Name: Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów z NSCLC przy użyciu podwójnego traktowania enzymatycznego. Technika ta eliminuje zanieczyszczenia mikroRNA, umożliwiając dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało również sfinansowane przez grant MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.

1. Izolacja egzosomów
Uwaga: Izolacja egzosomów z próbek osocza została przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta i poprzez dodanie leczenia RNAza: (wszystkie te kroki muszą być wykonane przy użyciu środków ochrony osobistej i środowiska oraz zgodnie z określoną procedurą prawną dotyczącą manipulacji próbkami biologicznymi).
<ol>
	<li>Pobrać 1 ml osocza z każdej próbki, przechowywanej w temperaturze -80 °C, i umieścić ją na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej; przejście to jest obowiązkowe w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować nową probówkę o masie 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający czyste osocze do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 100 ng/ml RNAzy do supernatantu i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji krążących RNA.</li>
	<li>Przenieść całe leczone osocze do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 0,5 objętości 1x PBS.</li>
	<li>Odwirować próbkę w celu wymieszania roztworów.</li>
	<li>Dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K (dołączonego do zestawu) do próbki.</li>
	<li>Wzniecić próbkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 0,2 objętości buforu wytrącającego egzosomy do próbki i wymieszać roztwory przez inwersję.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 30 minut, a następnie odwirować próbkę w temperaturze 10 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane egzosomy.</li>
	<li>Dodaj wybrany bufor do osadu egzosomu w celu ponownego zawieszenia egzosomów. Dobór bufora zależy od planowanej dalszej analizy, w tym przypadku:
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl 1x PBS w celu przeprowadzenia analizy TEM.</li>
		<li>Dodaj 346,5 μl specyficznego buforu do lizy do ekstrakcji RNA (z zestawu komercyjnego) (UWAGA: zagrożenie chemiczne).</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu do lizy do ekstrakcji białek (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml) w celu przeprowadzenia analizy Western Bloting. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawieszone egzosomy należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy Western Blot
Uwaga: W celu scharakteryzowania wyizolowanych nanopęcherzyków, zaleca się western blot z przeciwciałami przeciwko ALIX i TSG101 (dobrze znane markery egzosomalne).
<ol>
	<li>Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w buforze do lizy należy umieścić go na lodzie na 1 godzinę w celu rozpuszczenia błony egzosomalnej.</li>
	<li>Odwirować lizat o stężeniu 12 000 g przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki bez naruszania osadu.</li>
	<li>Określ ilościowo całkowitą zawartość białka egzosomalnego za pomocą testu Bradforda lub innych metod i załaduj 50 μg białek na studzienkę w żelu Tris/Glycine SDS - 8% poliakrylamidowym. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Oddzielić białka (i odpowiedni marker masy cząsteczkowej) w 8% elektroforezie żelowej SDS-PAGE z buforem do biegania (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS) przez 1 godzinę i 30 minut przy 120 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Przenieść białko do membrany nitrocelulozowej przez elektroblotty z buforem do zimnego transferu o temperaturze 4 °C (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu) przez 1 godzinę przy stałym napięciu 50 V. (UWAGA: zagrożenia chemiczne).</li>
	<li>Zablokuj membranę na 1 godzinę w powolnym mieszaniu z 5% beztłuszczowym suchym mlekiem w 1x TBS -Tween 0,1%.</li>
	<li>Umyj membranę 4 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1%.</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko ALIX i TSG101 (po jednym na błonę) do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę O/N w powolnym mieszaniu.</li>
	<li>Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do odpowiedniego buforu (zgodnie z kartą katalogową przeciwciał producenta) i inkubować błonę przez 1 godzinę w powolnym mieszaniu.</li>
	<li>Umyj membranę 5 razy przez 5 minut w szybkim mieszaniu za pomocą 1x TBS - Tween 0,1% w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.</li>
	<li>Wykryj wybrane białko za pomocą analizy chemiluminescencyjnej 11.</li>
</ol>
3. Charakterystyka egzosomów za pomocą analizy TEM
Uwaga: W celu wizualizacji izolowanych egzosomów przeprowadzono analizę TEM (Transmission Electron Microscopy).
<ol>
	<li>Umieść ~ 10 μg (wcześniej oznaczone ilościowo za pomocą testu Bradforda) próbki nienaruszonych egzosomów zawieszonych w 1x PBS na parafilmie i umieść na próbce kroplę formvar pokrytej węglem siatki niklowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.</li>
	<li>Umyj kratkę 5 razy, umieszczając ją na pięciu kroplach ultraczystej wody o pojemności 30 μl.</li>
	<li>Utrwal próbkę, dodając kroplę 2,5% aldehydu glutarowego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) przez 10 minut.</li>
	<li>Umyj kratkę 3 razy, umieszczając ją na trzech kroplach 40 μl 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj kroplę 2% octanu uranylu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i umieść na niej siatkę na 15 minut w celu kontrastu próbki.</li>
	<li>Osadź próbkę na kropli 0,13% metylocelulozy (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i 0,4% octanu uranylu i inkubuj siatkę na wierzchu kropli przez 10 minut.</li>
	<li>Delikatnie usuń nadmiar płynu papierem absorpcyjnym i susz kratkę przez 5 minut powlekaną stroną do góry.</li>
	<li>Zbadaj siatkę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego12.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja i kwantyfikacja egzosomalnego RNA
Uwaga: Zdecydowaliśmy się przeprowadzić całkowitą ekstrakcję RNA z próbek egzosomalnych za pomocą komercyjnego zestawu, zgodnie z protokołem producenta: (UWAGA: zagrożenia chemiczne, zapoznaj się z protokołem i wytycznymi producenta).
<ol>
	<li>Po ponownym zawieszeniu osadu egzosomu w 346,5 μl buforu do lizy, dodać 3,5 μl β-merkaptoetanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i energicznie wirować; to przejście jest obowiązkowe w celu zniszczenia błon lipidowych.</li>
