Name: Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek macierzystych układu nerwowego do badania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) w nowotworach. Technika umożliwia identyfikację związków blokujących migrację komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie było wspierane przez Fundację Naukową Uniwersytetu w Bazylei oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki poprzez grant dla MHS and AG (SNF IZLIZ3_157230). Dziękujemy: dr Tanii Rinaldi Burkat za hojne udostępnienie infrastruktury; wszystkim członkom grupy Bettler w celu dyskusji i komentarzy. Dziękujemy Gerhardowi Dorne'owi (Leica Microsystems, Szwajcaria) za profesjonalną i kompetentną instalację kamery wideo Full HD MC170 (Leica Microsystems, Szwajcaria).

<ol><li>Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transitions+in+development+and+disease%3A+old+views+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives.</a> Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarriere%2C+G+%22Clin+Transl+Med%22">Clin Transl Med</a>. 4, 14(2015).</li>
<li>Zawadzka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-resident+glial+progenitor%2Fstem+cells+produce+Schwann+cells+as+well+as+oligodendrocytes+during+repair+of+CNS+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination.</a> Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Atlas+of+the+developing+rat+nervous+system%22">Atlas of the developing rat nervous system</a>. , 2nd edn, Academic Press. (1994).</li>
<li>O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Area+patterning+of+the+mammalian+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Area patterning of the mammalian cortex.</a> Neuron. 56, 252-269 (2007).</li>
<li>O'Leary, D. D., Sahara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+arealization+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of arealization of the neocortex.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).</li>
<li>Sailer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+neural+stem+cells+become+invasive+in+vitro+by+combined+FGF2+and+BMP4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling.</a> J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).</li>
<li>Sailer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+and+FGF2+cooperate+to+induce+neural-crest-like+fates+from+fetal+and+adult+CNS+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells.</a> J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).</li>
<li>Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+contractions+in+the+human+melanoma+cell+line+SK-mel+28+after+muscarinic+cholinergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation.</a> Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).</li>
<li>Wicki, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+role+of+podoplanin+in+tumour+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The potential role of podoplanin in tumour invasion.</a> Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).</li>
<li>Wicki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+in+the+absence+of+epithelial-mesenchymal+transition%3A+podoplanin-mediated+remodeling+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton.</a> Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+podoplanin+in+malignant+astrocytic+tumors+as+a+novel+molecular+marker+of+malignant+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression.</a> Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).</li>
<li>Motomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis-based+proteomic+subclassification+of+newly+diagnosed+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas.</a> Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).</li>
<li>Kono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+the+lymphatic+marker+podoplanin+in+diverse+types+of+human+cancer+cells+using+a+novel+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody.</a> Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).</li>
<li>Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+podoplanin+in+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">The role of podoplanin in tumor progression and metastasis.</a> Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).</li>
<li>Panchision, D. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+neural+stem+cells+by+morphogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The control of neural stem cells by morphogenic signals.</a> Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrogenesis+in+the+subventricular+zone+and+the+role+of+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor.</a> Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).</li>
<li>Hu, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-AA+mediates+B104CM-induced+oligodendrocyte+precursor+cell+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+through+Erk%2C+PI3K%2C+and+p38+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling.</a> J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).</li>
<li>Galvao, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+quiescent+adult+oligodendrocyte+precursor+cells+into+malignant+glioma+through+a+multistep+reactivation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146, 209-221 (2011).</li>
<li>Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and glioma.</a> Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).</li>
<li>Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+stem+cells+as+the+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brain stem cells as the cell of origin in glioma.</a> World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).</li>
<li>Sampetrean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+precedes+tumor+mass+formation+in+a+malignant+brain+tumor+model+of+genetically+modified+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells.</a> Neoplasia. 13, 784-791 (2011).</li>
<li>McNeill, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+astrocytoma+pathogenesis+in+vitro+and+in+vivo+using+cortical+astrocytes+or+neural+stem+cells+from+conditional%2C+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice.</a> JoVE. , e51763(2014).</li>
<li>Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+the+tumor-initiating+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">On the nature of the tumor-initiating cell.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).</li>
<li>Busch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2-dependent+integration+of+adult+mouse+subventricular+stem+cells+into+the+neural+crest+of+chick+and+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos.</a> J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+epigenetic+reprogramming+during+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).</li>
<li>Rahimi, R. A., Leof, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling%3A+a+tale+of+two+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling: a tale of two responses.</a> J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).</li>
<li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Res. 19, 156-172 (2009).</li>
<li>Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in cancer.</a> Science. 339, 1567-1570 (2013).</li>
<li>Sullivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+new+focus+for+stroke+treatment+-+migrating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells.</a> Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W pracy opisano znormalizowany system analizy EMT z wykorzystaniem NSC (podsumowany na rysunku uzupełniającym 3). Standaryzacja zapewnia odtwarzalność (tabele 1 i 2). NSC pochodzą z rozwijającej się kory mózgowej, tkanki, która normalnie nie jest poddawana EMT. Jest to korzystne dla analizy wczesnych kroków w EMT. Początkowe kroki w EMT nie mogą być odpowiednio zbadane w komórkach nowotworowych, które nagromadziły zmiany genetyczne i mogły już przyjąć cechy EMT. Co więcej, pierwotne prób...

