Name: Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Poznaj metodę krioskanningowej mikroskopii elektronowej do badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści. Technika ta pozwala na szczegółowe obrazowanie tylakoidów w ich naturalnym kontekście komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andresowi Kaechowi (Uniwersytet w Zurychu) za pomocne rady dotyczące obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Prace te były wspierane przez Dwunarodowy Fundusz Badań i Rozwoju Rolnictwa Stanów Zjednoczonych i Izraela (grant nr. US-4334-10, Z.R.), Izraelska Fundacja Naukowa (grant nr 1034/12, Z.R.) oraz Human Frontier Science Program (RGP0005/2013, Z.R.). Badania mikroskopii elektronowej przeprowadzono w Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging w Instytucie Naukowym Weizmanna.

1. Krioutrwalanie tkanek liściowych przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem
Uwaga: Ta sekcja opisuje, jak przeprowadzić zamrażanie tkanek liści pod wysokim ciśnieniem w eksperymencie z zamrażaniem i pękaniem. W celu zapoznania się z uwagami dotyczącymi próbek roślin, patrz29. Można to dostosować do innych rodzajów tkanek lub próbek z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Używając rogu żyletki, podrap spód wnęki 0.1 mm aluminiowej płytki o średnicy 0.1/0.2 mm (Rysunek 1). Przygotuj co najmniej kilkanaście płytek krwi (6 próbek). Uważaj, aby nie tworzyć śladów noża na obwodzie dysku.
	<ol>
		<li>Po zarysowaniu umyj dyski w absolutnym etanolu, pozostaw do wyschnięcia i przechowuj w czystym naczyniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zamrażarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij komorę alkoholową zamrażarki wysokociśnieniowej izopropanolem.</li>
	<li>Przygotuj domowe urządzenie do infiltracji wspomaganej próżnią, aby zastąpić gaz znajdujący się w tkance liścia płynem.
	<ol>
		<li>Szczelnie przymocować końcówkę pipety o pojemności 200 μl do końca strzykawki o pojemności 10 ml. Odetnij ~1 cm końcówki. Zrób otwór w nakrętce probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby ściśle dopasować odciętą końcówkę. Podciśnienie można wytworzyć wewnątrz probówki, pociągając za tłok strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij mały kawałek liścia z rośliny za pomocą żyletki i za pomocą pęsety umieść liść w probówce mikrowirówkowej wypełnionej do połowy 1-heksadecenem. Naciekaj płynem przestrzenie międzykomórkowe liścia, delikatnie pociągając za tłok, aby wytworzyć podciśnienie, przytrzymaj przez około 30 sekund, a następnie powoli zwolnij tłok.</li>
	<li>Usuń kawałek liścia z rurki za pomocą pęsety. Przytnij liść żyletką, jeśli jest grubszy niż 0,2 mm i wytnij mały kawałek, który zmieści się w płytce krwi.</li>
	<li>Umieść czystą płytkę krwi porysowaną stroną do góry w uchwycie zamrażarki, a następnie umieść w niej wycięty kawałek liścia. Wypełnij pozostałą przestrzeń otaczającą liść 1-heksadecenem. Zamknij kanapkę za pomocą innej płytki, tak aby zadrapania były skierowane w stronę liścia.</li>
	<li>Zamknij i dokręć uchwyt, a następnie włóż go do komory maszyny. Następnie naciśnij przycisk "Jet", aby zamrozić (~2 100 barów przez 300 - 500 ms) i szybko przenieś uchwyt do ciekłego azotu. Ostrożnie wyjmij zamrożoną kanapkę z uchwytu za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety, uważając, aby nie złamać kanapki. 
	Uwaga: Zamknięte mrożone kanapki można natychmiast zamrozić lub przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania. Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać odzieży ochronnej i okularów ochronnych.</li>
</ol>
2. Pękanie zamrażające i powłoka dwuwarstwowa27,28
<ol>
	<li>Przygotować maszynę do szczelinowania zamrażalniczego do użycia, w tym oba pistolety do odparowywania platyny/węgla (Pt/C), jak i węgla, zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw pistolet Pt/C pod kątem 45 stopni, a pistolet węglowy pod kątem 90 stopni.
