Name: Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Naucz się izolacji pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych myszy. Ta metoda pozwala uzyskać czystą populację komórek do badań mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01HL056046 do PAL i K99HL116769 do AJT) oraz The Research Institute at Nationwide Children's Hospital (do PAL i AJT).

Oświadczenie etyczne: To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Nationwide Children's Hospital.
1. Przygotowanie/Konfiguracja
Uwaga: Ta technika izolacji wymaga dwóch wężownic grzewczych Langendorff umieszczonych obok siebie na stojaku pierścieniowym i połączonych równolegle z obiegową łaźnią wodną.
<ol>
	<li>Włącz łaźnię z wodą obiegową i dostosuj temperaturę, aby osiągnąć temperaturę końcową 33-34 °C na końcówce kaniuli Langendorffa (łaźnia wodna używana w tej konfiguracji jest ustawiona na 40 °C z powodu utraty temperatury o 6-7 °C na rurce). Włącz pompy perfuzyjne i ustaw szybkość perfuzji na 0,5 ml/min.
	<ol>
		<li>Wyczyść obie wężownice grzewcze z płaszczem wodnym, dołączone rurki i kaniulę o rozmiarze 25, przepłukując każdą z nich 50 ml 70% etanolu, a następnie 100 ml autoklawowanej ultraczystej wody.</li>
		<li>Wyczyść wężownice grzewcze, przepychając powietrze strzykawką i przemyj 10 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) bez czerwieni fenolowej. Pozostaw HBSS w wężownicach grzewczych i rurkach.</li>
		<li>Podłączyć do rurki sterylną strzykawkę typu luer-lock o pojemności 10 ml wypełnioną HBSS o temperaturze pokojowej bez czerwieni fenolowej. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w rurkach i wężownicach grzewczych podczas podłączania strzykawki wypełnionej HBSS, ponieważ może to spowodować zatorowość powietrzną podczas trawienia, co może negatywnie wpłynąć na izolację VSMC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij kaniulę o rozmiarze 25 z wężownic grzewczych i umieść na innej sterylnej strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej lodowatym HBSS bez czerwieni fenolowej. Trzymaj to na lodzie, aż będzie gotowe do użycia. Powtórz dla drugiej kaniuli.</li>
	<li>Przygotować roztwór do trawienia enzymatycznego.
	<ol>
		<li>Zważyć kolagenazę typu 2 zgodnie z konkretnym numerem partii na 75 ml roztworu wytrawiającego w celu uzyskania końcowego stężenia 300 jednostek/ml.</li>
		<li>Rozpuść kolagenazę w 75 ml HBSS z czerwienią fenolową. Następnie dodać do mieszaniny 1,5 ml 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej i 75 μl 1 M CaCl2 do mieszaniny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku natychmiastowego użycia roztworu wytrawiającego należy go ogrzać do temperatury 37 °C. Jeśli nie, umieść go w temperaturze 4 °C na maksymalnie 6 godzin. To rozwiązanie musi być codziennie świeże.</li>
	<li>Przygotować roztwór zatrzymujący/podłoże galwaniczne.
	<ol>
		<li>Dodać 100 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml HEPES i 1 ml primocyny do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l). Zalecana jest sterylizacja filtra.</li>
		<li>Podwielokrotność 6 ml roztworu zatrzymanego do każdej z dwunastu stożkowych probówek o pojemności 15 ml ponumerowanych A1-A6 i B1-B6 i umieścić w temperaturze 4 °C. Podamy 50 ml roztworu zatrzymanego do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Ten krok można również przygotować dzień przed izolacją, jeśli to konieczne. Ten roztwór zatrzymujący zostanie użyty jako medium galwaniczne po izolacji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwie strzykawki o pojemności 1 ml wyposażone w igłę 30 G ze 100 μl heparyny (1 000 jednostek/ml).</li>
	<li>Wytnij 5 cm kawałek jedwabiu chirurgicznego 5-0. Zawiąż luźny węzeł z jedwabiu chirurgicznego tak, aby jeden koniec był dwa razy dłuższy od drugiego. Umieść na kaniuli o rozmiarze 25, ale nie dokjaj. Powtórz tę czynność dla drugiej kaniuli 25 G.</li>