Podczas kilku etapów rozwoju embrionalnego, komórki nabłonkowe tracą silne przyleganie do siebie (np. ścisłe połączenia) i nabywają fenotyp migracyjny w procesie zwanym przejściem nabłonkowym do mezenchymalnego (EMT)1. EMT jest wymagany do tworzenia dodatkowych typów komórek, takich jak mezenchymalne komórki grzebienia nerwowego, populacja, która oddziela się od nabłonka nerwowego2. EMT jest niezbędny nie tylko w fazie embrionalnej, ale także w późniejszych etapach dorosłego życia do utrzymania procesów fizjologicznych w dorosłym organizmie, takich jak gojenie się ran3i regeneracja ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w zmianach demielinizacyjnych4.
Guzy nabłonkowe są znane z tego, że reaktywują EMT jako etap inicjacji migracji, inwazji i przerzutów, ostatecznie prowadząc do progresji raka1,3. EMT jest rzeczywiście ściśle związane z silną migracją1,3. Komórkowe etapy kondycjonowania, inicjowania, poddawania się i utrzymywania EMT nie są w pełni poznane i wymagają dalszych badań.
Tutaj prezentowany jest ustandaryzowany system modelowy EMT in vitro oparty na NSC, ze zdefiniowanymi czynnikami wzrostu i pożywkami (bez użycia surowicy i enzymów). Ten modelowy system ma znaczenie dla naukowców zajmujących się EMT. Wykazano, że rodziny białek Snail, Zeb i Twist mają kluczowe znaczenie dla EMT zarówno w rozwoju, jak i chorobie1. W prezentowany system zaangażowane są również rodziny Snail, Zeb i Twist. System opiera się na specyficznym regionie przodomózgowia, który normalnie nie jest poddawany EMT, co zapewnia szczególną przewagę w badaniu początkowych zdarzeń podczas indukcji EMT.
System modelowy mógłby potencjalnie zostać zastosowany do badania EMT w nabłonku poza OUN, ponieważ kluczowe induktory EMT, takie jak białka Ślimaka, Zeb i Twist, znajdują się również podczas EMT w systemach tkankowych poza OUN. Ten modelowy system pozwala na standaryzowaną izolację NSC od rozwijającej się kory mózgowej w celu badania cech komórek macierzystych w ogóle, a EMT w szczególności. Korzystając z tego systemu, wyizolowaliśmy NSC, indukowaliśmy EMT i badaliśmy późniejszą migrację pod wpływem FGF2 i BMP4. Zaobserwowaliśmy, że sygnalizacja FGF i BMP oddziałuje z sygnalizacją TGFβ w celu promowania migracji komórek, potwierdzając w ten sposób system modelowy.

<table><tbody><tr>Systemy <td>BMP4, rhBMP4</td><td>RnD&nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina trzustka bydlęca</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Komora Boydena, test inwazji komórek CytoSelect</td> System <td>płytek 24-dołkowych</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych z siatką</td><td>Szalka Ibidi 500 mm, 35 mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>Barwnik błony plazmatycznej, stosować w stosunku 1:1,000.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>Zapas w dawce 5 mg/ml. Użyć w skali 1:10 000. Rakotwórcze. Wymagana odpowiednia ochrona (rękawice, fartuch, gogle).</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 średnia butelka</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD Systems</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, bydlęca</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie graficzne z funkcją pomiaru pikseli</td><td>Fiji</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>wersja 2.0.0-rc-30/1.49s</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Media Sigma&nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka apo-transferyna</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Możliwe działanie drażniące na płuca. Unikać wdychania. Stosuj odpowiednią ochronę.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nestin, Mysie przeciwciało anty Nestin</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>Stosować w stosunku 1:100, 4% wiązania PFA, Triton X100 przy 0,1%</td></tr><tr><td>Olig2, Przeciwciało anty Olig2 królika</td><td>Dostarczone przez Hirohide Takebayash</td><td>Zapasy osobiste</td><td>Stosować w stosunku 1:2,000, utrwalenie PFA 4%, Triton X100 w 0,1%</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Fungizone</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanina, mysie przeciwciało anty podoplaniny</td><td>Acris</td><td>DM3614P</td><td>Stosować w stosunku 1:250, 4% wiązania PFA, unikać Triton X100</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5780</td><td>Działa drażniąco na skórę i oczy. Wymagana jest odpowiednia ochrona.</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10, Królicze przeciwciało anty Sox10</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td><td>Stosować w stosunku 1:200, 4% wiązania PFA, Triton X100 przy 0,1%</td></tr> <tr><td>TGFb1, rhTGFb1</td><td>RnD Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Niepowlekane szalki Petriego</td><td>Falcon Corning</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań emt, odpowiedni do odkrywania leków