	<ol>
		<li>Wstępnie zaprogramuj schemat powlekania warstwy Pt/C o długości 2 nm (szybkość powlekania 0,02 - 0,04 nm/s) i warstwy węgla o długości 6 nm (przy ~0,1 nm/s).
		<ol>
			<li>Wprowadź ustawienia na ekranie maszyny do zamrażania i pękania. Wybierz numer użytkownika, w którym zostanie zapisany schemat powlekania.</li>
			<li>Wybierz Pt/C dla "Warstwy 1". Wybierz ramy czasowe, np. 5 min (aby przekroczyć niezbędny czas potrzebny na wykonanie powłoki). Użyj strzałek góra-dół, aby zdefiniować grubość 2 nm.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "Warstwa", aby przejść do warstwy 2. Powtórzyć krok 2.1.1.2, z wyjątkiem wyboru węgla i zdefiniowania grubości 6 nm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetestuj i dostosuj działanie pistoletu.
		<ol>
			<li>Wybierz "Warstwa 1". Wybierz pistolet Pt/C, naciskając przycisk "GUN1" i naciśnij przycisk "ON" na jednostce sterującej parowaniem maszyny do zamrażania i szczelinowania. Monitoruj szybkość parowania i reguluj ją za pomocą pokręteł napięcia i emisji, aż do osiągnięcia szybkości 0,02 - 0,04 nm/s. Naciśnij "OFF", aby wyłączyć pistolet Pt/C.</li>
			<li>Wybierz "Warstwa 2". Powtórz 2.1.2.1, z wyjątkiem wyboru "GUN2" i dostosowania do szybkości parowania ~0,1 nm/s.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić etap systemu zamrażania i pękania do temperatury -140 °C lub -160 °C (odpowiednio dla liści uwodnionych lub odwodnionych). Podłącz wahadłowiec do kriotransferu próżniowego do maszyny i napełnij jego komorę ciekłym azotem. Ciśnienie w chłodzonej komorze zamrażania i pękania wynosi zwykle od 1 do 8 x 10-7 mbar.</li>
	<li>Włóż uchwyt na próbkę szczelinowania zamrażającego (odpowiedni do płytek krwi 3 mm) do stacji załadowczej. Zalać komorę stacji załadowczej ciekłym azotem.</li>
	<li>Załaduj dwie zamrożone kanapki na uchwyt jedna po drugiej za pomocą pęsety o wysokiej precyzji. Dokręć pierwszą kanapkę w uchwycie, a następnie odwróć uchwyt, aby sprawdzić, czy jest dobrze dopasowany na swoim miejscu. Powtórz dla drugiej kanapki.</li>
	<li>Odłączyć schłodzony czółenek od maszyny do szczelinowania zamrażalniczego i podłączyć go do stacji załadowczej. Otwórz zawór wahadłowy, włóż ramię chowane do uchwytu i zablokuj je na miejscu. Ponownie włóż ramię z uchwytem do czółenka i zamknij zawór wahadłowy za pomocą pokrętła stacji ładowania. Przymocuj czółenko do maszyny zamrażającej i łamającej i włóż uchwyt do komory za pomocą ramienia chujnego. Odłącz czółenko od maszyny.</li>
	<li>Ustaw nóż do mikrotomów z pęknięciami zamrażalniczymi na taką wysokość, aby strącił górne płytki kanapek.</li>
	<li>Za pomocą noża do mikrotomów szybko połam kanapki, a następnie natychmiast podnieś je, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek przez zanieczyszczenia przylegające do noża, a następnie przekręć schłodzoną migawkę nad nowo odsłoniętą płaszczyzną, aby osłonić próbki przed możliwym zanieczyszczeniem cząsteczkami wody w komorze.</li>
	<li>Pokryj próbki platyną i węglem.
	<ol>
		<li>Wprowadź "Warstwę 1" na ekranie. Włącz pistolet Pt/C, naciskając przycisk "GUN1", a następnie przycisk "ON". Zbadaj szybkość parowania, a gdy osiągnie ona 0,02 - 0,04 nm/s, jednocześnie naświetl próbki i naciśnij przycisk "Zmierz", aby monitorować grubość osadzonej warstwy. 
