Name: Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę agregacji komórek nabłonka grasicy z użyciem peptydów EAK16-II/EAKIIH6 w trójwymiarowym hydrożelu. Technika ta wspiera przeżycie komórek i ma zastosowanie w bioinżynierii grasicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health R21 AI113000 (W.S.M) i R01 AI123392 (Y.F.).

Wszystkie zwierzęta użyte w eksperymentach były trzymane w obiekcie dla zwierząt w Instytucie Badawczym Allegheny-Singer zgodnie z protokołem sprawdzonym i zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Allegheny Health Network/Allegheny Singer Research Institute.
1. Trawienie grasicy za pomocą kolagenazy
<ol>
	<li>Zbierz grasicę.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 3-5 tygodniowe myszy C57BL6/J w komorze na dwutlenek węgla (CO2) w celu pobrania grasicy. Szczegółowo umieść myszy w komorze pod indukcją CO2 na 3-5 minut i potwierdź śmierć, weryfikując zatrzymanie akcji serca lub oddechu.</li>
		<li>Połóż tuszę na plecach i zwilż ciało 70% etanolem. Wykonaj małe poziome nacięcie ostrymi, prostymi nożyczkami preparacyjnymi na brzuchu przez skórę. Pociągnij skórę na obu końcach (głowie i nogach) tak, aby była wywrócona na lewą stronę.</li>
		<li>Wykonaj poziome cięcie nożyczkami preparacyjnymi tuż pod najniższym żebrem i przetnij membranę na boki. Przytrzymaj wyrostek mieczykowaty kleszczami i przetnij środek żeber, idąc w górę po obu stronach. Podciągnij żebra/mostek tak, aby grasica była wyraźnie widoczna. 
		Uwaga: Grasica leży bezpośrednio na sercu, składa się z 2 płatów i ma biały, półprzezroczysty kolor.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie zgarnij i wyciągnij płaty grasicy z tkanki łącznej i przenieś do roztworu myjącego (patrz Lista materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór wytrawiający, mieszając 9 ml RPMI-1640 (pożywka Roswell Park Memorial Institute-1640), 0,025 mg/ml oczyszczonej kolagenazy, 10 mM kwasu HEPES [4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego] i 0,2 mg/ml DNazy I w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Roztwór wytrawiający przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia. 
	Uwaga: Ilość przygotowanego roztworu wytrawiającego jest wystarczająca dla maksymalnie pięciu dorosłych myszy grasic, które mogą być inkubowane razem w jednej probówce okrągłodennej o pojemności 5 ml z polistyrenu.</li>
	<li>Przenieś grasicę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm zawierającego 5-6 ml RPMI-1640.</li>
	<li>Rozciąć grasicę za pomocą igły do strzykawki insulinowej 28 G na małe kawałki (około 1 mm3 kwadratowe), aby limfocyty mogły wypłynąć.</li>
	<li>Opłucz kawałki grasicy za pomocą RPMI-1640, który znajduje się na szalce Petriego, za pomocą szklanej pipety Pasteura. Przechyl naczynie i pozwól, aby fragmenty grasicy opadły na dno. Powoli odessać i wyrzucić supernatant RPMI-1640 za pomocą szklanej pipety. Powtórz ten etap płukania z 5-6 ml RPMI-1640 4-5 razy szklaną pipetą, aż roztwór będzie mniej nieprzezroczysty. 
	Uwaga: Na tym etapie zalecane są pipety szklane, ponieważ fragmenty grasicy mają tendencję do przyklejania się do plastiku, co powoduje nadmierną utratę tkanek grasicy. Do dalszej części procedury używaj plastikowych pipet.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant zgodnie z opisem w kroku 1.5. Dodać 3 ml roztworu do wytrawiania i przenieść kawałki grasicy oraz roztwór do 5 ml probówki z polistyrenu o okrągłym dnie.</li>
	<li>Umieścić probówkę na rotatorze probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 minut z prędkością obrotową 12 obr./min.</li>
	<li>Po inkubacji pozwól fragmentom grasicy opaść grawitacyjnie na dnie probówki. Zebrać sklarowany osad za pomocą pipety Pasteura i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z 10 ml roztworu myjącego. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml roztworu do mycia. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.6-1.8 dwukrotnie na fragmentach grasicy w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem. Zebrać supernatant w tej samej probówce o pojemności 50 ml. 
	Uwaga: Wirowanie nie jest konieczne przy drugim i trzecim praniu.</li>