	<li>Napełnij cztery sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm (#1-4) 2 ml sterylnego, lodowatego HBSS bez czerwieni fenolowej. Trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
2. Eutanazja, izolacja serca i kaniulacja
<ol>
	<li>Przed izolacją serca upewnij się, że roztwór trawiący i 50 ml stożkowego lub zatrzymującego roztwór są ciepłe. Wyjąć strzykawkę wypełnioną HBSS z dołączoną kaniulą 25 G z lodu i umieścić w biurety clamp (lub stojak pierścieniowy clamp) na stojaku pierścieniowym.</li>
	<li>Znieczulij myszy za pomocą 3% izofluoranu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona, dotykając palcami każdej tylnej kończyny. Jeśli noga drga, mysz nie jest jeszcze znieczulona, więc odczekaj 1 minutę i powtórz dotyk palca.</li>
	<li>Odsłoń żyłę szyjną, usuwając nożyczkami sierść i skórę z przodu szyi. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń tłuszcz otaczający żyłę szyjną. Po usunięciu tłuszczu powoli wstrzyknij 100 μl heparyny (1000 jednostek/ml). Umieść gąbkę chirurgiczną na żyle, aby uniknąć nadmiernego krwawienia.</li>
	<li>Po 1 minucie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce, podnieś serce zakrzywionymi kleszczami i wytnij je nożyczkami, upewniając się, że aorta wstępująca jest nienaruszona przez pierwszą gałąź ramienno-głowową. Natychmiast umieść serce w naczyniu o średnicy 35 mm z lodowatym HBSS bez czerwieni fenolowej i spłucz. 
	Uwaga: Wykonaj następujące 4 kroki za pomocą lunety sekcyjnej.</li>
	<li>Ustaw kaniulę 25 G, która jest zamontowana na statywie pierścieniowym pod kątem 45°, tak aby końcówka znajdowała się tuż pod powierzchnią lodowatego HBSS w naczyniu #2 i była wyraźnie widoczna przez mikroskop preparacyjny. Przełóż serce do naczynia #2.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy Dumonta odsłoń aortę, delikatnie usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej poprzez rozwarstwienie, aby zapobiec przebiciu lub rozerwaniu aorty. Następnie za pomocą kleszczy nasuń aortę na kaniulę 25 G.</li>
	<li>Poprowadź kaniulę w dół przez aortę, blisko, ale nie poza zastawkę aortalną, co zagrozi integralności zastawki, a tym samym perfuzji wstecznej. Gdy kaniula znajdzie się na miejscu, nasuń wstępnie zawiązany jedwab na aortę i dokręć. Zawiąż drugi węzeł, aby utworzyć kwadratowy węzeł wokół aorty, aby zabezpieczyć serce.</li>
	<li>Po bezpiecznym zawiązaniu aorty delikatnie wypłucz pozostałą krew z krążenia wieńcowego za pomocą lodowatego HBSS w strzykawce podłączonej do kaniuli 25 G. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia wieńcowego. Do zakończenia spłukiwania wymagane jest tylko bardzo powolne i delikatne spłukiwanie. Podczas tego delikatnego płukania można również zaobserwować szczelną kaniulację aorty.</li>
	<li>Włącz pompę perfuzyjną, aby rozpocząć przepływ HBSS. Wyjmij kaniulę 25 G (z dołączonym sercem) ze strzykawki wypełnionej HBSS, uważając, aby piasta kaniuli była wypełniona HBSS i podłącz ją do ciepłych wężownic grzewczych wypełnionych HBSS. Rozpocznij perfuzję serca za pomocą pompy perfuzyjnej z szybkością 0,5 ml/min przez 8 minut.</li>
	<li>Po kaniulacji pierwszego serca i jego perfuzji w systemie, powtórz kroki 2.1-2.8 dla drugiego serca. Izolacje te będą rozłożone w czasie dla każdego serca, dlatego wymagane jest staranne planowanie i czas.</li>
</ol>
3. Trawienie
<ol>
	<li>Po przepłukaniu HBSS należy zmienić strzykawkę o pojemności 10 ml HBSS znajdującą się obecnie na pompie na strzykawkę wypełnioną 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu do wytrawiania. Ukrwić każde serce roztworem trawiącym przez 12 minut z szybkością 0,5 ml/min. Nie zbieraj frakcji pochodzących z tego pierwszego trawienia, ponieważ będzie to zawierało resztki krwi i komórek śródbłonka.</li>
