantyzację RNA przeprowadzono przy użyciu 1 μl próbki za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
5. Retrotranskrypcja egzosomalnych miRNA
Uwaga: Ze względu na opisaną ograniczoną ilość zawartości miRNA w egzosomach, zdecydowano się przeprowadzić odwrotną transkrypcję wybranych miRNA za pomocą komercyjnego zestawu przy użyciu indywidualnego testu dla każdego miRNA, zgodnie z protokołem producenta. Dla każdej próbki wybrano 8 miRNA skorelowanych ze statusem NSCLC (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222; i miR-1228-3p jako kontrola endogenna).
<ol>
	<li>Przygotuj główny miks z odwrotną transkrypcją (RT mix). Dla każdej reakcji należy przygotować 7 μl mieszanki RT, zgodnie z opisem w <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Tabela 1 (kliknij tutaj, aby pobrać)</a>. (UWAGA: zagrożenie chemiczne) 
	Uwaga: W tym eksperymencie dla każdej próbki przygotowano 9 różnych mieszanek RT.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj i przechowuj mieszankę RT na lodzie. Dodać 7 μl mieszanki RT na probówkę reakcyjną.</li>
	<li>Dodać 5 μl próbki RNA (10 μg całkowitego RNA) do probówki reakcyjnej i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 3 μl 5x starterów odwrotnej transkrypcji (UWAGA: zagrożenie chemiczne) z każdego zestawu testów do odpowiedniej probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Mieszaj powoli, zamknij probówkę i inkubuj na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Załadować rurkę reakcyjną do termocyklera i rozpocząć reakcję odwrotnej transkrypcji, stosując następujące wartości parametrów (UTRZYMAĆ w temperaturze 16 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 42 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 85 °C przez 5 minut; UTRZYMAĆ ∞ 4 °C).</li>
</ol>
6. Analiza egzosomalnych miRNA metodą PCR w czasie rzeczywistym
Uwaga: Ta analiza została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu do Real Time PCR (qPCR), z trzema biologicznymi i technicznymi powtórzeniami na próbkę.
<ol>
	<li>Do każdej reakcji należy przygotować 17,67 μl mieszanki Real Time PCR (10 μl PCR Master Mix + 7,67 μl wody wolnej od nukleaz), wymieszać i wyłożyć na lód. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)</li>
	<li>Dodać 1 μl, na każdą probówkę, 20x starterów qPCR (UWAGA: zagrożenie chemiczne).</li>
	<li>Umieścić 18,67 μl mieszanki qPCR w każdej płytce dołka.</li>
	<li>Dodać 1,33 μl produktu odwrotnej transkrypcji do odpowiedniej płytki dołkowej.</li>
	<li>Zamknij płytkę i zakręć nią (300 g x 5 sek.).</li>
	<li>Umieścić płytkę w systemie Real Time PCR i rozpocząć przebieg w następujących warunkach PCR: UTRZYMAĆ w temperaturze 95°C przez 10 minut; 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95°C i 60 sekund w temperaturze 60°C. Przetwarzać i normalizować dane zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct 13.</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+patients+with+NSCLC+that+do+not+respond+to+treatment+with+EGFR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors.</a> Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies+in+lung+cancer%3A+the+new+ambrosia+of+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.</a> Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+understanding+the+role+of+tumor-derived+exosomes+in+cancer+progression%3A+state+of+the+art+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+shuttling+of+miR-126+in+endothelial+cells+modulates+adhesive+and+migratory+abilities+of+chronic+myelogenous+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells.</a> Mol Cancer. 11, (2014).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+in+vitro+and+in+vivo+chronic+myelogenous+leukemia+cells+growth%3A+a+possible+role+for+exosomal+disposal+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+miR-1228+as+a+stable+endogenous+control+for+the+quantification+of+circulating+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients.</a> Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).</li>
<li>Alessandro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carboxyamidotriazole+on+in+vitro+models+of+imatinib-resistant+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia.</a> J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Dzięki temu połączonemu protokołowi możliwe było przeprowadzenie egzosomalnej analizy miRNA z osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Dane te mogą odzwierciedlać stan choroby, ale musi to zostać potwierdzone przez dalsze badania.
Protokół zastosowany w tym artykule został oparty na komercyjnym zestawie do izolacji egzosomów. Powodem było to, że inne znane procedury izolacji (np. ultrawirowanie w gradionym gradiencie gęstości) wymagają więcej procedur ręcznych, co prowadzi...

