Name: Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj mikrotomografię komputerową do oceny rozwoju guza i odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc. Ta technika umożliwia monitorowanie zmian wielkości guzów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid od JSPS KAKENHI dla A.E.H. (Grant Number 25461196) i T.B. (Grant Numbers 23390218 and 15H04833) oraz grant National Institutes of Health HL111190 (D.M.O.). Autorzy pragną podziękować Miyuki Yamamoto za jej wysiłki w pomocy w genotypowaniu zwierząt i przygotowaniu sekcji histologicznych. Jesteśmy wdzięczni Collaborative Research Resources, School of Medicine, Keio University za wsparcie techniczne i odczynniki.

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Keio.
Uwaga: W tym badaniu użyliśmy myszy DT Sftpc-rtTA i Tre-Fgf9-ires-eGfp, u których gruczolakorak płuc szybko rozwija się po indukcji przez karmienie karmą zawierającą doksycyklinę6,7. Jednak wszystkie procedury oceny można zastosować do innych mysich modeli raka płuc.
1. Konspekt eksperymentu:
<ol>
	<li>Określ stan płuc na początku badania:
	<ol>
		<li>Przed indukcją guza, gdy myszy DT mają 8-12 tygodni, należy wykonać pierwszą mikrotomografię komputerową (patrz sekcje 2 i 3 poniżej). Służy to jako skan wyjściowy płuc, potwierdza brak spontanicznie rozwijających się guzków spowodowanych nieszczelnym transgenem i dokumentuje brak jakiejkolwiek istniejącej patologii płuc przed indukcją guza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjuj indukcję guza:
	<ol>
		<li>Zamień myszy DT ze zwykłej karmy na karmę doksycyklinową, aby indukować ekspresję czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)9 w komórkach pęcherzyków płucnych i zainicjować rozwój guza. Podawać doksycyklinę karm (200 ppm) ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź rozwój guzków nowotworowych w płucach myszy:
	<ol>
		<li>Wykonaj mikrotomografię komputerową, aby zidentyfikować rozwój guzków nowotworowych w porównaniu ze skanem przed indukcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena odpowiedzi na leczenie:
	<ol>
		<li>Aby przetestować zdolność mikrotomografii komputerowej do wykrywania zmian w guzkach nowotworowych w odpowiedzi na leczenie, należy podać inhibitor receptora FGF (FGFR) AZD4547, a następnie wykonać dodatkowe skany mikrotomografii komputerowej po 5 i 10 tygodniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena punktu końcowego:
	<ol>
		<li>Poddać eutanazji wszystkie myszy poddawane leczeniu i kontrolne oraz tkanki procesowe w celu oceny histologicznej (patrz punkt 6 poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy do akwizycji obrazu Micro-CT:
<ol>
	<li>Włącz mikrotomograf komputerowy i komputer.</li>
	<li>Kliknij oprogramowanie o nazwie "R_m CT2", a następnie kliknij "rozgrzej się".</li>
	<li>Wyjmij łoże próbki, na którym zostanie umieszczona mysz, z komory mikro-CT. Owiń łóżko folią.</li>
	<li>Ustaw skrzynkę indukcyjną znieczulenia, dodając izofluran do parownika anestezjologicznego do oznaczonego poziomu. Ustawić natężenie przepływu izofluranu na 3 l/min.</li>
	<li>Otwórz zbiornik tlenu, aby rozpocząć przepływ tlenu do skrzynki indukcyjnej i ustaw natężenie przepływu na 1 l/min.</li>
	<li>Umieść mysz w pudełku indukcyjnym do znieczulenia i upewnij się, że jest głęboko znieczulona przez brak spontanicznego ruchu i w odpowiedzi na uszczypnięcie skóry (delikatne uszczypnięcie małego fałdu skóry, które nie powoduje uszkodzenia tkanki ani pęknięcia skóry).</li>
	<li>Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia.</li>
	<li>Otwórz komorę mikro-tomografii komputerowej i umieść mysz grzbietową stroną do góry na łożu próbki. Przytrzymaj głowę myszy i pociągnij ciało w dół od kończyn dolnych, aby symetrycznie rozciągnąć i wyprostować ciało.</li>
	<li>Wyłącz dopływ znieczulenia do skrzynki indukcyjnej i włącz go w kierunku rurki łączącej się z komorą mikrotomografii komputerowej.</li>
	<li>Umieść rurkę anestezjologiczną w nosie myszy, aby podawać ciągłe znieczulenie.</li>
	<li>Aby zamocować mysz w odpowiedniej pozycji, owiń mysz i łoże próbki folią spożywczą. 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby mysz była w głębokim znieczuleniu i owinięta do łoża próbki, ponieważ każdy niewielki ruch lub skręcenie jej ciała podczas skanowania spowoduje zamglenie obrazów i trudności w interpretacji.</li>
	<li>Zamknij komorę mikro-CT.</li>
	<li>Dostosuj system mikro-CT do 90 kV i 160 μA, a czas skanowania do 4,5 min. Ustaw zakres obrazu na 24 × 19 mm, a rozmiar woksela na 50 × 50 × 50 μm. Użyj trybu synchronicznego dla uderzeń serca.</li>
	<li>Utwórz nowy folder w "Bazie danych", aby zapisać w nim nowe obrazy.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania przenieś mysz do pustej klatki i obserwuj ją, aż odzyska przytomność. Nie umieszczaj go z innymi myszami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje po skutkach znieczulenia.</li>
</ol>
3. Wizualizacja i analiza obrazu mikrotomografii komputerowej przed indukcją:
<ol>
	<li>Aby zobrazować obrazy mikro-CT, pobierz bezpłatne oprogramowanie ImageJ z następującej strony internetowej:<a href="http://imagej.nih.gov/ij/"> http://imagej.nih.gov/ij/</a> . Uwaga: Każdy plik danych mikro-CT to stos około 500 plików TIF (.tif). Można również użyć innego oprogramowania do przeglądania obrazów.</li>
	<li>Otwórz pliki z seryjnymi obrazami mikrotomografii komputerowej i przewiń wszystkie obrazy każdej myszy od szyi do brzucha lub odwrotnie.</li>