	<li>Dodać lizat do kolumny myjącej w probówce zbiorczej i odwirować przy 11 000 × g przez 1 minutę. Po odwirowaniu wyrzucić kolumnę i przenieść filtrat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodaj 350 μl 70% etanolu (UWAGA: zagrożenia chemiczne) i mieszaj przez wirowanie przez 5 sekund.</li>
	<li>Załadować lizat do kolumny rozdzielczej i odwirować przez 30 sekund w temperaturze 8 000 × g. Po odwirowaniu odrzucić przepływający płyn i przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Załadować 350 μl buforu odsalającego i odwirować o stężeniu 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływowy przepływ i wrzucić kolumnę z powrotem do tej samej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 95 μl mieszaniny reakcyjnej DNazy I (10 μl odtworzonej DNazy I + 90 μl buforu DNazy dla każdej próbki) na membranę krzemionkową kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu płuczącego (UWAGA: zagrożenie chemiczne) do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 1 min. Po odwirowaniu odrzucić przepływ i umieścić kolumnę w tej samej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować przy 11 000 × g przez 2 min. Umieścić kolumnę w probówce o pojemności 1,5 ml bez RNAz.</li>
	<li>Eluuj RNA w 40 μl wody wolnej od RNAzy i odwiruj przy 11 000 × g przez 1 minutę, aby uzyskać wysokie stężenie RNA w tej małej objętości.</li>
	<li>Natychmiast umieścić eluowany RNA na lodzie, aby zapobiec potencjalnej degradacji lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ ilościowo zawartość RNA. Uwaga: W tym przypadku kwantyzację RNA przeprowadzono przy użyciu 1 μl próbki za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
5. Retrotranskrypcja egzosomalnych miRNA
Uwaga: Ze względu na opisaną ograniczoną ilość zawartości miRNA w egzosomach, zdecydowano się przeprowadzić odwrotną transkrypcję wybranych miRNA za pomocą komercyjnego zestawu przy użyciu indywidualnego testu dla każdego miRNA, zgodnie z protokołem producenta. Dla każdej próbki wybrano 8 miRNA skorelowanych ze statusem NSCLC (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222; i miR-1228-3p jako kontrola endogenna).
<ol>
	<li>Przygotuj główny miks z odwrotną transkrypcją (RT mix). Dla każdej reakcji należy przygotować 7 μl mieszanki RT, zgodnie z opisem w <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Tabela 1 (kliknij tutaj, aby pobrać)</a>. (UWAGA: zagrożenie chemiczne) 
	Uwaga: W tym eksperymencie dla każdej próbki przygotowano 9 różnych mieszanek RT.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj i przechowuj mieszankę RT na lodzie. Dodać 7 μl mieszanki RT na probówkę reakcyjną.</li>
	<li>Dodać 5 μl próbki RNA (10 μg całkowitego RNA) do probówki reakcyjnej i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 3 μl 5x starterów odwrotnej transkrypcji (UWAGA: zagrożenie chemiczne) z każdego zestawu testów do odpowiedniej probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Mieszaj powoli, zamknij probówkę i inkubuj na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Załadować rurkę reakcyjną do termocyklera i rozpocząć reakcję odwrotnej transkrypcji, stosując następujące wartości parametrów (UTRZYMAĆ w temperaturze 16 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 42 °C przez 30 min; Utrzymać w temperaturze 85 °C przez 5 minut; UTRZYMAĆ ∞ 4 °C).</li>
</ol>
6. Analiza egzosomalnych miRNA metodą PCR w czasie rzeczywistym
Uwaga: Ta analiza została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu do Real Time PCR (qPCR), z trzema biologicznymi i technicznymi powtórzeniami na próbkę.
<ol>
	<li>Do każdej reakcji należy przygotować 17,67 μl mieszanki Real Time PCR (10 μl PCR Master Mix + 7,67 μl wody wolnej od nukleaz), wymieszać i wyłożyć na lód. (UWAGA: zagrożenie chemiczne)</li>
	<li>Dodać 1 μl, na każdą probówkę, 20x starterów qPCR (UWAGA: zagrożenie chemiczne).</li>
	<li>Umieścić 18,67 μl mieszanki qPCR w każdej płytce dołka.</li>
	<li>Dodać 1,33 μl produktu odwrotnej transkrypcji do odpowiedniej płytki dołkowej.</li>
	<li>Zamknij płytkę i zakręć nią (300 g x 5 sek.).</li>
	<li>Umieścić płytkę w systemie Real Time PCR i rozpocząć przebieg w następujących warunkach PCR: UTRZYMAĆ w temperaturze 95°C przez 10 minut; 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95°C i 60 sekund w temperaturze 60°C. Przetwarzać i normalizować dane zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct 13.</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+patients+with+NSCLC+that+do+not+respond+to+treatment+with+EGFR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors.</a> Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies+in+lung+cancer%3A+the+new+ambrosia+of+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.</a> Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+understanding+the+role+of+tumor-derived+exosomes+in+cancer+progression%3A+state+of+the+art+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+shuttling+of+miR-126+in+endothelial+cells+modulates+adhesive+and+migratory+abilities+of+chronic+myelogenous+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells.</a> Mol Cancer. 11, (2014).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+in+vitro+and+in+vivo+chronic+myelogenous+leukemia+cells+growth%3A+a+possible+role+for+exosomal+disposal+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+miR-1228+as+a+stable+endogenous+control+for+the+quantification+of+circulating+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients.</a> Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).</li>
<li>Alessandro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carboxyamidotriazole+on+in+vitro+models+of+imatinib-resistant+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia.</a> J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Dzięki temu połączonemu protokołowi możliwe było przeprowadzenie egzosomalnej analizy miRNA z osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Dane te mogą odzwierciedlać stan choroby, ale musi to zostać potwierdzone przez dalsze badania.
Protokół zastosowany w tym artykule został oparty na komercyjnym zestawie do izolacji egzosomów. Powodem było to, że inne znane procedury izolacji (np. ultrawirowanie w gradionym gradiencie gęstości) wymagają więcej procedur ręcznych, co prowadzi...