		Uwaga: Pistolet wyłączy się automatycznie, gdy grubość osiągnie wstępnie wybraną wartość.</li>
		<li>Przykryj próbki przesłoną po zakończeniu parowania Pt/C.</li>
		<li>Naciśnij przycisk "Warstwa", aby przejść do "Warstwy 2". Powtórzyć kroki 2.8.1 i 2.8.2, z wyjątkiem wyboru "GUN2" (dla węgla) i szybkości parowania ~0,1 nm/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzać stopień systemu zamrażania i szczelinowania do temperatury -120 °C.</li>
</ol>
3. Krioskaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przygotuj skaningowy mikroskop elektronowy do prac kriogenicznych.
	<ol>
		<li>Z menu głównego wybierz Stage/Stage Initialise i potwierdź.</li>
		<li>Wybierz Narzędzia/Idź do panelu i otwórz panel "Śluza powietrzna", wybierając go z listy. Kliknij przycisk "Zamknij zawór komory kolumny". Odpowietrzyć komorę mikroskopu, klikając przycisk Odpowietrznik w zakładce "Próżnia".</li>
		<li>Wybierz Narzędzia/Idź do panelu i otwórz panel "Lista punktów etapu". Wybierz pozycję kriowymiany, aby przesunąć stolik do odpowiednich współrzędnych w celu przyjęcia uchwytu próbki. Uwaga: "Pozycja kriowymiany" jest ustawiona tak, aby była wyrównana z pozycją jednostki transferu podciśnienia.</li>
		<li>Otwórz komorę na próbkę w czystych rękawiczkach i włóż stolik kriogeniczny do głównego stolika mikroskopu. Zamknij komorę i kliknij przycisk Pompa pod zakładką "Próżnia".</li>
		<li>Schłodzić mikroskop do temperatury -120 °C. Napełnić mikroskop Dewara ciekłym azotem. Aktywuj funkcję podgrzewania w jednostce sterującej kriotransferem do -120 °C, gdy temperatura stage spadnie poniżej -120 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj czółenko do kriotransferu do mikroskopu i przenieś uchwyt próbki za pomocą ramienia chowanego do stolika kriogenicznego mikroskopu (jak w kroku 2.5). Odłącz czółenko od mikroskopu.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Otwórz zawór komory kolumny" w panelu śluzy powietrznej.</li>
	<li>Ostrożnie przesuń uchwyt próbki blisko soczewki obiektywu (odległość robocza 1 - 2 mm) za pomocą joysticka. Wybierz przysłonę 10 μm w zakładce "Przysłony". Kliknij dwukrotnie pole EHT w zakładce "Pistolet". Wprowadź 10 (kV) jako wartość docelową EHT i kliknij przycisk OK. Kliknij dolną zakładkę EHT i wybierz opcję "EHT On".</li>
	<li>Wybierz "InLens" z listy rozwijanej Detektory w zakładce "Detektory". Zoptymalizuj warunki obrazowania (ostrość, jasność i kontrast, wyrównanie wiązki, astygmatyzm) zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Skanowanie". Wybierz szybkie skanowanie ("Szybkość skanowania = 1", co odpowiada czasowi skupienia wynoszącemu 100 ns na piksel), aby zminimalizować uszkodzenia wiązki, oraz "Rozdzielczość przechowywania" 1 024 x 768 pikseli. Wybierz "Średnia linii" z listy rozwijanej "Redukcja szumów". Dostosuj wartość N do 20 - 30 wierszy wyszukiwania. Przesuń próbkę za pomocą funkcji "Punkt centralny" (naciskając Control Tab na klawiaturze), aby wyszukać obszary z pękniętymi komórkami i chloroplastami (rysunki 2A i 2B).</li>
	<li>Uzyskuj obrazy pękniętych chloroplastów przy małych powiększeniach (50 - 70 kX) (ryc. 2C i 2D). Użyj funkcji "Center Feature" (naciskając Control-Shift-tab na klawiaturze), aby powiększyć interesujące powierzchnie pęknięć chloroplastów i uzyskać obrazy w dużych powiększeniach (100 - 200 kX, rysunki 3 i 4). Użyj tych samych parametrów, co w kroku 3.6 do akwizycji obrazu, ale zmień wartość Średnia linii na N >100, aby uzyskać redukcję szumów30.