	<li>Korzystając ze skanów naiwnych myszy typu dzikiego, zidentyfikuj gęstość różnych obszarów i normalnych struktur anatomicznych w klatce piersiowej w oparciu o wiedzę na temat anatomii myszy (patrz ryc. 1A).
	<ol>
		<li>Przytrzymaj kursor myszką komputerową i przewiń w górę, zaczynając od białawych wnętrzności brzucha i przepony, przez klatkę piersiową i szyję.</li>
		<li>Zidentyfikuj punkty orientacyjne kostnej klatki piersiowej (mostek z przodu, kręgi z tyłu i żebra po bokach).</li>
		<li>Zidentyfikuj serce z przodu klatki piersiowej i główne naczynia krwionośne w pobliżu serca i śródpiersia.</li>
		<li>Obserwuj światło tchawicy (jako małe ciemne kółko na poziomie szyi i górnej części klatki piersiowej), które rozgałęzia się na prawe i lewe oskrzela główne, a następnie kontynuuje rozgałęzianie się na coraz mniejsze oskrzela. Należy pamiętać, że każde oskrzela są ściśle związane z dwoma lub trzema naczyniami krwionośnymi (ryc. 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij badanie skanów myszy z nieindukowaną mutacją DNA i zidentyfikuj obecność wszelkich nieprawidłowości.
	<ol>
		<li>Wyklucz myszy z nieprawidłowymi cieniami płuc przed indukcją (np. guzki, pęcherze rozedmowe itp.) z dalszych eksperymentów. (Rysunek 1C-E, G, H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Indukcja nowotworu:
<ol>
	<li>Aby wywołać rozwój guza u myszy eksperymentalnych, które wykazywały normalne skany płuc, zmień ich pokarm ze zwykłej karmy na karmę zawierającą doksycyklinę (200 ppm).</li>
</ol>
5. Dalsze skanowania:
<ol>
	<li>Po 10 tygodniach wykonaj drugą mikrotomografię komputerową wszystkich myszy, aby potwierdzić rozwój guzków nowotworowych w ich płucach (patrz ryc. 2).</li>
	<li>Podziel myszy na dwie grupy. Podawać bloker FGFR AZD4547 (125 μg/kg/dobę przez sondę żołądkową przez 6 dni/tydzień przez 10 tygodni) jednej grupie i placebo drugiej grupie kontrolnej przez kolejne 10 tygodni.</li>
	<li>Obserwuj zmiany w cieniach guzkowych, wykonując trzecie skanowanie 4-5 tygodni później.</li>
	<li>Pod koniec 10 tygodni leczenia należy wykonać czwarte skanowanie.</li>
	<li>Poddaj eutanazji wszystkie myszy za pomocą inhalacji CO2 lub wstrzyknięcia dootrzewnowego 0,1 mg/200 μl pentobarbitalu.</li>
	<li>Aby zidentyfikować dynamiczne zmiany w guzkach nowotworowych po indukcji i w odpowiedzi na leczenie, zidentyfikuj podobne pozycje na seryjnych obrazach skanowania tej samej myszy w dwóch lub więcej różnych punktach czasowych, a następnie sprawdź, czy pojawiają się/znikają wszelkie nieprawidłowe cienie (ryc. 3).</li>
	<li>Aby ułatwić identyfikację tej samej płaszczyzny u tej samej myszy w różnych punktach czasowych, spróbuj skojarzyć płaszczyznę zainteresowania z anatomicznymi strukturami punktów orientacyjnych w klatce piersiowej myszy.
	<ol>
		<li>Używaj punktów orientacyjnych, takich jak tchawica, jej rozwidlenie, prawe i lewe oskrzela główne, aorta, przepona i duże naczynia krwionośne. 
		Uwaga: Kości klatki piersiowej, w tym kręgi piersiowe, żebra i mostek, są mniej przydatne jako punkty orientacyjne pozycjonowania ze względu na powszechne niewielkie przechyły w ustawieniu ciała myszy na łóżku próbki, co zwiększa możliwość błędnej interpretacji pozycji skanowania. Podobnie, numer seryjny obrazu w pliku skanowania jest niewiarygodny w identyfikowaniu tej samej pozycji w czasie ze względu na zmianę długości korpusu myszy z jednego punktu czasowego na drugi. Niepowodzenie lub niedokładność w identyfikacji tej samej płaszczyzny w różnych punktach czasowych może skutkować fałszywie pozytywną/negatywną interpretacją wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Eutanazja myszy i zbieranie płuc:
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą inhalacji CO2 lub wstrzyknięcia dootrzewnowego 0,1 mg/200 μl pentobarbitalu.</li>
	<li>Odsłoń wnętrzności brzuszne, przecinając wzdłużnie ścianę brzucha. Odbezwieć mysz, aby zmniejszyć objętość krwi w płucach, przeprowadzając sekcję aorty brzusznej.</li>
	<li>Rozetnij przeponę drobnymi nożyczkami, co spowoduje utratę podciśnienia z jamy klatki piersiowej, a tym samym zapadnięcie się płuc. Odsłoń płuca i serce, przecinając i usuwając części żeber przedniej ściany klatki piersiowej. Oczyść przednią część szyi, przecinając skórę i tkanki miękkie, aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Odetnij serce i grasicę. Włóż kleszcze za tchawicę, aby oddzielić ją od przełyku.</li>
	<li>Zkaniuluj tchawicę za pomocą kaniuli G24, a następnie zabezpiecz ją na miejscu, dokręcając nić wokół włożonej części.</li>
	<li>Napompuj i utrwal płuco za pomocą lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) przez kaniulę tchawicy za pomocą 25-centymetrowej kolumny. Odłącz kaniulę i dokręć gwint, aby zapobiec wyciekowi PFA, a następnie odetnij górną tchawicę od jej przyczepu do krtani.</li>
	<li>Wyciągnij tchawicę z nici szwu i odetnij ją od jej przyczepu, a następnie kontynuuj w dół, aby usunąć ją za pomocą en-block płuca. Włóż go do 15 ml probówki zawierającej 5 ml 4% PFA. Pozostaw płuca w PFA O/N, aby zapewnić całkowitą penetrację i utrwalenie tkanki, a następnie przetwórz tkankę na standardowy blok parafinowy8.</li>
	<li>Pokrój bloki parafiny na plastry o grubości 6 um na mikrotomie i zabarwij hematoksyliną i eozyną przy użyciu standardowych technik.</li>
</ol>
7. Ocena histologiczna:
Uwaga: Chociaż użycie "skanera do slajdów" do cyfrowej oceny histologicznej jest tutaj opisane, możliwe jest również użycie zwykłych mikroskopów i wizualnej oceny histologicznej do oceny.
<ol>
