Name: Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę kokultury glejaka z makrofagami i mikroglejem w celu badania inwazji nowotworowej. Technika ta pozwala identyfikować związki zakłócające interakcje komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Konstantinowi Dobrenisowi za dostarczenie mysiego mikrogleju do tych badań.

1. Fluorescencyjne znakowanie komórek
UWAGA: Oznacz linie komórkowe glejaka i mikrogleju barwnikami fluorescencyjnymi 9. Alternatywnie, wygeneruj linie komórkowe, które konstytutywnie wyrażają białka fluorescencyjne, takie jak GFP / RFP, jak opisano w 14.
<ol>
	<li>Umieść komórki na 6-dołkowej płytce tak, aby w dniu barwienia zlewały się w 70 - 80%. W przypadku mysiego glejaka linii komórkowej GL261 i ludzkiej linii komórkowej glejaka U87, płytkę 1 x 106 i 1,5 x 106 komórek, odpowiednio na 6 cm szalce 24 godziny przed barwieniem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór barwnika do barwienia komórek fluorescencyjnych w DMSO i dodaj 5 μM barwnika do pożywki, pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) lub pożywki wolnej od surowicy makrofagów (MSFM), dobrze wirować.</li>
	<li>Inkubować komórki z barwnikiem przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń pożywkę zawierającą barwnik i dodaj nową pożywkę (RPMI lub MSFM) do komórek.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 30 minut. Uwaga: Komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia w eksperymencie.</li>
</ol>
2. Test inwazji kokultury w komorze matrycowej z precoated
<ol>
	<li>Różnicuj komórki THP-1 za pomocą octanu mirystynianu forbolu (PMA)15.
	<ol>
		<li>Płytka 2 - 3 x 105 komórek THP-1 w 1,5 ml RPMI/10% FBS na 6-dołkowej płytce hodowlanej. Bezpośrednio po posianiu dodać 100 nM PMA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin. 
		UWAGA: Po 48 godzinach komórki THP-1, które pomyślnie przeszły różnicowanie, będą przylegać i rozprzestrzeniać się na dno studni, przyjmując okrągłą morfologię.</li>
		<li>Usuń PMA, myjąc raz 1x PBS i zastąp świeżym RPMI/10% FBS. Poczekaj kolejne 48 godzin, aż komórki będą gotowe do użycia w teście.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważyć komory wstępnie powlekane matrycą, umieszczając je w studzience zawierającej 500 μl samej pożywki (bez surowicy) i dodając 500 μl samej pożywki do góry. Inkubować komory przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Komory wstępnie powlekane zostały zakupione od producenta; patrz Tabela materiałów/wyposażenia.</li>
	<li>Aby delikatnie odłączyć komórki (znakowane fluorescencyjnie linie komórkowe glejaka i mikroglej/makrofagi), usuń pożywkę z komórek przez aspirację. Umyj komórki na naczyniu za pomocą 2 mM EDTA/PBS. Dodać 500 μl 2 mM EDTA/PBS i inkubować przez 5 - 10 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml pożywki zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 120 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce MSFM/0,3% BSA (dla komórek GL261 i mikrogleju) lub RPMI/0,3% BSA (dla komórek U87 i THP-1) tak, aby stężenie komórek było równe 1 x 106 komórek/ml. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki/0,3% BSA na dołek z płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komór, które były zrównoważone przez co najmniej 2 godziny (krok 2.2). Umieść komory w studzience zawierającej 500 μl pożywki/0,3% BSA (krok 2.7).</li>
	<li>Jeśli inhibitory są stosowane do badania ich wpływu na inwazję glejaka stymulowaną makrofagami/mikroglejem, dodaj odpowiednie stężenie zarówno do dolnej, jak i górnej części komory. 
	UWAGA: Stężenia inhibitora CSF-1R stosowanego do pełnego hamowania inwazji glejaka GL261 stymulowanej mikroglejem można znaleźć w odnośniku 9.</li>
	<li>W zależności od użytych linii komórkowych dodaj komórki do górnej komory zgodnie z opisem w dwóch następnych krokach: glejak mysi (2.10.1) i glejak ludzki (2.10.2).
	<ol>
		<li>Wymieszaj 1,5 x 105 komórek GL261 (glejak) (150 μl) i 5 x 104 mysich mikroglejów (50 μl) (szczegóły dotyczące podłoża patrz krok 2.6). Zwiększyć objętość do 500 μl, dodając 300 μl MSFM/0,3% BSA. Dodać mieszaninę komórek do górnej komory i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin. 