Niski wskaźnik przeżycia u pacjentów z NSCLC (niedrobnokomórkowym rakiem płuca) wynika głównie z ograniczonej skuteczności leczenia w zaawansowanej chorobie i słabego wczesnego wykrywania1. Wiadomo, że mutacje aktywujące w genie EGFR, które odkryto w subpopulacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, nadają wrażliwość na inhibitory kinazy tyrozynowej (TKI). Niestety, u większości pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR rozwija się opornośćna TKI 2. Szczególnie w tym kontekście prawidłowa diagnoza jest obowiązkowa. Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na lokalizację guzów, uzyskanie tkanki biopsyjnej w NSCLC nie zawsze jest możliwe. Dlatego prowadzonych jest kilka badań, które wykorzystują metody nieinwazyjne w celu uzyskania tych danych biologicznych. Egzosomy są opisywane jako płynne składniki biopsji, które można badać w celu uzyskania wartości diagnostycznych i prognostycznych za pomocą technik nieinwazyjnych3.
Egzosomy to nanopęcherzyki (o średnicy 40 - 100 nm) pochodzenia endocytarnego, które są uwalniane przez różne typy komórek, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych4. Mogą przenosić białka, lipidy, mRNA i mikroRNA. Co więcej, kilka badań sugeruje plejotropową rolę egzosomów pochodzących z guza, które mogą wpływać na wzrost i przeżycie komórek nowotworowych, angiogenezę, przebudowę zrębu i macierzy zewnątrzkomórkowej oraz opornośćna leki 5.
MicroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące RNA, które biorą udział w regulacji potranskrypcyjnej, wiążąc 3′-UTR docelowych mRNA i prowadząc mRNA do degradacji lub do braku translacji6. Opisano selektywne sortowanie miRNA na egzosomy. W tym kontekście, niedawno wykazano, in vitro i in vivo, selektywne pakowanie miR-21 (dobrze znanego miRNA o działaniu onkogennym) w egzosomy uwalniane przez linie komórkowe przewlekłej białaczki szpikowej po leczeniu kurkuminą7.
Egzosomalny profil miRNA jest podobny do profilu miRNA pierwotnego nowotworu i ta cecha może być wykorzystana we wczesnej diagnostyce i rokowaniu3. W szczególności istnieje możliwość scharakteryzowania, za pomocą real-time PCR, wybranych miRNA skorelowanych z profilem molekularnym choroby, np. mutacji EGFRm.in. 8.
Tutaj opisana jest analiza wybranego panelu korelowanych z NSCLC miRNA8-9, które zostały wyizolowane z egzosomów uwolnionych we krwi pacjentów z NSCLC. Po uzyskaniu raportu o świadomej zgodzie od pacjentów, przeanalizowano osocze 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca i 6 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Izolację egzosomu wykonano za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Przed izolacją egzosomów próbki osocza potraktowano RNAzą w celu degradacji krążących zanieczyszczeń miRNA. Zdecydowaliśmy się na wykonanie tej analizy za pomocą komercyjnego zestawu ze względu na ograniczoną standaryzację innych technik (np. ultrawirowania), co jest szczególnie ważne podczas pracy z próbkami klinicznymi. Ten zestaw zawiera leczenie proteinazą K, która degraduje RNAzę, a tym samym zmniejsza ryzyko degradacji egzosomalnych miRNA po lizie egzosomalów. Analizę mikroRNA przeprowadzono za pomocą czułej i specyficznej analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane znormalizowano zgodnie ze wzorem 2-ΔΔct. Wartości kontrolne są używane jako linia bazowa, a wyniki są przedstawiane w skali logarytmicznej.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do całkowitej izolacji egzosomów (z osocza)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Użyj leczenia proteinazą K</td></tr><tr><td>Rybonukleaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ALIX (3A9)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TSG-101 (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw myszom HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra mini kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA Taqman</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 Test mikroRNA TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 Test mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