	<li>Włącz skaner slajdów i komputer.</li>
	<li>Kliknij oprogramowanie "Skanowanie NDP".</li>
	<li>Wybierz tryb skanowania "Partia slajdów" i "Tryb półautomatyczny" do skanowania serii slajdów. 
	Uwaga: Ramię robota, które podnosi szkiełka podczas skanowania sekwencyjnego, jest bardzo wrażliwe na wszelkie nierówności na krawędziach szkiełek.</li>
	<li>Zbadaj palpacyjnie krawędzie wszystkich szkiełek przed załadowaniem ich do urządzenia. Jeśli szkło nakrywkowe lub zaschnięte medium montażowe jest wystające, wyczyść je nożem lub skalpelem.</li>
	<li>Załaduj slajdy do kasety na prowadnice. Otwórz właz na próbkę i wsuń kasetę w pozycję "jeden". Zamknij drzwi.</li>
	<li>W oprogramowaniu komputerowym nadaj krótkie opisowe nazwy wszystkim slajdom w odpowiadającym im miejscu na kasecie, a następnie kliknij przycisk "OK".</li>
	<li>Wybierz tryb profilu: "Brightfield".</li>
	<li>Kliknij "Rozpocznij wsad", aby rozpocząć skanowanie tymczasowe. 
	Uwaga: Gdy urządzenie zakończy skanowanie wszystkich preparatów, oprogramowanie automatycznie wykryje obszary z tkankami na wszystkich szkiełkach i zasugeruje je jako obszar zainteresowania.</li>
	<li>W razie potrzeby przedefiniuj obszar zainteresowania, przytrzymując lewy przycisk myszy i pociągając za krawędź regionu. 
	Uwaga: Zdefiniowanie zbyt dużych obszarów slajdów jako obszarów zainteresowania spowoduje znacznie dłuższy czas skanowania.</li>
	<li>Gdy będziesz zadowolony z obszarów zainteresowań na wszystkich slajdach, kliknij "Skanuj", aby rozpocząć skanowanie wszystkich slajdów. 
	Uwaga: Zeskanowane pliki można obserwować cyfrowo w niskiej i wysokiej rozdzielczości, a obrazy można eksportować jako pliki JPEG.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int. J. Cancer. 136, 359-386 (2015).</li>
<li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> Am. J. Transl. Res. 15, 114-118 (2014).</li>
<li>Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small-cell+lung+cancers%3A+a+heterogeneous+set+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases.</a> Nat. Rev. Cancer. 14, 535-546 (2014).</li>
<li>Kwon, M. C., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for lung cancer.</a> Mol. Oncol. 7, 165-177 (2013).</li>
<li>Malkinson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+susceptibility+to+lung+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of susceptibility to lung tumors in mice.</a> Toxicology. 54, 241-271 (1989).</li>
<li>Yin, Y., Betsuyaku, T., Garbow, J. R., Miao, J., Govindan, R., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+lung+adenocarcinoma+by+fibroblast+growth+factor+9+signaling+through+FGF+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of lung adenocarcinoma by fibroblast growth factor 9 signaling through FGF receptor 3.</a> Cancer Res. 73, 5730-5741 (2013).</li>
<li>Arai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cell+of+origin+and+propagation+potential+of+the+fibroblast+growth+factor+9-induced+mouse+model+of+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cell of origin and propagation potential of the fibroblast growth factor 9-induced mouse model of lung adenocarcinoma.</a> J. Pathol. 235, 593-605 (2015).</li>
<li>Paraffin processing of tissue. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Curtis, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumor+genotype+is+an+important+determinant+in+identification+of+lung+cancer+propagating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary tumor genotype is an important determinant in identification of lung cancer propagating cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 127-133 (2010).</li>
<li>Lau, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-propagating+cells+and+Yap%2FTaz+activity+contribute+to+lung+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis.</a> EMBO J. 33, 468-481 (2014).</li>
<li>Santos, A. M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J. L., Puré, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+fibroblast+activation+protein+inhibits+tumor+stromagenesis+and+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeting fibroblast activation protein inhibits tumor stromagenesis and growth in mice.</a> J Clin Invest. 119, 3613-3625 (2009).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Bioluminescence+Imaging+in+Small+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Bioluminescence Imaging in Small Animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Yao, R., Lecomte, R., Crawford, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Animal+PET%3A+What+Is+It%2C+and+Why+Do+We+Need+It%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med+Technol%22%5BJournal%5D)">Small-Animal PET: What Is It, and Why Do We Need It.</a> J Nucl Med Technol. 40, 157-165 (2012).</li>
<li>Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Engineering+transgenic+constructs+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview: Engineering transgenic constructs and mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda oparta na mikrotomografii komputerowej służąca do identyfikacji nieprawidłowości w płucach w czasie rzeczywistym oraz monitorowania rozwoju guzków nowotworowych i odpowiedzi na leczenie w modelach zwierzęcych raka płuc umożliwi naukowcom prowadzącym eksperymenty związane z rakiem płuc planowanie dokładniejszych i wydajniejszych eksperymentów przy jednoczesnej oszczędności czasu i zasobów. Wcześniej używaliśmy MRI w tym samym celu6. Klarowność skanu i próg wykrywania guzków płuc za pomocą M...