		UWAGA: Mysi mikroglej izoluje się od nowonarodzonych myszy, jak opisano w 16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Wymieszaj 7,5 x 104 komórki U87 (glejak) (75 μl) i 2,5 x 104 komórki THP1 (makrofagi) (25 μl). Zwiększ objętość 500 μl, dodając 400 μl RPMI/0,3% BSA. Dodaj mieszaninę komórek do górnej komory. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
<ol>
	<li>Po inkubacji usunąć komórki z górnej części komory przez delikatne aspiracje i utrwalić komory, umieszczając w 3,7% formaldehydzie w PBS. Pozostawić komory do pozostania w utrwalaczu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Usunąć utrwalacz przez delikatne zassanie i zastąpić 500 μl 1x PBS. Przejdź do sekcji 4 w celu analizy obrazu. 
	UWAGA: Eksperyment można w tym momencie wstrzymać i zapisać do obrazowania w 1x PBS. Sygnały barwnika fluorescencyjnego można wykryć do 2 tygodni po utrwaleniu.</li>
</ol>
3. Test inwazji "3D" - osadzanie glejaka i makrofagów/mikrogleju w matrycy
<ol>
	<li>Rozmrozić matrycę w temperaturze 4 °C przez noc. Wykonaj wszystkie dalsze manipulacje za pomocą matrycy na lodzie w masce.</li>
	<li>Przygotować matrycę o stężeniu 10 mg/ml w pożywce (MSFM lub RPMI) z 0,3% BSA na lodzie. 
	UWAGA: Stężenie podstawowe matrycy wynosi zwykle około 15 mg/ml.</li>
	<li>Aby przygotować komórki (oznaczone w kroku 1) do zawiesiny w matrycy, należy usunąć pożywkę z komórek przez aspirację. Umyj komórki na naczyniu za pomocą 2 mM EDTA/PBS. Dodać 500 μl 2 mM EDTA/PBS do komórek i inkubować przez 5 - 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml pożywki zawierającej 0,3% BSA.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 120 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant z osadu. Zawiesić osad w pożywce/0,3% BSA tak, aby stężenie komórek było równe 1 x 106 komórek/ml. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Dodać 1,5 x 105 komórek GL261 (w 150 μl) + 5 x 104 komórek mikrogleju (w 50 μl) do probówki do mikropęcherzyków o pojemności 1,5 ml. Dodaj 2 x 105 komórek GL261 (200 μl) do osobnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Same komórki GL261 bez mikrogleju służą jako kontrola.</li>
	<li>Wiruj komórki w mikrofudze przez 5 minut w temperaturze 120 x g.</li>
	<li>Zawieś komórki w zimnej matrycy o objętości 200 μl na lodzie.</li>
	<li>Umieść 50 μl (50 000 komórek) na środku górnej komory wkładu komory o wielkości porów 8 μM.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby nastąpiła polimeryzacja.</li>
	<li>Dodać 200 μl pożywki bez surowicy do górnej komory i 700 μl surowicy zawierającej pożywkę do dolnej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć komórki z górnej części komory przez delikatne aspiracje i utrwalić komory, umieszczając w 3,7% formaldehydzie w PBS. Pozostawić komory do pozostania w utrwalaczu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Usunąć utrwalacz przez delikatne zassanie i zastąpić 500 μl 1x PBS. Przejdź do sekcji 4 w celu analizy obrazu.</li>
</ol>
4. Testy obrazowe
<ol>
	<li>Usunąć komory z 3,7% formaldehydu i umyć w dobrze zawierającym świeże 500 μl 1x PBS. 
	UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia komór.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką delikatnie oczyść nieinwazyjne komórki z górnej części filtra (strona skierowana do wnętrza komory), zeskrobując powierzchnię filtra. Zacznij delikatnie i stopniowo zwiększaj ciśnienie. Zrób to co najmniej 3 razy na komorę.</li>
	<li>Umieść komory w naczyniu ze szklanym dnem lub pozostaw na talerzu 24-dołkowym.</li>
	<li>Umieścić próbkę na stoliku epifluorescencyjnego lub laserowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę i oprogramowanie do przechwytywania obrazu 9,10.</li>
	<li>Zrób kilka 10- lub 20-krotnych zdjęć reprezentatywnych pól.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, policz liczbę komórek glejaka, które przeszły przez filtr do spodu 9,10.</li>
	<li>W przypadku obrazowania testu inwazji "3D" (opisanego w sekcji 3), wygeneruj serię stosu Z za pomocą fluorescencyjnego laserowego mikroskopu konfokalnego 5-6. Aby zobrazować inwazyjną populację komórek na spodniej stronie filtra, postępuj zgodnie z krokami protokołu 4.2 - 4.6 opisanymi powyżej.</li>
</ol>