egzosomalna analiza mirna w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (nsclc) za pomocą qpcr: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

Odkrycie zmian w genach EGFR i ALK, między innymi, w NSCLC przyczyniło się do rozwoju terapii lekami celowanymi z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI). Aby zoptymalizować wykorzystanie tych TKI, konieczne jest odkrycie nowych biomarkerów do wczesnego wykrywania i progresji choroby. Te izolowane plazmą egzosomy mogą być stosowane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i monitorowania tych biomarkerów. Jako źródło egzosomów wykorzystano jeden ml osocza od 12 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, z różnymi mutacjami i leczeniem (oraz 6 zdrowych dawców jako grupę kontrolną). Po potraktowaniu RNAza, w celu degradacji krążących miRNA, egzosomy wyizolowano za pomocą komercyjnego zestawu i ponownie zawieszono w określonych w celu dalszej analizy. Egzosomy scharakteryzowano za pomocą western blot dla ALIX i TSG101 oraz za pomocą analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), standardowych technik uzyskiwania danych biochemicznych i wymiarowych tych nanopęcherzyków. Ekstrakcję całkowitego RNA przeprowadzono za pomocą komercyjnego zestawu o wysokiej wydajności. Ze względu na ograniczoną zawartość miRNA w egzosomach zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie retrotranskrypcji PCR przy użyciu indywidualnego testu dla każdego wybranego miRNA. Panel miRNA (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), wszystkie skorelowane z chorobą NSCLC, przeanalizowano przy użyciu niezwykłej czułości i swoistości analizy Real-Time PCR; mir-1228-3p zastosowano jako kontrolę endogenną, a dane przetworzono według wzoru 2-ΔΔct 13. Wartości kontrolne zastosowano jako wartość wyjściową, a wyniki przedstawiono w skali logarytmicznej.