	<li>Po 12 minutach zmienić szybkość perfuzji na 0,4 ml/min, umieścić 15 ml stożkowego (probówka A1 lub B1, odpowiadająca pierwszemu lub drugiemu sercu dla każdego trawienia) wypełnionego zimnym roztworem zatrzymującym w pojemniku na lód pod sercem, aby rozpocząć zbieranie perfuzatu wzbogaconego VSMC.</li>
	<li>Po 15 minutach natychmiast po zebraniu obu frakcji zmienić stożkową rurkę zbiorczą na rurkę A2 lub B2 i wirować stożkową probówkę A1 i B1 o gramaturze 89 x g. Gdy w strzykawce napełnionej roztworem wytrawiającym na pompie znajduje się mniej niż 1 ml roztworu, należy zastąpić świeżo napełnioną strzykawką o pojemności 10 ml z roztworem wytrawiającym.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant z każdej probówki zbiorczej, pozostawiając około 0,5 ml. Zawiesić osad z A1 za pomocą 2 ml ciepłego roztworu zatrzymującego (lub podłoża do powlekania). Dodać ponownie zawiesinę z probówki A1 do probówki B1 i umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z luźną nakrętką.</li>
	<li>Powtarzać kroki 3.3 i 3.4, aż wszystkie probówki (przez A6 i B6) zostaną zużyte przez łączny czas zbierania 90 minut. Po 80 minutach trawienia rozetnij wierzchołek serca, aby wypłukać wszelkie komórki, które mogą być uwięzione w komorze i zbierz te komórki odpowiednio w probówce A6 i B6. 
	Uwaga: Czasami serce spadnie z kaniuli przed upływem 90 minut. W takim przypadku należy pobrać serce i umieścić je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej 2 ml roztworu trawiącego. Odetnij wierzchołek serca i delikatnie opłucz serce roztworem trawiącym. Następnie przefiltrować 2 ml roztworu wytrawiającego przez sterylne sitko do komórek 100 μm do stożkowego o pojemności 50 ml i dodać do probówki A6 lub B6.</li>
	<li>Po każdym wirowaniu kolejnych probówek (A2 i B2) dodaj zawieszone VSMC do poprzedniej probówki zbiorczej (połączone A1 i B1). Należy również uważać, aby nie dopuścić do wyczerpania się roztworu wytrawiającego w pompie i w razie potrzeby zmieniać strzykawki o pojemności 10 ml przez cały czas trawienia.</li>
	<li>Po połączeniu wszystkich probówek odwirować zawiesinę bogatą w VSMC o stężeniu 89 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odessać jak najwięcej supernatantu z probówek zbiorczych. Zawiesić pozostały osad w 2 ml podłoża galwanicznego i płytki na jednym naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa
Uwaga: Wykonaj pozostałe kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Po 24 godzinach delikatnie zassać media galwaniczne. Kultura zwykle będzie zawierała dużą ilość gruzu. Aby umyć komórki, dodaj 2 ml ciepłego, sterylnego PBS i delikatnie postukaj naczyniem o dwa palce, obracając się ruchem wskazówek zegara.</li>
	<li>Po obróceniu o 360° zassać PBS i powtórzyć po raz drugi. Odessać PBS i dodać kolejne 2 ml sterylnego, ciepłego PBS. Sprawdź naczynie hodowlane pod mikroskopem, aby upewnić się, że na talerzu nie ma żadnych zanieczyszczeń. W tym czasie można również określić zbieg komórek.</li>
	<li>Jeśli w naczyniu hodowlanym pozostaną zanieczyszczenia, powtórz krok 4.2. Jeśli naczynie hodowlane jest wolne od zanieczyszczeń, odessać PBS i dodać 2 ml ciepłego podłoża galwanicznego.</li>
	<li>Po 24 godzinach ponownie umyj komórki ciepłym, sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie końcowe zanieczyszczenia lub martwe komórki z hodowli. Odessać PBS i umieścić kolejne 2 ml ciepłego podłoża galwanicznego na komórkach.</li>
	<li>Sprawdzaj stan komórek codziennie i podawaj je co 48 godzin świeżym, podgrzanym podłożem galwanicznym. W tym momencie komórki można wykorzystać do standardowych testów hodowli komórkowych. VSMC powinny być w około 80% zlewające się 4-5 dni po posiewaniu, chociaż może minąć do 7 dni, zanim procedura zostanie udoskonalona. W przypadku dzielenia na kolejne przejścia należy użyć maksymalnie szalek o średnicy 1:4 35 mm (lub do porównywalnego obszaru szalek hodowlanych).</li>
</ol>