Niski wskaźnik przeżycia u pacjentów z NSCLC (niedrobnokomórkowym rakiem płuca) wynika głównie z ograniczonej skuteczności leczenia w zaawansowanej chorobie i słabego wczesnego wykrywania1. Wiadomo, że mutacje aktywujące w genie EGFR, które odkryto w subpopulacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, nadają wrażliwość na inhibitory kinazy tyrozynowej (TKI). Niestety, u większości pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR rozwija się opornośćna TKI 2. Szczególnie w tym kontekście prawidłowa diagnoza jest obowiązkowa. Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na lokalizację guzów, uzyskanie tkanki biopsyjnej w NSCLC nie zawsze jest możliwe. Dlatego prowadzonych jest kilka badań, które wykorzystują metody nieinwazyjne w celu uzyskania tych danych biologicznych. Egzosomy są opisywane jako płynne składniki biopsji, które można badać w celu uzyskania wartości diagnostycznych i prognostycznych za pomocą technik nieinwazyjnych3.
Egzosomy to nanopęcherzyki (o średnicy 40 - 100 nm) pochodzenia endocytarnego, które są uwalniane przez różne typy komórek, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych4. Mogą przenosić białka, lipidy, mRNA i mikroRNA. Co więcej, kilka badań sugeruje plejotropową rolę egzosomów pochodzących z guza, które mogą wpływać na wzrost i przeżycie komórek nowotworowych, angiogenezę, przebudowę zrębu i macierzy zewnątrzkomórkowej oraz opornośćna leki 5.
MicroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA, które biorą udział w regulacji potranskrypcyjnej, wiążąc 3′-UTR docelowych mRNA i prowadząc mRNA do degradacji lub do braku translacji6. Opisano selektywne sortowanie miRNA na egzosomy. W tym kontekście, niedawno wykazano, in vitro i in vivo, selektywne pakowanie miR-21 (dobrze znanego miRNA o działaniu onkogennym) w egzosomy uwalniane przez linie komórkowe przewlekłej białaczki szpikowej po leczeniu kurkuminą7.
Egzosomalny profil miRNA jest podobny do profilu miRNA pierwotnego nowotworu i ta cecha może być wykorzystana we wczesnej diagnostyce i rokowaniu3. W szczególności istnieje możliwość scharakteryzowania, za pomocą real-time PCR, wybranych miRNA skorelowanych z profilem molekularnym choroby, np. mutacji EGFRm.in. 8.
Tutaj opisana jest analiza wybranego panelu korelowanych z NSCLC miRNA8-9, które zostały wyizolowane z egzosomów uwolnionych we krwi pacjentów z NSCLC. Po uzyskaniu raportu o świadomej zgodzie od pacjentów, przeanalizowano osocze 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca i 6 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Izolację egzosomu wykonano za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Przed izolacją egzosomów próbki osocza potraktowano RNAzą w celu degradacji krążących zanieczyszczeń miRNA. Zdecydowaliśmy się na wykonanie tej analizy za pomocą komercyjnego zestawu ze względu na ograniczoną standaryzację innych technik (np. ultrawirowania), co jest szczególnie ważne podczas pracy z próbkami klinicznymi. Ten zestaw zawiera leczenie proteinazą K, która degraduje RNAzę, a tym samym zmniejsza ryzyko degradacji egzosomalnych miRNA po lizie egzosomalów. Analizę mikroRNA przeprowadzono za pomocą czułej i specyficznej analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane znormalizowano zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct. Wartości kontrolne są używane jako linia bazowa, a wyniki są przedstawiane w skali logarytmicznej.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do całkowitej izolacji egzosomów (z osocza)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Użyj leczenia proteinazą K</td></tr><tr><td>Rybonukleaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ALIX (3A9)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TSG-101 (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw myszom HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra mini kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA Taqman</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