<ol><li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li>
<li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+astrocytic+glioma%3A+genetics%2C+biology%2C+and+paths+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion%3A+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li>
<li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+%28CSF-1R%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li>
<li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1%2Fepidermal+growth+factor+paracrine+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li>
<li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion%2C+intravasation%2C+and+metastasis+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li>
<li>Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wysoce inwazyjny charakter gwiaździaków o wysokim stopniu złośliwości i glejaka sprawia, że te nowotwory mózgu są bardzo śmiertelne. Dlatego niezwykle ważne jest zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów inwazji glejaka. Wiele już w wieku 17 lat dowiedziano się o procesie inwazji glejaka. Korzystając z formatów testów opisanych w tym artykule, nasze laboratorium wykazało zarówno w modelach mysich, jak i ludzkich, że makrofagi związane z nowotworem mogą stymulować inwazję komórek glejaka od 5 do 10 ra...

Glejak wielopostaciowy jest agresywnym nowotworem mózgu u człowieka, którego mediana przeżycia wynosi około 12 miesięcy od momentu diagnozy 1,2. Glejak wielopostaciowy jest jednym z najbardziej śmiertelnych i trudnych klinicznie nowotworów, ponieważ jest oporny na standardową chemioterapię i resekcję chirurgiczną. Rozproszony charakter glejaka umożliwia komórkom nowotworowym rozprzestrzenianie się w normalnym mózgu, co praktycznie uniemożliwia całkowite chirurgiczne wycięcie zaawansowanego guza. Ten wysoce inwazyjny aspekt jest cechą charakterystyczną glejaka i innych zaawansowanych gwiaździaków. Dlatego wiele badań skupia się na molekularnym mechanizmie inwazji komórek glejaka. Mikrośrodowisko guza glejaka odgrywa istotną rolę w tworzeniu nowotworu złośliwego 3-6. Wykazano, że makrofagi/mikroglej związane z nowotworem są odpowiedzialne za promowanie inwazji glejaka 7,8. Większość z tych badań mierzyła jednak wpływ makrofagów/mikrogleju za pomocą testów, które fizycznie oddzielają je od komórek glejaka. Nasze laboratorium postawiło sobie za cel opracowanie ulepszonych testów, które pozwolą nam zbadać, w jaki sposób inwazja glejaka jest zależna od makrofagów/mikrogleju w kokulturach i umożliwią nam zobrazowanie fizycznej interakcji między nimi podczas inwazji.
Klasyczne testy do pomiaru inwazji komórek obejmują "standardowe" formaty chemotaksji w komorze Boydena i chemoinwazji. W tym przypadku badane komórki są platerowane w plastikowej komorze, która zawiera na dnie filtr poliwęglanowy z porami o określonej wielkości (zwykle o średnicy od 0,4 do 8 μM). Proces inwazji komórek obejmuje fizyczną barierę, zwykle składającą się z białka macierzy zewnątrzkomórkowej. W teście chemoinwazji preferowaną stosowaną matrycą jest Matrigel (zwany dalej "matrycą"), mieszanina białek macierzy zewnątrzkomórkowej wydzielana przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) i składa się głównie z kolagenu typu IV i lamininy. Komory są następnie umieszczane w studzience do hodowli tkankowej, która zawiera pożywki do hodowli komórkowych z czynnikami wzrostu lub bez nich, co do których istnieje podejrzenie, że stymulują inwazję. Komórki, które mają większą zdolność inwazyjną, będą przenikać przez filtr pokryty macierzą zewnątrzkomórkową z większą częstotliwością i przylegać do spodu filtra. Zmodyfikowaliśmy ten test w celu oceny roli mikrogleju i makrofagów związanych z nowotworem w inwazji komórek glejaka.
Udało nam się ustalić za pomocą testów kokulturowych opisanych w tym artykule, że mikroglej może stymulować inwazję dwóch linii komórkowych glejaka 5 - 10-krotnie 9,10. Odzwierciedla to to, co obserwuje się w zwierzęcych modelach glejaka. Ponadto opracowaliśmy trójwymiarowy test inwazji, w którym można bardziej bezpośrednio badać interakcje między komórkami glejaka a makrofagami/mikroglejem. Zakres inwazji komórek glejaka stymulowanej przez makrofagi/mikroglej w teście 3D jest porównywalny z tym, co obserwuje się przy użyciu podejścia komorowego pokrytego matrycą. Podobne testy zostały wcześniej opracowane w celu zbadania interakcji raka piersi z makrofagami podczas inwazji 11-13. Obie metody opisane w tej pracy powinny pomóc w analizie molekularnych mechanizmów inwazji komórek glejaka stymulowanej makrofagami/mikroglejem.