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) opisuje proces transdyferencjacji nabłonka w mezenchym. EMT jest podstawowym procesem podczas rozwoju embrionalnego, który często występuje również w glejaku, najczęstszym złośliwym guzie mózgu. EMT obserwowano również w wielu nowotworach poza mózgiem, w tym raku piersi, raku płuc, raku jelita grubego, raku żołądka. EMT jest centralnie powiązany z nowotworami złośliwymi poprzez promowanie migracji, inwazji i tworzenia przerzutów. Mechanizmy indukcji EMT nie są w pełni poznane. W tym miejscu opisujemy system in vitro do standaryzowanej izolacji korowych nerwowych komórek macierzystych (NSC) i późniejszej indukcji EMT. System ten zapewnia elastyczność w stosowaniu zarówno pojedynczych komórek, jak i hodowli eksplantatów. W tym systemie zarodkowe NSC przodomózgowia szczurów lub myszy są hodowane w określonym podłożu, pozbawionym surowicy i enzymów. NSC wykazywały ekspresję Olig2 i Sox10, dwóch czynników transkrypcyjnych obserwowanych w komórkach prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Korzystając z tego systemu, zaobserwowano interakcje między sygnalizacją FGF, BMP i TGFβ z udziałem Zeb1, Zeb2 i Twist2, w których aktywacja TGFβ znacznie zwiększyła migrację komórek, co sugeruje synergiczną interakcję BMP-/TGFβ. Wyniki wskazują na to, że sieć sygnalizacji FGF, BMP i TGFβ jest zaangażowana w indukcję i konserwację EMT. Ten system modelowy jest odpowiedni do badania EMT in vitro. Jest ekonomiczny i wykazuje wysoką powtarzalność. Pozwala również na porównanie różnych związków pod względem ich reakcji migracyjnych (ilościowy pomiar odległości) oraz wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków w celu zahamowania lub wzmocnienia EMT (pomiar jakościowy). Model ten doskonale nadaje się zatem do testowania bibliotek leków pod kątem substancji wpływających na EMT.

Ten system modelowy EMT opiera się na standaryzowanej izolacji NSC, zarówno jako pojedyncze komórki, jak i eksplanty z określonego regionu rozwijającej się cewy nerwowej, czyli kory centralnej (Rysunki 1 i 2). Do oceny ilościowej eksplanty wysiano dokładnie w centrum naczynia hodowlanego z siatką o oczkach 500 µm (Rysunek 3). Eksplanty z kory centralnej poddano najpierw dwudniowej inkubacji z FGF2, po czym przez kolejne dwa dni hodowano j...

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Ogólnym celem tej procedury jest indukowanie migracji w komórkach typowo niemigrujących, aby zidentyfikować konkretne związki, które aktywują lub blokują ten proces. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie migracji i inwazji komórkowej i może być szczególnie interesująca dla naukowców pracujących z komórkami macierzystymi neuronów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy komórek niemigrujących i nieinwazyjnych podczas procesu nabywania przez nie zdolności do migracji i inwazji.Implikacje tej techniki rozciągają się na identyfikację nowych związków blokujących przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT), które występuje w ludzkich glejakach wysokiego stopnia, uważanych za pochodne neuralnych komórek macierzystych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat EMT i neuralnych komórek macierzystych, może być również stosowana do badania innych nowotworów nabłonkowych, takich jak rak piersi, płuc lub jelita grubego. W 14,5 dniu embrionalnym potwierdzić prawidłowy wiek embrionów szczura, sprawdzając obecność początkowego formowania się palców w przedniej kończynie szczura.Następnie przenieś embriony do poszczególnych, niepowlekanych szalek Petri w

an-enzyme-serum-free-neural-stem-cell-culture-model-for-emt

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Poznaj metodę hodowli komórek macierzystych układu nerwowego do badania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) w nowotworach. Technika umożliwia identyfikację związków blokujących migrację komórek.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Przeglądaj więcej filmów