Przetworzono łącznie 12 próbek osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) oraz 6 próbek od zdrowych osób kontrolnych, wykorzystując komercyjny zestaw do izolacji egzosomów z osocza. Każda próbka została poddana analizie metodą Western Blot w celu oceny markerów egzosomalnych ALIX (96 kDa) i TSG101 (43 kDa). Przykład tych wyników dla 3 próbek przedstawiono w Rysunek 1co wskazuje, że izolacja egzosomów z próbek osocza jest możliwa przy zastosowaniu ninie...

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie egzosomów obecnych w osoczu pacjentów z NSCLC, które są wolne od nieegzosomalnych źródeł mikroRNA, takich jak krążące wolne mikroRNAzy, poprzez zastosowanie podwójnej obróbki enzymatycznej przed izolacją egzosomów. Metoda ta umożliwia ograniczenie analizy mikroRNA w biopsjach lipidowych do frakcji egzosomalnej, co pomoże w wyjaśnieniu możliwości ich wykorzystania jako biomarkerów. Główną zaletą tej procedury jest enzymatyczna obróbka wstępna, która eliminuje nieegzosomalne źródła mikroRNA mogące zakłócać analizę.Aby rozpocząć, rozmrozić na lodzie próbkę 1 mL osocza. Po rozmrożeniu kilkukrotnie odwrócić probówkę, aby rozbić ewentualne krioprecypitaty, które mogły powstać. Następnie odwirować osocze z prędkością 2 000 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.Zebrać supernatant i ponownie odwirować osocze, tym razem przy 10 000 G przez 20 minut. Ponownie zebrać supernatant osocza i dodać 10 µL RNazy. Inkubować osocze w temperaturze 37 °C przez 10 minut w bloku grzejnym.Do standardowego kluczowego protokołu dodaliśmy etap traktowania RNazą w celu degradacji wolnego mikro-RNA. Następnie w ramach protokołu wykorzystano kluczowy etap traktowania proteinazą w celu degradacji prób RNA i ochrony integralności mikro-RNA egzosomalnego. Następnie przenieść osocze do nowej probówki, dodać połowę objętości 1x PBS i wymieszać na wortexie.Następnie dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K, ponownie wymieszać próbkę za pomocą wortexa i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut. Teraz dodać 0,2 objętości buforu do wytrącania egzosomów i wymieszać próbkę poprzez odwracanie naczynia. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 4°C przez 30 minut.Po inkubacji w niskiej temperaturze odwiruj próbkę przy 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pobierz 20 do 50 µL aliquotu supernatantu i przechowuj go w celach kontrolnych. Następnie odessaj i odrzuć pozostały supernatant.Resuspender osad egzosomów w wybranym buforze, stosując objętość zależną od planowanej analizy końcowej. W przypadku analizy RNA należy dodać specyficzny bufor lizujący do ekstrakcji RNA. Przed rozpoczęciem pracy należy oczyścić obszar roboczy oraz powiązane akcesoria odpowiednimi odczynnikami, aby zapewnić środowisko wolne od RNaz.Przygotuj mieszaninę reakcyjną (master mix) do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami dostawcy. W tym przykładzie przetwarzane będą dwie próbki. Dla każdej próbki przygotowano dziewięć alikwotów mieszaniny reakcyjnej po 7 µL każdy, po jednym dla każdego wybranego mikroRNA.Przechowywać probówki z reakcją w lodzie. Następnie do każdej probówki z reakcją dodać pięć µL roztworu RNA egzosomalnego o całkowitym stężeniu RNA wynoszącym 10 µg. Pomieszać próbki, delikatnie pipetując.Następnie do każdej probówki reakcyjnej należy dodać trzy µL odpowiedniego primera do odwrotnej transkrypcji i delikatnie wymieszać próbki poprzez pipetowanie. Inkubować je na lodzie przez pięć minut przed przejściem do kolejnego etapu. Teraz probówki reakcyjne można umieścić w termocyklerze.Przeprowadź cykle reakcji zgodnie z wymaganiami dostawcy. W tej procedurze wszystkie mikro-RNAze muszą być przebadane w trzech powtórzeniach dla każdego pacjenta. Obejmuje to wykonanie powtórzeń trzykrotnych dla kontroli negatywnych.Należy upewnić się, że do prawidłowej normalizacji danych dołączono co najmniej jeden referencyjny mikro-RNA, ponieważ nie istnieje konsensus w kwestii stabilnie wyrażanych krążących mikro-RNA. W качестве referencji można wykorzystać wcześniej wyselekcjonowane