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów z powodu raka na całym świecie1. Badania nad zapobieganiem, wczesnym wykrywaniem i leczeniem raka płuc są prowadzone w wielu ośrodkach badawczych na całym świecie2,3. Opracowano kilka modeli zwierzęcych raka płuc, które okazały się przydatne w badaniu mechanizmów kancerogenezy płuc i komórek pochodzenia, w określaniu obecności nowotworowych komórek macierzystych oraz w badaniu różnych nowych strategii terapeutycznych4. Wcześniejsze modele opierały się na inicjacji guza wywołanej przez czynniki rakotwórcze u wrażliwych szczepów myszy5. Opracowanie modeli myszy z nokautem i transgenicznych, w których rak płuc powstaje w wyniku specyficznie zmanipulowanych zmian genetycznych, znacznie poprawiło naszą zdolność do kontrolowania indukcji guza i naśladowania kilku aspektów ludzkiego raka płuc4. Jednak głównym wyzwaniem w stosowaniu zwierzęcych modeli raka płuc jest brak metody czasu rzeczywistego do dokładnej identyfikacji i monitorowania początku i rozwoju nowotworów w płucach myszy oraz do dokumentowania wszelkich późniejszych zmian w ich rozmiarach, takich jak ich ciągły wzrost lub zmniejszenie w odpowiedzi na leczenie. Zmusiło to naukowców do zastosowania kilku technik czasochłonnych, wysiłkowych i zasobożernych w celu zidentyfikowania guzów i oceny ich wyników eksperymentalnych. Obecność wrodzonej zmienności między myszami w odpowiedzi na indukcję guza wymaga użycia dużej liczby zwierząt w każdej grupie eksperymentalnej w celu zmniejszenia zmienności danych. Brak możliwości oceny wzrostu guza lub odpowiedzi na leczenie w czasie rzeczywistym zmusił naukowców do ślepej eutanazji myszy w wielu punktach czasowych w przedłużonych protokołach eksperymentalnych, aby zagwarantować, że zbiorą właściwe dane, co skutkuje marnotrawstwem zasobów z próbek pobranych w punktach czasowych, które są albo za wcześnie, albo za późno.
W obecnym badaniu przedstawiono metodę wykorzystania skanera mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) dla małych zwierząt do wykrywania i monitorowania nowotworów płuc u żywych myszy. Użyliśmy naszych niedawno opisanych myszy podwójnie transgenicznych (DT) Sftpc-rtTA i Tre-Fgf9-ires-eGfp, u których szybko rozwija się gruczolakorak płuc po indukcji doksycykliną6,7. Zastosowanie mikro-tomografii komputerowej pozwala (między innymi) wykluczyć myszy z nieprawidłowymi nieprawidłowościami płuc przed indukcją, potwierdzić rozwój guzków nowotworowych w płucach po indukcji oraz obserwować zmiany w guzkach nowotworowych w odpowiedzi na leczenie eksperymentalne. Eutanazja końcowa myszy i ocena histologiczna potwierdziły dokładność oceny w czasie rzeczywistym przeprowadzonej za pomocą mikrotomografii komputerowej. Wierzymy, że technika ta utoruje drogę do przeprowadzania lepiej zaplanowanych eksperymentów z wykorzystaniem modeli zwierzęcych raka płuc, jednocześnie oszczędzając cenne zasoby, skracając czas obserwacji oraz zwiększając dokładność i zrozumienie wyników.