	<li>Po końcowym wytrawieniu pipetować w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety serologicznej o pojemności 2 ml w celu rozdrobnienia wszelkich pozostałych fragmentów w probówce i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o sile 300 x g przez 5 minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 10 ml buforu płuczącego i przefiltrować przez sitko o wielkości komórek 100 μm. Trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
2. Wzbogacenie TEC o nieciągły gradient gęstości
<ol>
	<li>Przygotować roztwór o gradiencie gęstości 21%, mieszając 2,4 ml pożywki o gradiencie gęstości (60% w/v jodiksanolu w wodzie) i 9,6 ml roztworu do mycia.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane komórki grasicy w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml z kroku 1.11 przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 2,5 ml buforu do przemywania .</li>
	<li>Dodaj 20 ml pożywki RPMI-1640 do zawiesiny komórek.</li>
	<li>Napełnić 12 ml roztworu o gradientzie gęstości 21% w 10 ml pipecie serologicznej za pomocą pipetora elektronicznego. Umieścić końcówkę pipety serologicznej na dnie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej komórki i pozwolić, aby roztwór gradientu gęstości spłynął grawitacyjnie na dno probówki.
	<ol>
		<li>Delikatnie usunąć roztwór gradientu gęstości z pipety, aby zakończyć tworzenie dwóch warstw o różnej gęstości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 20 minut przy wilgotności względnej w wirniku z wiadrem wahliwym. Ustaw tempo zwalniania na najwolniejszym poziomie.</li>
	<li>Przenieś wierzchnią warstwę i interfejs do nowej probówki o pojemności 50 ml. 
	Uwaga: Większość TEC jest zachowywana w interfejsie. Limfocyty wytrącą się na dno probówki po odwirowaniu. Jeśli komórki te mają być wykorzystane do innych celów, należy trzykrotnie przepłukać osad 20 ml roztworu myjącego. Zawiesić komórki w 10 ml buforu do przemywania wody.</li>
	<li>Dodać roztwór myjący do 40 ml do probówki w kroku 2.6 i odwirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Aby usunąć supernatant, należy odessać za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz mycie i aspirację jeszcze 2 razy, jak opisano w kroku 2.7.</li>
	<li>Zawiesić w 2 ml roztworu płuczącego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Izolowanie TEC za pomocą FACS
<ol>
	<li>Ustawić komórki z kroku 2.9 przy stężeniu 1x106 komórek/100 μl roztworem myjącym i przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml (polipropylen lub polistyren, zgodnie z zaleceniami instrukcji sortera przepływowego).</li>
	<li>Dodać 2 μl receptora anty-Fc IgG na 1x106 komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać przeciwciała anty-CD45 (rozcieńczenie 1:150, 10 μl na próbkę) i anty-EpCAM (rozcieńczenie 1:100, 10 μl na próbkę) i inkubować w temperaturze 4 °C przez ponad 20 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki 2 ml roztworu płuczącego i odwirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pipetą.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przefiltrować przez sitko o średnicy 100 μm.</li>
	<li>Zastosuj komórki do przyrządu sortującego. Wybierz populację limfocytów i TEC z wyłączeniem najmniejszych komórek na panelu światła rozproszonego bocznego (SSC) / światła rozproszonego do przodu (FSC) (martwe komórki), a następnie przejmij do wybranej populacji CD45-EpCAM+ w celu sortowania13.</li>
</ol>
4. Generowanie agregatów TEC/EAK
Uwaga: Wykonaj przygotowanie odczynnika i etapy związane z mieszaniem komórek pod kapturem laminarnym.
<ol>
	<li>Przygotować kompleksy adaptorów pA/G, mieszając 4 μl anty-His-tag IgG, 8 μl anty-EpCAM IgG i 2,6 μl pA/G w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dostosować posortowane TEC od kroku 3.7 do5x10 4 komórki/ml z roztworem myjącym i odpipetować 100 μl do jednego dołka z nisko parującej, 96-dołkowej okrągłodennej płytki do hodowli tkankowej. Dodaj 14,6 μl kompleksów adaptacyjnych pA/G do komórek. Umieść talerz na bujanej platformie na 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć raz 200 μl roztworu myjącego. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 6 minut. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przemyć raz 200 μl 10% roztworu sacharozy. Wirować przy 400 x g przez 6 min. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 30 μl 10% sterylnego roztworu sacharozy na dołek.</li>
	<li>Dodać 10 μl EAKIIH6 (7,5 mg/ml) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μl EAK16-II (10 mg/ml) do mieszaniny TEC.</li>