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk Zamrożenie na głównej jednostce sterującej mikroskopu lub w zakładce "Skanowanie", aby zatrzymać skanowanie i zapisać obraz, naciskając przycisk "Zapisz TIFF".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
Uwaga: Ta sekcja opisuje krótką procedurę segmentacji cząstek membrany z obrazów SEM z zamrażania i pękania przy użyciu pakietu open source Fiji31. Podobne wyniki można uzyskać za pomocą innych programów do analizy obrazu.
<ol>
	<li>Otwórz obraz z Fidżi, przeciągając plik obrazu do głównego okna programu. Przekonwertuj obraz na 8-bitowy, wybierając opcję Obraz/Typ/8-bitowy. Wybierz Obraz/Regulacja/Jasność/Kontrast i dostosuj w razie potrzeby (Rysunek 5A).</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Linia prosta narysuj linię o rozmiarze skali osadzonego obrazu. Wybierz opcję Analizuj/Ustaw skalę. Wprowadź odpowiednie informacje o skali (Znana odległość i Jednostka długości) i kliknij przycisk OK. Zapisz ten skorygowany przeskalowany obraz.</li>
	<li>Wybierz opcję Proces/Filtry/Rozmycie gaussowskie (promień 1,5 nm) i kliknij przycisk OK (Rysunek 5B).</li>
	<li>Wybierz opcję Image/Adjust/Auto Local Threshold (Obraz / Dostosuj/Automatyczny próg lokalny) (przy użyciu metody Niblack) i kliknij przycisk OK (Rysunek 5C).</li>
	<li>Wybierz opcję Edit/Invert (Edytuj/Odwróć), a następnie Process/Binary (Binarny/Zlewnia) (Rysunek 5D).</li>
	<li>Narysuj obramowanie wokół obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne. Dodaj wybór do menedżera ROI, wybierając opcję Edytuj/Zaznaczenie/Dodaj do menedżera lub klikając "T".</li>
	<li>Wybierz opcję Edytuj/Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 5E).</li>
	<li>Wybierz Analizuj/Ustaw pomiary, wybierz odpowiednie parametry (np. obszar, dopasowanie elipsy).</li>
	<li>Wybierz opcję Analizuj/Analizuj cząstki. Wprowadź odpowiedni zakres dla wielkości cząstek i zaznacz 'Wyświetl wyniki', 'Dodaj do menedżera' i w razie potrzeby opcję 'Wyklucz na krawędziach' i kliknij OK. Wynik przedstawiono na rysunku 5F.</li>
	<li>Otwórz zapisany plik z obrazem w skali (krok 4.2). Wybierz opcję "Pokaż wszystko" i odznacz opcję "Etykiety" w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Przejrzyj wybrane cząstki umieszczone na oryginalnym obrazie i ręcznie dodaj lub usuń zaznaczenia za pomocą przycisków "Dodaj" lub "Usuń" w Menedżerze ROI. Popraw wszelkie niezbędne wybory, korzystając z narzędzia Zaznaczanie odręczne i przycisku "Aktualizuj" w Menedżerze ROI (rysunki 5G i 5H).</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą uzyskanych pomiarów. W oknie Wyniki kliknij przycisk Wyniki/Podsumowanie, aby uzyskać, na przykład, średnią powierzchnię oraz średnią oś główną i pomocniczą cząstek wymienionych w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Kliknij opcję Wyniki/Rozkład, wybierz parametr (np. Powierzchnia) i kliknij przycisk OK, aby wyświetlić histogram dla tego parametru.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+consequences+of+grana+stacking+of+thylakoid+membranes+in+vascular+plants%3A+a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective.</a> Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+Faces+of+Frozen+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fracture Faces of Frozen Membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).</li>
<li>Branton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Etching+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze-Etching Nomenclature.</a> Science. 190 (4209), 54-56 (1975).</li>
<li>Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Differentiation+of+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes+-+Freeze-Etch+Electron+Microscopy+of+Wild-Type+and+Mutant+Strains+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas.</a> J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.6.+Location+of+the+P700-Chlorophyll+a-Protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1.</a> Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Particle+Movements+Associated+with+Unstacking+and+Restacking+of+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Invitro.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes.</a> Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).</li>
<li>Miller, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-I+-+Changes+in+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).</li>
<li>Miller, K. R., Cushman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-II+-+Thylakoid+Stacking+in+the+Absence+of+the+Photosystem-II+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle.</a> Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).</li>
<li>Miller, K. R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Thylakoid+Outer+Surface+-+Coupling+Factor+Is+Limited+to+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions.</a> J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.3.+Location+of+the+Light-Harvesting+Chlorophyll-Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Carlsberg+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein.</a> Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).</li>
<li>Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Identification+of+the+Exoplasmic+Face+Particles+on+the+Freeze-Fractured+Thylakoid+Membranes+-+a+Study+Using+Double+and+Triple+Mutants+from+Chlamydomonas-Reinhardtii+Lacking+Various+Photosystem-Ii+Subunits+and+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex.</a> Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).</li>