<table><tbody><tr><td>Komora inwazyjna Corning BioCoat Matrigel: z BD Matrigel Matrix</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wolna od makrofagów (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Sondy molekularne</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Zielony CMFDA</td><td>Dye Life Technologies/Sondy molekularne</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa GL261</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa U87</td><td>Amerykańska kolekcja kultur typu tkanki</td> Linia komórkowa <td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Amerykańska kolekcja kultur typu tkanki</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell wkładki do hodowli komórek z poliwęglanu (8 &mikro; M pore) 48 w opakowaniu.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Culture Matrix Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Kat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi cieplnemu</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glejak wielopostaciowy (glejak IV stopnia) jest bardzo agresywnym nowotworem ludzkim z medianą przeżycia 1 roku po diagnozie. Pomimo lepszego zrozumienia zdarzeń molekularnych, które prowadzą do glejaków, nowotwór ten nadal pozostaje wysoce oporny na konwencjonalne leczenie. Chirurgiczna resekcja guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości rzadko jest kompletna ze względu na wysoce naciekający charakter komórek glejaka. Podejścia terapeutyczne, które osłabiają inwazję komórek glejaka, są zatem atrakcyjną opcją. Nasze laboratorium i inne wykazały, że makrofagi związane z nowotworem i mikroglej (makrofagi rezydujące w mózgu) silnie stymulują inwazję glejaka. Protokół opisany w tej pracy służy do modelowania interakcji glejak-makrofag/mikroglej za pomocą testów hodowli in vitro. Takie podejście może znacznie ułatwić rozwój i/lub odkrycie leków, które zakłócają komunikację z makrofagami, które umożliwiają to złośliwe zachowanie. Ustaliliśmy dwa solidne testy inwazji kokulturowej, w których mikroglej / makrofagi stymulują inwazję komórek glejaka 5-10 razy. Komórki glejaka znakowane markerem fluorescencyjnym lub konstytutywnie wyrażające białko fluorescencyjne są siane bez i z makrofagami/mikroglejem na wkładkach komory poliwęglanowej pokrytych matrycą lub osadzone w trójwymiarowej matrycy. Inwazję komórek ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania i liczenia tylko komórek inwazyjnych znajdujących się na spodniej stronie filtra. Za pomocą tych testów zidentyfikowano kilka inhibitorów farmakologicznych (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitynib i Semapimod), które blokują inwazję glejaka stymulowaną makrofagami/mikroglejem.

Stosując opisane tutaj metody, wykazaliśmy, że mikroglej i makrofagi mogą znacząco stymulować inwazję komórek glejaka wielopostaciowego. Zastosowano dwa różne testy inwazyjności, które przedstawiono na Rysunku 1. Na Rysunku 2 komórki GL261 konstytutywnie ekspresujące białko fluorescencyjne mCherry wysiano na uprzednio powlekane komory z mikroglejem i bez niego na 48 h. Komórki GL261 same w sobie wykazywały minimalną inwazyjność, jednak w hodowli z mikrogl...