kandydackie mikro-RNA. Rozpocząć należy od przygotowania mieszaniny do PCR.Przygotuj jedną mieszaninę dla każdego mikro-RNA, który ma zostać poddany ocenie. Przechowuj odczynniki i primery na lodzie, w ciemności, aż do momentu ich użycia. Do każdej studzienki PCR przygotuj 10 µL master mixu do PCR.Przygotowując mieszaninę z 7,67 mL wody wolnej od nukleaz i jednego mikrolitra primera do PCR, zwiększ te objętości proporcjonalnie do liczby studzienek na płytce, uwzględniając niewielki zapas. Następnie nanieś 18,67 mikrolitrów przygotowanych mieszanin do odpowiednich studzienek płytki. Do każdej właściwej studzienki dodaj 1,33 mikrolitra odpowiedniego produktu reakcji odwrotnej transkrypcji, tak aby całkowita objętość w każdej studzience wynosiła 20 mikrolitrów.Do studzienek kontroli negatywnej dodaj 1,33 µL wody. Następnie zamknij płytkę i wiruj ją w wirówce do płytek przez kilka sekund przy 300 G. Korzystając z oprogramowania do real-time PCR w szablonie, przypisz reportery, przypisz geny docelowe, określ objętości reakcji i ustaw studzienki eksperymentalne.Następnie umieść płytkę w termocyklerze i zdefiniuj parametry reakcji zgodnie ze specyfikacjami dostawcy. Po zakończeniu przebiegu wyeksportuj dane, w tym wartości CT, do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy. W opisany sposób przetworzono dwanaście próbek osocza od pacjentów z NSCLC oraz sześć próbek od zdrowych osób kontrolnych.Markery egzosomów przeanalizowano metodą Western Blot. W próbkach stwierdzono obecność markerów związanych z egzosomami: ALIX oraz TSG101. W celu biofizycznej charakterystyki próbek przeprowadzono analizę TEM.Wykryto pęcherzyki o okrągłym kształcie o rozmiarach od 40 do 100 nanometrów. Za pomocą RT-PCR przeanalizowano osiem mikroRNA, które w różnych modelach opisano jako zderegulowane w NSCLC. Wewnętrzna kontrola mir 1228 została zwalidowana jako stabilna kontrola endogenna w innym zestawie próbek.Stwierdzono, że analizowane mikroRNA są rozregulowane w próbkach klinicznych pobranych od pacjentów z rakiem płuc w porównaniu z grupą kontrolną. Niniejszy protokół umożliwia analizę egzosomalnych mikroRNA z próbek osocza, z pominięciem innych frakcji, które mogłyby zakłócić analizę. Zalecamy wykorzystanie przechowywanej alikwoty supernatantu jako kontroli w celu monitorowania wydajności obróbki enzymatycznej.Biopsje płynne są bardzo ważne w onkologii, a w szczególności w raku płuca, ponieważ wiele ich składników, takich jak CTC lub wolny DNA, jest wykorzystywanych nie tylko obecnie, ale także w monitorowaniu stanu pacjentów. Egzosomy stanowią nowy element tych biopsji płynnych i wykazują istotne działanie plejotropowe. Jednym z nich jest na przykład bezpośrednia oporność.Zapraszam do obejrzenia tego filmu, aby dowiedzieć się, jak wyizolować i scharakteryzować egzosomy we własnym laboratorium. Dziękuję za uwagę.

exosomal-mirna-analysis-non-small-cell-lung-cancer-nsclc-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

MikroRNA (miRNA) to specyficzne tkankowo, małe, niekodujące RNA regulujące ekspresję genów i mogą stanowić idealnych kandydatów do wczesnego wykrywania raka płuc. W przedstawionym protokole wyizolujemy mikroRNA z próbek krwi pacjentów w celu wczesnego badania przesiewowego w kierunku raka płuc.

Ekstrakcja miRNA: metoda ekstrakcji miRNA z próbki osocza

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Ten film opisuje ekstrakcję krążącego mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą ekstrakcji organicznej, a następnie wzbogacenia kolumny z włókna szklanego. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Metoda ta pomoże zidentyfikować nowe krążące biomarkery zdolne do przewidywania wyników klinicznych u...

Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów z NSCLC przy użyciu podwójnego traktowania enzymatycznego. Technika ta eliminuje zanieczyszczenia mikroRNA, umożliwiając dokładną analizę biomarkerów nowotworowych.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji (Wideo) | JoVE Journal

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Przeglądaj więcej filmów