<li>Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex+.2.+Localization+of+the+Complex+in+the+Thylakoid+Membranes+from+Spinach+and+Chlamydomonas-Reinhardtii+by+Immunocytochemistry+and+Freeze-Fracture+Analysis+of+B6%2FF+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants.</a> Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).</li>
<li>Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Relationship+between+Light+Harvesting+Complex+and+Photosystem-1+and+Photosystem-2+in+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes.</a> J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+structure%3A+from+chlorophyll+granules+to+supra-molecular+architecture+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes.</a> Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).</li>
<li>Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+architecture+and+dynamics+of+the+photosynthetic+apparatus+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants.</a> Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).</li>
<li>Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+and+Organelles+of+Dehydrated+Selaginella+and+Tortula+Retain+Their+Normal+Configuration+and+Structural+Integrity+-+Freeze-Fracture+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence.</a> Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).</li>
<li>Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+use+of+intact+plant+tissues+in+freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).</li>
<li>Kirchhoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-light-induced+formation+of+semicrystalline+photosystem+II+arrays+in+higher+plant+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts.</a> Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).</li>
<li>Johnson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotective+Energy+Dissipation+Involves+the+Reorganization+of+Photosystem+II+Light-Harvesting+Complexes+in+the+Grana+Membranes+of+Spinach+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts.</a> Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).</li>
<li>Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+photosystem+II+organization+in+grana+thylakoid+membranes%3A+evidence+for+a+structured+arrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement.</a> Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).</li>
<li>Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Light-harvesting+superstructures+of+green+plant+chloroplasts+lacking+photosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems.</a> Plant Cell Environ. , (2015).</li>
<li>Goral, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+antenna+composition+controls+the+macrostructure+and+dynamics+of+thylakoid+membranes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis.</a> Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).</li>
<li>Charuvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection+Conferred+by+Changes+in+Photosynthetic+Protein+Levels+and+Organization+during+Dehydration+of+a+Homoiochlorophyllous+Resurrection+Plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant.</a> Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).</li>
<li>Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Mechanisms+of+Desiccation+Tolerance+in+Selected+Angiosperm+Resurrection+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants.</a> Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).</li>
<li>Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalther%2C+P+%22Biological+Low-Voltage+Scanning+Electron+Microscopy%22">Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy</a>. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).</li>
<li>Walther, P., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+field-emission+cryo-scanning+electron+microscopy--present+state+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications.</a> Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).</li>
<li>Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+high-resolution+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy.</a> J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).</li>
<li>Hess, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+methodology+for+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation methodology for plant cell biology.</a> Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).</li>
<li>Nevo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+Thylakoid+Membrane+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Photosynth%22%5BJournal%5D)">Architecture of Thylakoid Membrane Networks.</a> Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technika opisana w niniejszej pracy pozwala na badanie pękniętych przez zamrożenie błon w kontekście dobrze zachowanych wysokociśnieniowych zamrożonych tkanek roślinnych za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej. Główną zaletą stosowania tych procedur jest to, że przygotowanie próbki jest czysto fizyczne; Nie są konieczne żadne czynności związane z chemikaliami lub odwodnieniem. Tym samym pozwala na badanie struktur biologicznych w stanie zbliżonym do rodzimego26,32. Zaletą stosowania tkanek liści jes...