<table><tbody><tr><td>mikro-rentgenowskie&ndash; tomografia komputerowa</td><td>Rigaku</td><td>R_mCT2</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer RS Cyfrowy system patologii</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>RS C10730</td><td></td></tr><tr><td>NDP.view2&nbsp; Oprogramowanie do przeglądania</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>U12388-01</td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html</td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy - Lejek</td> z <td></td> komorą indukcyjną <td>VETEQUIP</td> 911103<td></td></tr><tr><td>, 2 l&nbsp; W9.5 i czasy; D23 i czasy; H9.5</td><td>VETEQUIP</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Mylan</td><td>ES2303-01</td><td></td></tr><tr><td>AZD 4547</td><td>LC Labratories</td><td>A-1088</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu</td><td>SOM02-YA1312</td><td></td></tr><tr><td>G24 kaniula&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SP-FS2419</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>SLC Japonia/PMI Nutrition International</td><td>5TP7</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ&nbsp;</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Puralube maść weterynaryjna (lubrykant do oczu)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Rak płuc jest najbardziej śmiertelnym nowotworem na świecie. Na całym świecie prowadzone są intensywne badania mające na celu zidentyfikowanie nowych metod leczenia raka płuc. Kilka mysich modeli raka płuc jest wykorzystywanych do badania mechanizmu rozwoju raka i eksperymentowania z różnymi strategiami terapeutycznymi. Jednak brak techniki w czasie rzeczywistym do identyfikacji rozwoju guzków nowotworowych w płucach myszy i monitorowania zmian ich wielkości w odpowiedzi na różne interwencje eksperymentalne i terapeutyczne utrudnia uzyskanie dokładnego opisu przebiegu choroby i jej szybkiej reakcji na leczenie. W pracy opisano metodę wykorzystującą skaner mikrotomografii komputerowej (CT) do wykrywania rozwoju nowotworów płuc w mysim modelu gruczolakoraka płuc. Następnie pokazujemy, że comiesięczna obserwacja za pomocą mikrotomografii komputerowej może zidentyfikować dynamiczne zmiany w guzie płuca, takie jak pojawienie się dodatkowych guzków, zwiększenie wielkości wcześniej wykrytych guzków oraz zmniejszenie wielkości lub całkowitego ustąpienia guzków w odpowiedzi na leczenie. Ostatecznie dokładność tej metody oceny w czasie rzeczywistym została potwierdzona za pomocą ilościowej oceny histologicznej punktu końcowego. Technika ta toruje drogę do planowania i przeprowadzania bardziej złożonych eksperymentów na modelach zwierzęcych raka płuc i umożliwia nam lepsze zrozumienie mechanizmów kancerogenezy i skutków różnych metod leczenia, przy jednoczesnej oszczędności czasu i zasobów.