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zamodelowanie interakcji komórek glejaka z mikroglejem i makrofagami podczas inwazji w teście in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrośrodowiska guza, takie jak to, które związki lub metody leczenia mogą zakłócać interakcję nowotworu z makrofagami – typem komórek mikrośrodowiska biorącym udział w progresji do złośliwości. Jedną z głównych zalet tej techniki jest fakt, że jest ona stosunkowo łatwa do wykonania, może zostać zrealizowana w rozsądnym czasie i wydaje się dokładnie modelować inwazję glejaka in vivo.Proces rozpoczynamy od różnicowania wybranej linii komórkowej przy użyciu octanu mirystonianu forbolu w następujący sposób. Najpierw wysiewamy od 2 do 3 × 10⁵ komórek THP-1 w 1,5 ml pożywki w 6-dołkowej płytce hodowlanej. Bezpośrednio po wysianiu dodajemy 100 nM PMA i inkubujemy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.Po 48 godzinach usunąć PMA poprzez odessanie pożywki, przepłukać raz roztworem 1X PBS i dodać świeżą pożywkę. Inkubować przez kolejne 48 godzin, aż komórki będą gotowe do użycia w analizie. Następnie przeprowadzić ekwilibrację komór wstępnie pokrytych macierzą, umieszczając je w dołku zawierającym 500 µL pożywki bez surowicy, a następnie dodając 500 µL pożywki bezsurowiczej od góry.Inkubować komory przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie ostrożnie odessać medium z naczyń hodowlanych zawierających fluorescencyjnie znakowane linie komórkowe glejaka oraz mikroglej i makrofagi. Następnie dodać 500 µL 2 mM EDTA i PBS i inkubować od 5 do 10 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych.Zebrać komórki w 5 mL pożywki zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej i wirować przez 5 minut przy 120 ×g. Po wirowaniu odessać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce do stężenia 1 × 10⁶ komórek/mL. Do policzenia komórek użyć hemocytometru. Następnie do dołków płytki 24-dołkowej dodać po 500 µL odpowiedniej pożywki zawierającej 0,3% BSA.Następnie usuń pożywkę z równoważonych komór i umieść komory w dołkach płytki 24-dołkowej. Jeśli w celu zbadania ich wpływu na inwazję glejaka stymulowaną przez makrofagi lub mikroglej stosowane są inhibitory, dodaj odpowiednie stężenie zarówno do dolnej, jak i górnej części komory. W zależności od zastosowanej linii komórkowej, wymieszaj komórki glejaka wielopostaciowego i mysie komórki mikrogleju lub komórki glejaka i komórki makrofagów zgodnie ze szczegółami opisanymi w pisemnej części protokołu.Przenieś mieszaninę komórek do górnej komory i inkubuj przez 24 do 48 godzin, w zależności od typu komórek. Po inkubacji usuń komórki z górnej części komory za pomocą delikatnej aspiracji. Następnie umieść komory w 3,7% formaldehydzie w PBS w celu utrwalenia.Pozostaw komory w utrwalaczu na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń utrwalacz za pomocą delikatnej aspiracji i zastąp go 500 µL 1X PBS. Najpierw rozmroź mieszaninę matrycy w temperaturze 4 °C przez noc.Następnie przygotować na lodzie macierz o stężeniu 10 mg/mL w odpowiednim medium. Potem zebrać znakowane komórki w celu zawieszenia ich w macierzy, zgodnie z wcześniejszą procedurą. Następnie do probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml pipetować 1,5 × 10⁵ komórek GL261 w objętości 150 µl oraz 5 × 10⁴ komórek mikrogleju w 50 µl.Przenieś 2 × 10⁵ komórek GL261 w objętości 200 µL do oddzielnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Wirować komórki w mikrowirówce przez pięć minut przy 120 ×g. Następnie resuspendować komórki w 200 µL zimnej matrycy na lodzie. Na tym etapie kluczowe jest, aby w dygestorium znajdował się przygotowany pojemnik z lodem, a probówki znajdowały się na lodzie, a końcówki w lodówce; należy upewnić się, że wszystko jest schłodzone, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji dojrzałego żelu.Po resuspensji, nanieś 50 000 komórek w objętości 50 µL na środek górnej komory wkładki do komory o rozmiarze porów 8 µm. Następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację. Po 30 minutach dodaj 200 µL pożywki bezsurowiczej do górnej komory oraz 700 µL pożywki do wzrostu komórek zawierającej surowicę do dolnej studni.Po 48-godzinnej inkubacji usuń komórki z górnej części komory poprzez delikatną aspirację. Utwierdź komory w sposób opisany wcześniej i przed obrazowaniem komórek zastąp utrwalacz 500 µL 1x PBS. Ten reprezentatywny obraz przedstawia naciekające komórki GL261 wykazujące ekspresję mCherry w nieobecności mikrogleju.Komórki wysiano do komór pokrytych macierzą i inkubowano przez 48 godzin. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 10X, a pasek skali reprezentuje 400 mikronów. W tym przypadku komórki GL261 połączono z mikroglejem.Ilość inwazyjnych komórek GL261, które przeniknęły przez filtr, została poddana kwantyfikacji. Jak widać tutaj, kokultywacja linii komórkowej glejaka mysiego GL261 z mikroglejem zwiększa jej inwazyjność nawet 10-krotnie w teście 2D. Obraz ten przedstawia wpływ inhibitorów farmakologicznych na stymulowaną przez mikroglej inwazję komórek GL261 w porównaniu z kontrolą DMSO.Przedstawione dane pochodzą z sześciu niezależnych eksperymentów. Test ten został z sukcesem zastosowany również z użyciem ludzkich linii komórkowych. Komórki U87 wysiane w komorach pokrytych macierzą i barwione zielonym barwnikiem CMFDA przedstawiono po 24-godzinnej inkubacji.W tym przypadku komórki U87 wysiano wraz z zróżnicowanymi makrofagami THP1. Obraz ten przedstawia ilościowe ujęcie testu, w którym zliczono wyłącznie inwazyjne komórki U87. Ludzka linia komórkowa makrofagów THP1 stymulowała inwazję komórek glejaka U87.Przedstawione dane są wartościami średnimi z 10 niezależnych eksperymentów. Ten obraz z testu inwazji 3D kokultury GL261 i mikrogleju jest kompozytem z serii obrazów Z i pokazuje komórki GL261 barwione zielonym CMFDA osadzone w samej macierzy. W tym przypadku komórki GL261 były hodowane w kokulturze z mysim mikroglejem znakowanym czerwonym CMPTX.Tutaj przedstawiono komórki GL261 na spodniej stronie filtra, które uznano za inwazyjne. Całkowitą liczbę inwazyjnych komórek GL261 określono i znormalizowano względem liczby komórek GL261 w monokulturze. Przedstawione dane reprezentują średnią z trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w duplikacie.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać od początku do końca w około dwie godziny. Końcowe wyniki eksperymentu można uzyskać po 48 godzinach. Dlatego podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby wszystko, w tym probówki i pipety, było schłodzone do temperatury 4 °C.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ustanowić model glejaka w testach inwazji w kokulturze makrofagów i mikrogleju.