Fotosynteza tlenowa, pochodząca od starożytnych cyjanobakterii, została odziedziczona przez glony i rośliny lądowe w wyniku endosymbiotycznych zdarzeń, które doprowadziły do rozwoju organelli chloroplastowych. We wszystkich współczesnych fototrofach tlenowych fotosyntetyczny transport elektronów oraz generowanie siły napędowej protonów i mocy redukcyjnej odbywa się w spłaszczonych pęcherzykach przypominających worki, zwanych błonami "tylakoidalnymi". Błony te zawierają kompleksy białkowe, które przeprowadzają reakcje fotosyntezy sterowane światłem i zapewniają pożywkę do transdukcji energii. Błony tylakoidalne roślin i (niektórych) glonów są zróżnicowane na dwie odrębne domeny morfologiczne: ściśle przylegające obszary błony zwane "grana" i nieułożone błony, które łączą się ze sobą, zwane "blaszkami zrębu"1. Począwszy od wczesnych lat siedemdziesiątych XX wieku, przeprowadzono różne badania szczelinowania zamrażalno-szczelinowego błon tylakoidalnych roślin i glonów. Po pęknięciu przez zamrożenie błony pękają wzdłuż swojego hydrofobowego rdzenia2, tworząc powierzchnię egzoplazmatyczną (EF) i powierzchnię protoplazmatyczną (PF), w zależności od przedziału komórkowego, z którym graniczy półbłona, jak pierwotnie ukuto przez Brantona i wsp. W 1975r. 3. Tyrakooidy roślinne i glony mają cztery różne powierzchnie pęknięcia: EFs, EFu, PFs i PFu, przy czym "s" i "u" oznaczają odpowiednio "ułożone" i "nieułożone" obszary błony. Kompleksy białek błonowych, które nie są podzielone ani uszkodzone, mają tendencję do pozostawania po stronie E lub P błony. Wstępne obserwacje, że różne powierzchnie pęknięć tylakoidów zawierają cząstki o różnych rozmiarach i gęstościach4, oraz liczne badania, które nastąpiły później, doprowadziły do identyfikacji i korelacji między obserwowanymi cząstkami a kompleksami białek błonowych, które przeprowadzają reakcje świetlne5-13 (patrz także przeglądy14,15).
Eksperymenty z zamrażaniem i pękaniem błon tylakoidowych są zazwyczaj przeprowadzane na preparatach chloroplastów lub izolowanych błon tylakoidów (ale patrz16,17), ryzykując jakiekolwiek zmiany w organizacji strukturalnej i/lub supramolekularnej, które mogą wystąpić podczas procedury izolacji. Po złamaniu repliki są przygotowywane przez odparowanie platyny/węgla (Pt/C), następnie przez grubą warstwę węgla (C), a na końcu trawienie materiału biologicznego18. Repliki są wizualizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Tradycyjna technika zamrażania-pękania-repliki nadal służy jako ważne narzędzie do badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych i ich adaptacji do różnych, np. świetlnych, warunków19-23.
W naszym ostatnim badaniu homoiochlorofilowej rośliny zmartwychwstania Craterostigma pumilum24, chcieliśmy zbadać zmiany w supramolekularnej organizacji błon tylakoidowych, jak również w ogólnej organizacji komórek, podczas odwodnienia i ponownego nawodnienia. Wyjątkowość homoiochlorofilnych gatunków wskrzeszenia polega na tym, że są one w stanie przetrwać warunki wysuszenia w swoich tkankach wegetatywnych (liściach), zachowując przy tym swój aparat fotosyntetyczny. Gdy woda jest dostępna, rośliny te odzyskują siły i wznawiają aktywność fotosyntetyczną w ciągu kilku godzin do kilku dni25. W tym badaniu obrazowanie krioskaningowe EM (SEM) próbek liści popękanych przez lód połączono z zamrażaniem wysokociśnieniowym w celu kriounieruchomienia próbki. Procedury te umożliwiają wizualizację zamrożonych, uwodnionych próbek biologicznych w stanie zbliżonym do ich stanu ojczystego26. Jedną z głównych zalet jest to, że próbki są badane bezpośrednio po szczelinowaniu zamrażalniczym i powlekaniu, bez następujących po sobie etapów. Jest to szczególnie istotne dla badań roślin o różnej względnej zawartości wody (RWC), ponieważ ich stan uwodnienia jest utrzymywany podczas przygotowania. Jednak jedną z krytycznych wad jest to, że zamrożone uwodnione próbki mogą ulegać uszkodzeniu wiązki podczas obrazowania, zwłaszcza gdy są skanowane przy dużych powiększeniach, co jest wymagane do dokładnego pomiaru wielkości kompleksów fotosyntetycznych. Aby temu zaradzić, zastosowano metodę zwaną "powlekaniem dwuwarstwowym" (DLC)27,28 w połączeniu ze specyficznymi warunkami obrazowania kriogenicznego. W rezultacie uzyskano próbki, które są znacznie mniej wrażliwe na wiązkę i pozwoliły na wyjaśnienie cennych informacji na temat organizacji supramolekularnej białek fotosyntetycznych i innych składników komórkowych rośliny zmartwychwstania C. pumilum przy dużych powiększeniach in situ.