	<li>Dodać 100 μl kompletnej pożywki do systemu, aby rozpocząć żelowanie. Umieść płytkę na wytrząsarce platformowej na 15-20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 2-4 godzinach dodać kolejne 100 μl kompletnego podłoża.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do użycia.
	<ol>
		<li>Odessać 100 μl pożywki z powierzchni bez naruszania żelu za pomocą mikropipety i delikatnie dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki, przykładając końcówkę pipety do ścianki studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka agregatów TEC/EAK
<ol>
	<li>W celu zbadania funkcji agregatów TEC/EAK in vivo, należy pobrać hydrożel TEC/EAK po hodowli O/N i przeszczepić go pod torebkę nerkową atymimicznego nagiego myszy, stosując wcześniej opisaną procedurę 11,14.</li>
	<li>Monitoruj rozwój limfocytów T na obrzeżach, zbierając 50-100 μl próbek krwi do probówki do pobierania krwi zawierającej EDTA od nagich myszy 4-6 tygodni po przeszczepie i wybarwić koktajlem przeciwciał anty-CD4, -CD8, -CD45 i -CD312.</li>
	<li>Analizuj procentową zawartość limfocytów T w leukocytach krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) przy użyciu oprogramowania do analizy pojedynczych komórek12.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+colloidal+suspension+of+hydrophobic+compounds+with+an+amphiphilic+self-assembling+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+the+ionic+peptide+EAK16%3A+the+effect+of+charge+distributions+on+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly.</a> Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).</li>
<li>Saunders, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluorogen+activating+proteins+into+self-assembling+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials.</a> Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+the+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coassembly+of+amphiphilic+peptide+EAK16-II+with+histidinylated+analogues+and+implications+for+functionalization+of+beta-sheet+fibrils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo.</a> Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+material+platform+for+displaying+antibodies+to+engage+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells.</a> Biomaterials. 32, 249-257 (2011).</li>
<li>Tajima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+mini+functional+thymic+units+with+EAK16-II%2FEAKIIH6+self-assembling+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel.</a> Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Thymus+Organoids+to+Restore+Thymic+Function+and+Induce+Donor-Specific+Immune+Tolerance+to+Allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts.</a> Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+central+tolerance+of+ICA69+induces+multiple+organ+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity.</a> J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification%2C+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> J Vis Exp. , e51780(2014).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+monocytes+from+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Separation of monocytes from whole human blood.</a> ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).</li>
<li>Li, X., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+subcellular+membrane+vesicles+of+epithelial+and+nonepithelial+cells+by+OptiPrep+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation.</a> Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+method+using+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+significantly+reduces+cytokine+chemokine+production+from+human+islet+preparations%2C+leading+to+prolonged+beta-cell+survival+during+pretransplantation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture.</a> Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Sci Rep. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż TEC są dominującą populacją zrębu grasicy i odgrywają istotną rolę w budowie i funkcji grasicy, stanowią one tylko około 0,1-0,5% całkowitej komórkowości grasicy. Są to również komórki kruche, ponieważ czasami obserwuje się wysoki odsetek śmierci komórek po trawieniu kolagenazą, tj. leczeniu mającym na celu dysocjację TEC od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ich rzadkość (~200 000 na grasicę myszy) i kruchość sprawiły, że wyizolowanie TEC było trudnym zadaniem. Niedawne zastosowanie wysoko oczyszczonej ...