egzosomalna analiza mirna w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (nsclc) za pomocą qpcr: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Odkrycie zmian w genach EGFR i ALK, między innymi, w NSCLC przyczyniło się do rozwoju terapii lekami celowanymi z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI). Aby zoptymalizować wykorzystanie tych TKI, konieczne jest odkrycie nowych biomarkerów do wczesnego wykrywania i progresji choroby. Te izolowane plazmą egzosomy mogą być stosowane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i monitorowania tych biomarkerów. Jako źródło egzosomów wykorzystano jeden ml osocza od 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, z różnymi mutacjami i leczeniem (oraz 6 zdrowych dawców jako grupę kontrolną). Po potraktowaniu RNAza, w celu degradacji krążących miRNA, egzosomy wyizolowano za pomocą komercyjnego zestawu i ponownie zawieszono w określonych w celu dalszej analizy. Egzosomy scharakteryzowano za pomocą western blot dla ALIX i TSG101 oraz za pomocą analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), standardowych technik uzyskiwania danych biochemicznych i wymiarowych tych nanopęcherzyków. Ekstrakcję całkowitego RNA przeprowadzono za pomocą komercyjnego zestawu o wysokiej wydajności. Ze względu na ograniczoną zawartość miRNA w egzosomach zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie retrotranskrypcji PCR przy użyciu indywidualnego testu dla każdego wybranego miRNA. Panel miRNA (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), wszystkie skorelowane z chorobą NSCLC, przeanalizowano przy użyciu niezwykłej czułości i swoistości analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane przetworzono według wzoru 2-ΔΔct 13. Wartości kontrolne zastosowano jako wartość wyjściową, a wyniki przedstawiono w skali logarytmicznej.

Przetworzono łącznie 12 próbek osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) oraz 6 próbek od zdrowych osób kontrolnych, wykorzystując komercyjny zestaw do izolacji egzosomów z osocza. Każda próbka została poddana analizie metodą Western Blot w celu oceny markerów egzosomalnych ALIX (96 kDa) i TSG101 (43 kDa). Przykład tych wyników dla 3 próbek przedstawiono w Rysunek 1co wskazuje, że izolacja egzosomów z próbek osocza jest możliwa przy zastosowaniu ninie...

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie egzosomów obecnych w osoczu pacjentów z NSCLC, które są wolne od nieegzosomalnych źródeł mikroRNA, takich jak krążące wolne mikroRNAzy, poprzez zastosowanie podwójnej obróbki enzymatycznej przed izolacją egzosomów. Metoda ta umożliwia ograniczenie analizy mikroRNA w biopsjach lipidowych do frakcji egzosomalnej, co pomoże w wyjaśnieniu możliwości ich wykorzystania jako biomarkerów. Główną zaletą tej procedury jest enzymatyczna obróbka wstępna, która eliminuje nieegzosomalne źródła mikroRNA mogące zakłócać analizę.Aby rozpocząć, rozmrozić na lodzie próbkę 1 mL osocza. Po rozmrożeniu kilkukrotnie odwrócić probówkę, aby rozbić ewentualne krioprecypitaty, które mogły powstać. Następnie odwirować osocze z prędkością 2 000 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.Zebrać supernatant i ponownie odwirować osocze, tym razem przy 10 000 G przez 20 minut. Ponownie zebrać supernatant osocza i dodać 10 µL RNazy. Inkubować osocze w temperaturze 37 °C przez 10 minut w bloku grzejnym.Do standardowego kluczowego protokołu dodaliśmy etap traktowania RNazą w celu degradacji wolnego mikro-RNA. Następnie w ramach pro

exosomal-mirna-analysis-non-small-cell-lung-cancer-nsclc-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

MikroRNA (miRNA) to specyficzne tkankowo, małe, niekodujące RNA regulujące ekspresję genów i mogą stanowić idealnych kandydatów do wczesnego wykrywania raka płuc. W przedstawionym protokole wyizolujemy mikroRNA z próbek krwi pacjentów w celu wczesnego badania przesiewowego w kierunku raka płuc.

Ekstrakcja miRNA: metoda ekstrakcji miRNA z próbki osocza

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Ten film opisuje ekstrakcję krążącego mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą ekstrakcji organicznej, a następnie wzbogacenia kolumny z włókna szklanego. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Metoda ta pomoże zidentyfikować nowe krążące biomarkery zdolne do przewidywania wyników klinicznych u...

Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów z NSCLC przy użyciu podwójnego traktowania enzymatycznego. Technika ta eliminuje zanieczyszczenia mikroRNA, umożliwiając dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji (Wideo) | JoVE Journal

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Przeglądaj więcej filmów