Identyfikację myszy z nieprawidłowościami w płucach przeprowadzono w punkcie wyjściowym. Przed indukcją guza, gdy myszy DT miały od 8 do 12 tygodni, wykonano mikro-CT płuc wszystkich zwierząt. Co zaskakujące, u około 50% myszy stwierdzono nieprawidłowości, które zmusiły nas do uznania ich za nieodpowiednie do włączenia w dalsze badanie. Nieprawidłowości te miały postać cieni guzkowatych, dużych pojedynczych lub wielu małych pęcherzy rozedmowych i/lub niedodmy płatowej (Ryc. 1A, C,...

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie zalet wykorzystania mikro-tomografii komputerowej (Micro CT) w ocenie rozwoju guza, odpowiedzi na leczenie oraz w innych eksperymentach na modelach mysich raka płuc. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem płuc z wykorzystaniem modeli mysich, takie jak moment rozpoczęcia wzrostu guzów, tempo ich wzrostu oraz odpowiedź na interwencje terapeutyczne. Technika ta umożliwia zidentyfikowanie zwierząt, które powinny zostać wykluczone z badania, przy jednoczesnym wykrywaniu w czasie rzeczywistym zmian w wielkości ich guzów.Technika ta pozwala zaoszczędzić czas i wysiłek oraz znacząco zmniejsza liczbę myszy w grupie badawczej. Z poziomu skanera Micro-CT uzyskaj dostęp do sterowania komputerowego i otwórz pakiet oprogramowania o nazwie RMCT2. Następnie uruchom cykl rozgrzewania. W kolejnym kroku przygotuj stół skanera dla myszy, owijając go folią plastikową.Następnie znieczul mysz izofluranem i potwierdź wystąpienie znieczulenia za pomocą ucisku skóry. Wystarczy delikatne uszczypnięcie niewielkiego fałdu skóry. Następnie nałóż maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.Teraz umieść mysz grzbietem do góry na podkładce do próbek. Przytrzymaj głowę myszy i pociągnij ciało w dół za kończyny dolne, aby je symetrycznie rozciągnąć i wyprostować. Następnie skieruj gaz anestetyczny do komory i umieść rurkę z gazem obok nosa zwierzęcia, aby podawać anestetyk w sposób ciągły.Następnie owiń mysz i podłoże próbki folią plastikową, aby unieruchomić zwierzę. Upewnij się, że mysz jest stabilnie zamocowana, ponieważ każdy ruch lub obrót podczas skanowania spowoduje powstanie niewyraźnych, bezużytecznych obrazów. Teraz zamknij komorę, ustaw system na 90 kV i 160 µA oraz ustaw czas skanowania na 4,5 minuty.Ustaw zakres obrazowania na 24 millimeters. Następnie przełącz system w tryb synchroniczny dla uderzeń serca. Teraz utwórz w bazie danych nowy folder dla nowych obrazów i rozpocznij skanowanie.Po zakończeniu skanowania przenieś mysz do pustej klatki i obserwuj ją, aż odzyska przytomność. Nie zwracaj jej do współlokatorów, dopóki całkowicie nie wybudzi się z narkozy. Otwórz seryjne pliki obrazów micro CT w programie ImageJ. Przewiń wszystkie obrazy każdej myszy od szyi do brzucha lub odwrotnie.Teraz, korzystając ze skanów naiwnych myszy typu dzikiego, określ gęstość różnych obszarów i prawidłowe struktury anatomiczne w klatce piersiowej. Przewiń w górę do białawych trzewi brzusznych i przepony, a następnie zidentyfikuj obszar przechodzący przez klatkę piersiową aż do szyi. Zwróć uwagę na kostne punkty orientacyjne klatki piersiowej: mostek, kręgi oraz żebra.Następnie zidentyfikuj serce w przedniej części klatki piersiowej oraz główne naczynia krwionośne w pobliżu serca i w śródpiersiu. Światło tchawicy to mały ciemny okrąg na poziomie szyi i górnej części klatki piersiowej, który rozwidla się w prawy i lewy oskrzele główne, a następnie nadal dzieli się na coraz mniejsze oskrzela. Zauważ, że każde oskrzele jest ściśle powiązane z dwoma lub trzema naczyniami krwionośnymi.Następnie należy rozpocząć analizę skanów nieindukowanych myszy DT i zidentyfikować obecność wszelkich nieprawidłowości. Z eksperymentu należy wykluczyć wszystkie myszy z nieprawidłowymi obrazami płuc przed indukcją, takimi jak guzki lub pęcherze rozedmowe. W tym eksperymencie należy użyć myszy z prawidłowymi skanami płuc, które są zdolne do wytworzenia guzów indukowanych przez FGF9.Aby wywołać guzy, należy podawać doksycyklinę w paszy w stężeniu 200 ppm. Po 10 tygodniach należy przeprowadzić drugie badanie mikro-CT tych myszy, aby