Grasica jest głównym narządem limfoidalnym odpowiedzialnym za generowanie zróżnicowanej populacji reaktywnych na patogeny, samotolerancyjnych limfocytów T, które są niezbędne do funkcjonowania nabytego układu odpornościowego. Jest to dynamiczny narząd, w którym rozwijające się tymocyty, migrowane ze szpiku kostnego jako komórki progenitorowe limfocytów, migrują przez gąbczastą trójwymiarową (3D) matrycę zrębu grasicy, przechodzą specyfikację i różnicowanie linii, a ostatecznie emigrują jako dojrzałe limfocyty T. Powodzenie tego dobrze zaprogramowanego procesu zależy w dużej mierze od wzajemnego oddziaływania między migrującymi tymocytami a mieszkalnymi komórkami nabłonka grasicy (TEC), dominującą populacją zrębu grasicy, która jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania integralności mikrośrodowiska grasicy.
Na podstawie ich anatomicznego położenia i unikalnej funkcji, TEC można podzielić na dwie podgrupy: TEC w korze (cTEC), które są odpowiedzialne za selekcję limfocytów T ograniczonych przez MHC (główny kompleks zgodności tkankowej) (selekcja pozytywna), oraz TEC w rdzeniu (mTEC), które są niezbędne do eliminacji autoreaktywnych limfocytów T (selekcja negatywna) 1,2. Wiele czynników (np. starzenie się, infekcje, napromienianie, leczenie farmakologiczne) może powodować nieodwracalne uszkodzenia nabłonka grasicy, co skutkuje upośledzeniem odporności nabytej. Pomimo licznych prób, przywrócenie funkcji grasicy było wyzwaniem ze względu na trudności w odtworzeniu mikrośrodowiska grasicy. Warto zauważyć, że trójwymiarowa konfiguracja grasicy (3D) ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i funkcji TEC, podczas gdy TEC hodowane w środowisku 2-D szybko zmniejszają ekspresję genów krytycznych dla tymopoezy 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) i jego C-końcowy histydynylowany EAKIIH6 analogowy (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHHH) są amfifilowymi oligopeptydami o niskiej masie cząsteczkowej, które są rozpuszczalne w wodzie dejonizowanej, ale ulegają żelowaniu, tworząc β-fibryle, gdy są wystawione na działanie jonów o sile wyższej niż 20 mM NaCl (normalne stężenie soli w płynie ustrojowym człowieka wynosi 154 mM). Ta właściwość reagująca na środowisko sprawia, że są to wszechstronne bloki konstrukcyjne do tworzenia struktur 3D. Znacznik Hisa na EAKII-H6 zapewnia mechanizm dokowania, dzięki któremu kompleksy rekombinowanego białka A / G wiążącego anty-His IgGs / Fc (αH6: pA / G) mogą służyć jako adaptor do zakotwiczenia leków białkowych i innych biomolekuł (np. przeciwciał) na kompozycie hydrożelowym 5-8.
Wcześniej wykazaliśmy, że znakowane fluorescencyjnie cząsteczki IgG zakotwiczone na hydrożelu mogą być zatrzymywane w miejscu wstrzyknięcia przez okres do 13 dni 9. Ponadto, gdy adaptery αH6:pA / G zakotwiczone w IgG anty-CD4 zostały dodane do hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 (EAK), limfocyty T CD4 + zostały specjalnie wychwycone 10. Korzystając z podobnej techniki, wykazaliśmy niedawno, że agregacja 3-D TEC może być promowana w hydrożelu EAK z kompleksami adaptorowymi przenoszącymi specyficzne dla TEC przeciwciała anty-EpCAM (αH6:pA/G:αEpCAM). Po przeniesieniu pod kapsułki nerkowe nagich myszy, klastry TEC osadzone w hydrożelu EAK mogą skutecznie wspierać rozwój funkcjonalnych limfocytów T in vivo11,12.
Tutaj ilustrujemy naszą metodę szybkiego i skutecznego oczyszczania TEC za pomocą aktywowanego fluorescencją sortowania komórek (FACS) i generowania agregatów 3-D TEC za pomocą systemu hydrożelowego EAK.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701(1 galon)</td><td>Etanol 200 Proof, woda dejonizowana</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, proste</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, proste</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> myjący <td>1x PBS, 0,1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> wytrawiający <td>9 ml RPMI-1640, 0,025&nbsp; mg/ml Liberase TM Klasa badawcza, 10&nbsp; mM HEPES, 0,2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>określany jako "oczyszczona kolagenaza"</td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 Strzykawka insulinowa 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Polistyrenowa rurka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml szklana pipeta</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Służy do płukania fragmentów grasicy. Fragmenty grasicy mają tendencję do przyklejania się do ściany plastikowymi pipetami.</td></tr><tr><td>Rotator rurowy MACSmix</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości średni: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr>5<tr><td>&nbsp; ml Polipropylenowa probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 (Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Stosować w postaci nierozcieńczonej, 2&nbsp; &mikro; l na próbkę</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Stosować w 1:150, 10&nbsp; &mikro; l na próbkę</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Stosować w 1:100, 10&nbsp; &mikro; l na próbkę</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-mysz CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anty-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Probówki Safe-Lock, Biopur, Sterile</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>określane jako "1.5&nbsp; ml probówka do mikrowirówek</td></tr>"<tr><td>96-dołkowa, płytka do hodowli tkankowych, okrągłodenna z pokrywką o niskiej parowaniu</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Platforma bujana: Mikser nutatorów nr 1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Przygotuj ze sterylną wodą destylowaną</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& nbsp;</td><td></td><td>Synteza na zamówienie, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>Syntetyzowane na zamówienie, 7.5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Kompletna pożywka</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5&nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; &mikro; M 2-merkaptoetanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Płodowa surowica bydlęca)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Ciepło inaktywowane przed użyciem</td></tr><tr><td>Długopis/Paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (aminokwas endogenny) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka platformowa: Tancerka brzucha</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>Modelu: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