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

Ten film opisuje test wspólnej hodowli komórek glejaka na mikrowzorcach neuronów, które naśladują inwazję mielinowanych dróg neuronowych przez komórki macierzyste glejaka podczas migracji na neurony w przestrzeniach okołonowotworowych. Ten test może pomóc w analizie wpływu leków farmakologicznych, które hamują migrację komórek glejaka na neurony w glejaku.

Współhodowla komórek glejaka na neuronach wzorcowych: technika monitorowania migracji komórek glejaka na neuronach hipokampa szczura in vitro

Ten film demonstruje test in vitro wykorzystujący β-glukany do aktywacji komórek mikrogleju do produkcji rodników ponadtlenkowych, reaktywnych form tlenu. W komórkach raka mózgu generowane reaktywne utleniacze aktywnie hamują proliferację komórek nowotworowych i indukują śmierć komórki.

Test do analizy testowego β-glukanu jako strategii immunoterapii przeciwko komórkom raka mózgu

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Na tym filmie komórki glejaka i mikrogleju są mieszane z roztworem matrycy polimerowej i przenoszone do porowatej wkładki komory, w której tworzy się żel, osadzając komórki. Mikroglej stymuluje migrację komórek glejaka przez porowatą wkładkę, naśladując inwazję komórek nowotworowych na otaczającą tkankę, Komórki są następnie utrwalane i przygotowywane do dalszej analizy.

Model inwazji guza oparty na macierzy z wykorzystaniem kohodowli glejaka wielopostaciowego mikrogleju

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj metodę kokultury glejaka z makrofagami i mikroglejem w celu badania inwazji nowotworowej. Technika ta pozwala identyfikować związki zakłócające interakcje komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Przeglądaj więcej filmów