potwierdzić rozwój guzków nowotworowych w ich płucach. Następnie myszy należy podzielić na dwie grupy.Podawaj bloker FGFR, AZD4547, jednej grupie za pomocą zgłębnika żołądkowego. Czynność tę wykonuj przez 6 dni w tygodniu przez okres 10 tygodni. Drugiej grupie podawaj placebo.Monitoruj zmiany w obrazach guzków, wykonując trzecie skanowanie w czwartym lub piątym tygodniu leczenia. Następnie, po zakończeniu pełnego, 10-tygodniowego cyklu leczenia, wykonaj czwarte skanowanie. W dalszej kolejności określ zmiany dynamiczne w guzkach nowotworowych w odpowiedzi na leczenie, porównując analogiczne obszary na obrazach z serii skanowań wykonanych w różnych punktach czasowych.Należy zwrócić uwagę na pojawienie się lub zanik wszelkich nieprawidłowych zacienień. Prawidłowe zorientowanie w tej samej pozycji anatomicznej jest kluczowe dla interpretacji wyników. Należy wykorzystać łatwo identyfikowalne punkty orientacyjne w obrębie klatki piersiowej, takie jak tchawica, jej rozwidlenie, prawy i lewy oskrzele główne, aorta i duże naczynia krwionośne oraz przepona.Ze względu na nachylenie ciała, kości są mniej przydatnymi punktami orientacyjnymi. Po eutanazji myszy i odsłonięciu szyi oraz płuc, wyciąć serce i grasicę. Wprowadzić pęsetę za tchawicę, aby oddzielić ją od przełyku.Następnie przeprowadź kaniulację tchawicy za pomocą kaniuli G24 i zabezpiecz ją, zawiązując szew wokół końcówki wewnątrztchawiczej. Teraz napompuj i utrwal płuco, wprowadzając przez kaniulę lodowaty 4%PFA przy użyciu słupa cieczy o wysokości 25cm. Następnie odłącz kaniulę i zaciśnij węzeł na tchawicy, aby zapobiec wyciekowi PFA.Teraz odetnij górną część tchawicy, wraz z jej przyczepem do krtani. Odciągając tchawicę od nici szwu, oddziel tchawicę i płuca od wszystkich tkanek otaczających. Następnie usuń tchawicę wraz z płucami en bloc.Umieścić tkanki w probówce 15 ml zawierającej 5 ml 4% PFA w temperaturze pokojowej. Pozostawić płuca w PFA przez noc w celu całkowitej penetracji i utrwalenia tkanki. Następnie przetworzyć tkankę w sposób rutynowy.Podczas wstępnej selekcji myszy DT w wieku od 8 do 12 tygodni do niniejszego badania, u około połowy z nich w badaniu Micro-CT stwierdzono nieprawidłowości w płucach, co wykluczyło je z udziału w eksperymencie. W badaniu indukcję guza aktywowano na okres 10 tygodni, po czym zastosowano leczenie. U myszy, którym przez 10 tygodni podawano inhibitor FGFR, AZD4547, zaobserwowano zanik lub zmniejszenie rozmiarów guzków, które były widoczne w skanach wykonanych przed rozpoczęciem leczenia.Z drugiej strony, u myszy kontrolnych otrzymujących placebo nie zaobserwowano zmian, odnotowano zwiększenie wielkości guzków i/lub pojawienie się nowych guzków. Końcowa ocena histologiczna płuc potwierdziła dokładność wyników uzyskanych za pomocą skanowania Micro-CT. Myszy, u których stwierdzono brak zmian w płucach, rzeczywiście wykazywały prawidłową histologię płuc.Z kolei u myszy, u których wystąpiły nieprawidłowości, zaobserwowano różne zmiany histologiczne, w tym pęcherze i guzki. Po 10-12 tygodniach indukcji doksycykliną u wszystkich zwierząt stwierdzono liczne guzki gruczolakoraka o różnej wielkości i lokalizacji. Następujące po tym leczenie blokerem FGFR przez 10-12 tygodni doprowadziło do zmniejszenia liczby i rozmiarów guzków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania mikro-CT do oceny rozwoju nowotworu w płucach myszy, a także do monitorowania wszelkich zmian w tych guzach w odpowiedzi na różne procedury eksperymentalne. Po rozpoczęciu procesu u myszy skany mogą być wykonywane w czasie krótszym niż 10 minut na jedną mysz.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu myszy w głębokiej anestezji oraz o jej bezpiecznym przymocowaniu do podłoża z próbką, aby zminimalizować ruchy podczas skanowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka płuc i nowotworowych komórek macierzystych do badania zakresu rozwoju guza, progresywnej regresji oraz planowania różnych eksperymentów. Należy pamiętać, że praca z promieniami Rentgena może być niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać standardowych zasad obsługi urządzenia.