<ol><li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+%28db%2Fdb%29+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li>
<li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li>
<li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li>
<li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+two-phase+Ca2%2B+release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li>
<li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SM22+alpha%2C+a+marker+of+adult+smooth+muscle%2C+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li>
<li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro%3A+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li>
<li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db%2Fdb+mice+undergo+outward+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337(2011).</li>
<li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celem tego badania było dostosowanie istniejących protokołów izolacji komórek w celu zwiększenia wydajności gładkich naczyń wieńcowych z mysich serc. Większość pionierskich prac w zakresie biologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych przeprowadzono na hodowanych komórkach mięśni gładkich aorty szczura. Badania te dostarczyły podstawowej wiedzy na temat mechanizmów molekularnych, które kontrolują wzrost, migrację i hipertrofię VSMC7. Jednak wraz z postępem w tej dziedzinie stało się jasne, że fenotyp i funkcja ...

Celem tej metody jest odizolowanie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) od mysiego krążenia wieńcowego do wykorzystania w hodowlach komórkowych i standardowych testach hodowli komórkowych. Opracowaliśmy tę technikę do oceny molekularnych mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w cukrzycy. Wcześniej informowaliśmy o wewnętrznej przebudowie przerostowej w przegrodach tętniczek wieńcowych w mysim modelu cukrzycy db / db1. Ze względu na ograniczoną ilość tkanki znajdującej się w wieńcach przegrody mysiej, standardowe techniki eksperymentalne badające zmiany białek (np. Western blot) u myszy db/db i kontrolnych są w najlepszym razie trudne. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że bloker receptora angiotensyny (ARB) losartan zmniejsza przebudowę obserwowaną u myszy db / db2. Dlatego izolacja pierwotnych VSMC z krążenia wieńcowego pozwala nam na dalsze badanie zmian w fenotypie VSMC lub aktywowanych szlakach sygnałowych u myszy z cukrzycą, które mogą przyczyniać się do niekorzystnej przebudowy tętniczek wieńcowych.
Liczne badania wyjaśniły kanoniczne szlaki sygnałowe za pomocą VSMC izolowanych z aorty gryzoni, a nie w każdym konkretnym łożysku naczyniowym. Wykazaliśmy jednak specyficzną dla łożyska naczyniowego przebudowę w krążeniu wieńcowym, aortalnym i krezkowym myszy db / db1, co sugeruje, że VSMC w każdym łożysku naczyniowym mogą być różne. Dlatego konieczne jest wyizolowanie VSMC z każdego łożyska naczyniowego, aby lepiej zrozumieć zmiany patologiczne zachodzące w każdym zestawie VSMC. Istnieje wiele różnych metod izolowania i hodowli VSMC aorty. Jednak obecnie opublikowano tylko jedno badanie dotyczące izolacji VSMC z krążenia wieńcowego myszy3. Teng i wsp. był pierwszym, który poinformował o metodzie izolowania VSMC od krążenia wieńcowego myszy; Jednak znacznie zmieniliśmy protokół, ponieważ wyizolowano również komórki śródbłonka. Inne laboratoria również wykorzystały protokół Teng i wsp. do wyizolowania miocytów tętnic wieńcowych i komórek mięśni gładkich dróg oddechowych4,5. Zmiany, które wprowadziliśmy, stworzą populację komórek wysoce wzbogaconych o VSMC z krążenia wieńcowego.
Wsteczna perfuzja izolowanego serca ssaków, czyli technika Langendorffa, została zapoczątkowana w 1897 roku6 przez Oscara Langendorffa i jest nadal szeroko stosowana do izolacji komórek sercowo-naczyniowych. Zaprezentowana tu technika, w połączeniu z postępem w nowoczesnych modyfikacjach genetycznych myszy, stanowi cenne narzędzie do dokładniejszego badania zachowania molekularnego VSMC z krążenia wieńcowego.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M roztwór</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoka glukoza, pirogronian sodu, L-glutamina)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko komórkowe 100 &micro; m siatka nylonowa</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Naczynie polistrenowe z pokrywką, sterylne, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Aparat Harvarda jedwabny szew 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ-2&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płynny (klarowny)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płyn (czerwień fenolowa)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>Wężownica grzewcza 5,0 ml z odgazowującą pułapką bąbelkową</td><td>Pompa Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td> cyrkulacyjna podgrzewanej wody <td>dowolnej marki będzie działać</td></tr></tbody></table>

izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Chociaż izolacja i hodowla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z dużych naczyń krwionośnych jest dobrze znana, staraliśmy się wyizolować i hodować VSMC z krążenia wieńcowego. Serca z nienaruszonymi łukami aorty usunięto i perfuzjono za pomocą wstecznego Langendorffa z roztworem trawiącym zawierającym 300 jednostek/ml kolagenazy typu II, 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej i 1 M CaCl2. Perfuzaty zbierano w odstępach 15-minutowych przez 90 minut, granulowano przez wirowanie, ponownie zawieszono w pożywkach galwanicznych i posiewano na szalkach do hodowli tkankowych. VSMC charakteryzowały się obecnością SM22α, α-SMA i wimentyny. Jedną z głównych zalet stosowania tej techniki jest możliwość izolowania VSMC z krążenia wieńcowego myszy. Chociaż niewielka liczba uzyskanych komórek może ograniczać niektóre zastosowania, do których można wykorzystać komórki, izolowane VSMC naczyń wieńcowych mogą być stosowane w różnych dobrze znanych technikach i testach hodowli komórkowych. Badania nad VSMC od genetycznie zmodyfikowanych myszy mogą dostarczyć dalszych informacji na temat struktury, funkcji i procesów sygnalizacyjnych związanych z patologiami naczyniowymi.

Ze względu na nowatorski charakter naszej techniki izolacji VSMC tętnic wieńcowych, postanowiliśmy określić czystość wyizolowanych komórek. Mysie VSMC tętnic wieńcowych identyfikowano na podstawie ich morfologii oraz barwienia immunofluorescencyjnego do drugiego pasażu. Na podstawie morfologii komórek w hodowli po pierwszym przemyciu stwierdzono, że procedura izolacji skutecznie usuwa kardiomiocyty i komórki śródbłonka. Komórki VSMC zachowują swoją morfologię do drugiego pasażu (R...

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja komórek mięśni gładkich naczyń z krążenia wieńcowego myszy w celu ich hodowli i wykorzystania w standardowych testach hodowli komórkowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny kardiologii i naczyniologii, takie jak to, jakie główne mechanizmy chorobowe wpływają na zachowanie pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych myszy. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie w większości czystej populacji pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych myszy.Przed rozpoczęciem procedury należy podłączyć do przewodów pompy perfuzyjnej sterylną strzykawkę 10 ml typu Leur Lock wypełnioną HBSS bez czerwieni fenolowej o temperaturze pokojowej. Następnie należy przenieść każdą z kaniul 25G z cewek grzewczych na oddzielne strzykawki 10 ml wypełnione schłodzonym HBSS bez czerwieni fenolowej. Strzykawki należy umieścić w lodzie.Następnie zawiąż luźne węzły nadgarstkowe na dwóch pięciocentymetrowych odcinkach szwu jedwabnego w taki sposób, aby jeden koniec był dwukrotnie dłuższy od drugiego. Nałóż jeden węzeł na każdą z kaniul o rozmiarze 25G, nie zaciągając go, a jedną z strzykawek wypełnionych HBSS umieść

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pępowiny są wykorzystywane do izolacji komórek mięśni gładkich za pomocą różnych metod. W niniejszej pracy do izolacji komórek mięśni gładkich zastosowano obróbkę enzymatyczną.

Izolacja ludzkich komórek mięśni gładkich tętnicy pępowinowej (HUASMC)

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Opracowaliśmy nowatorską i powtarzalną technikę izolowania pierwotnych kultur komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (PASMC) od myszy w wieku P7, umożliwiając tym samym lepsze badanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich noworodków.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej od nowonarodzonych myszy

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Reakcje naczyniowe tętniczego krążenia płucnego można badać za pomocą komórek tętnicy śródpłucnej (IPA) i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). W niniejszym badaniu szczegółowo opisano izolację IPA oraz protokoły stosowane do badania wazorelaksacji w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne.

Izolacja komórek tętnic wewnątrzpłucnych i mięśni gładkich w celu zbadania odpowiedzi naczyniowych

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Naucz się izolacji pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych myszy. Ta metoda pozwala uzyskać czystą populację komórek do badań mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Przeglądaj więcej filmów