promowanie agregacji 3d oczyszczonych komórek nabłonka grasicy facs za pomocą samoorganizującego się hydrożelu eak 16-ii/eakiih6

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Inwolucja grasicy, związana ze starzeniem się lub patologicznymi zniewagami, powoduje zmniejszenie produkcji dojrzałych limfocytów T. Przywrócenie funkcji niewydolności grasicy ma kluczowe znaczenie dla utrzymania skutecznej nabytej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T przeciwko atakującym patogenom. Jednak regeneracja i rewitalizacja grasicy okazała się wyzwaniem, głównie ze względu na trudności w odtworzeniu unikalnego mikrośrodowiska 3D zrębu grasicy, które ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i funkcji komórek nabłonka grasicy (TEC). Opracowaliśmy nowatorski system hydrożelowy wspomagający tworzenie agregatów TEC, oparty na właściwościach samoorganizacji amfifilowych oligopeptydów EAK16-II i ich histydynilowanego analogu EAKIIH6. TEC wzbogacono z wyizolowanych komórek grasicy z gradientem gęstości, posortowano za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i znakowano przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM), które zakotwiczono, wraz z anty-His, w kompleksach adaptorowych białka A/G. Tworzenie agregatów komórkowych wspomagano poprzez inkubację TEC z oligopeptydami EAKIIH6 i EAK16-II, a następnie poprzez zwiększenie stężenia jonów w pożywce w celu zainicjowania żelowania. Agregaty TEC osadzone w hydrożelu EAK mogą skutecznie promować rozwój funkcjonalnych limfocytów T in vivo po przeszczepieniu do atymimicznych nagich myszy.

Aby zbadać skuteczność wykorzystania protokołu separacji gradientu gęstości do wzbogacenia komórek zrębu CD45, komórki pobrane zarówno z interfejsu, jak i z wytrąconych granulek limfocytów zostały wybarwione przeciwciałami anty-CD45 i anty-EpCAM. Zarówno przeciwciała anty-Ulex Europaeus Agglutynina 1 (UEA1), jak i przeciwciała anty-MHC klasy II zostały również włączone do koktajlu barwiącego w celu dalszej identyfikacji podzbiorów cTEC i mTEC. Jak pokazano na rysunku 1, b...

Ten film demonstruje protokół wzbogacania komórek nabłonka grasicy (TEC) o gradient gęstości do izolacji FACS. Pokazuje również zastosowanie peptydów EAK16-II/EAKIIH6 do promowania tworzenia agregatów TEC. Mikrośrodowiska hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 zapewniają konfigurację 3D niezbędną do utrzymania przetrwania i funkcji TEC.

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie zastosowania peptydu EAK 16-II/EAKIIH6 w promowaniu agregacji komórek nabłonka grasicy w trójwymiarowej strukturze wspierającej samoprzeżycie i funkcję nabłonka grasicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bioinżynierii grasicy. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykorzystuje peptyd EAK-16-II/EAKIIH6, wspomaga agregację komórek nabłonka grasicy, jest biodegradowalny i może być stosowany do wstrzykiwań.Aby zebrać grasicę, zacznij od umieszczenia trzy- lub pięciotygodniowej myszy C57 black 6J w pozycji leżącej na plecach i zwilż włosy 70% etanolem. Używając ostrych, prostych nożyczek preparacyjnych, wykonaj małe poziome nacięcie przez skórę brzucha. Następnie pociągnij skórę po obu stronach nacięcia, aby odsłonić jamę brzuszną.Następnie wykonaj poziome cięcie tuż pod najniższym żebrem i przetnij na boki do membrany. Za pomocą kleszczy pociągnij wyrostek mieczykowaty i przetnij środek żeber po obu stronach klatki piersiowej. Podciągnij żebra i mostek tak, aby grasica była wyraźnie widoczna.Następnie za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie zgarnij płatki grasicy z tkanki łącznej i umieść je w roztworz

promoting-3-d-aggregation-facs-purified-thymic-epithelial-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie zaprezentowano przygotowanie kultur reaggregatów grasicy traktowanych 2-dGuo.

Reagregacja kultur grasicy

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.

Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych

Poznaj metodę agregacji komórek nabłonka grasicy z użyciem peptydów EAK16-II/EAKIIH6 w trójwymiarowym hydrożelu. Technika ta wspiera przeżycie komórek i ma zastosowanie w bioinżynierii grasicy.

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6 (Wideo) | JoVE Journal

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6

Przeglądaj więcej filmów