using-micro-computed-tomography-for-assessment-tumor-development

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

W tym protokole opisujemy, jak wykorzystać pozytonową tomografię emisyjną [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy i obrazowanie tomografii komputerowej (18F-FDG PET/CT) do pomiaru odpowiedzi metabolicznej guza na terapię celowaną MLN0128 w mysim modelu raka płuc z mutacją Kras/Lkb1 oraz obrazowania sprzężonego z autoradiografią ex vivo o wysokiej rozdzielczości i histologią ilościową.

Wykorzystanie obrazowania PET/CT 18F-FDG i histologii ilościowej do pomiaru dynamicznych zmian w metabolizmie glukozy w mysich modelach raka płuc

Ten artykuł opisuje generowanie ortotopowego mysiego modelu ludzkiego międzybłoniaka opłucnej poprzez wszczepienie komórek międzybłoniaka H2052/484 do jamy opłucnej myszy z obniżoną odpornością. Podłużne monitorowanie rozwoju guzów wewnątrzopłucnowych oceniano za pomocą nieinwazyjnej multimodalnej [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy pozytonowej tomografii emisyjnej i obrazowania tomografii komputerowej.

Implantacja i monitorowanie za pomocą PET/CT ortotopowego modelu ludzkiego międzybłoniaka opłucnej u myszy z atymią

Ten protokół opisuje kroki podjęte w celu wywołania guzów płuc KRAS u myszy, jak również ilościowe określenie powstałych guzów za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Małe guzy są wizualizowane we wczesnych punktach czasowych jako linie B. W późniejszych punktach czasowych pomiary względnej objętości guza są osiągane za pomocą narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu ultrasonograficznym.

Wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego

W tej publikacji opisujemy protokoły oceny klirensu śluzowo-rzęskowego dróg oddechowych (MCC) u myszy in vivo z wykorzystaniem obrazowania radionuklidów o podwójnej modalności. Protokół ten jest przeznaczony do tomografii komputerowej z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i protokołu akwizycji tomografii komputerowej (CT) przy użyciu mysich kolimatorów całego ciała (MWB) w podwójnym systemie SPECT/CT.

Ocena in vivo klirensu śluzowo-rzęskowego u myszy

Obecny protokół opisuje ultrasonografię wysokiej częstotliwości do wizualizacji całej tarczycy myszy i monitorowania wzrostu anaplastycznego raka tarczycy.

Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj mikrotomografię komputerową do oceny rozwoju guza i odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc. Ta technika umożliwia monitorowanie zmian wielkości guzów w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Przeglądaj więcej filmów