<table><tbody><tr><td>Etanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-heksadecen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0,1/0,2 Płytki krwi</td><td>Biuro Inżynieryjne M. Wohlwend GmbH, Szwajcaria</td><td>241</td><td>Płytki krwi mają średnicę 3 mm i grubość 0,5 mm (typ A) z wgłębieniami o głębokości 0,1/0,2 mm (o średnicy 2 mm). Podobne płytki krwi można uzyskać od Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Pęseta o wysokiej precyzji</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Szwajcaria) Pęseta Durostar typu #5; Można go zastąpić inną precyzyjną pęsetą.</td></tr><tr><td>Zamrażarka wysokociśnieniowa</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternatywy dla zamrażania wysokociśnieniowego: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>System zamrażania i pękania</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Etap ładowania przygotowania kriogenicznego</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki do uniwersalnego szczelinowania zamrażalniczego</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Uchwyt zaciskowy do nośników próbek o średnicy 3 mm</td></tr><tr><td>Próżniowy wózek kriotransferowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Stolik Cryo SEM</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Krioskaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) próbek z zamarzaniem pozwala na badanie struktur biologicznych w warunkach zbliżonych do rodzimych. W tym miejscu opisujemy technikę badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych (tylakoidalnych) w próbkach liści. Osiąga się to poprzez zamrażanie tkanek liści pod wysokim ciśnieniem, szczelinowanie zamrażalne, powlekanie dwuwarstwowe i wreszcie obrazowanie kriogeniczne. Zastosowanie metody powlekania dwuwarstwowego pozwala na uzyskanie obrazów o dużym powiększeniu (>100 000X) przy minimalnym uszkodzeniu wiązki zamrożonych i uwodnionych próbek, a także przy minimalnych efektach ładowania. Korzystając z opisanych procedur, zbadano zmiany w supramolekularnym rozmieszczeniu kompleksów białkowych anteny fotosystemu i zbierających światło, które zachodzą podczas odwadniania rośliny zmartwychwstania Craterostigma pumilum, in situ.

Rycina 1 przedstawia obrazy cryo-SEM płytek zawierających zamrożone pod wysokim ciśnieniem i rozłamane metodą mrożenia fragmenty liści Craterostigma pumilum. W niektórych próbkach uzyskano rozległe obszary rozłamanych komórek (Rycina 1A). W innych fragment liścia pozostaje ściśle związany z górną tarczą i zostaje od niej oddzielony wraz z nią (Rycina 1B). Jednakże, nawet w drugim przypadku, część tkanki liścia może pozostać przyt...

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Ogólnym celem tej techniki jest badanie organizacji supramolekularnej błon fotosyntetycznych przy użyciu krioskaningowej mikroskopii elektronowej próbek tkanki liściowej poddanych mrożeniu i łupaniu. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak morfologiczna charakterystyka komórek i organelli, rozkład integralnych kompleksów białkowych błon oraz lokalizacja biominerałów. Główną zaletą tej techniki jest to, że mrożenie i łupanie przeprowadza się bezpośrednio na tkankach liści, dzięki czemu organizacja supramolekularna błon tylakoidów jest badana w natywnym kontekście organelli i komórki.Choć metoda ta jest tutaj zaprezentowana na przykładzie próbki biologicznej, można ją zastosować również do takich materiałów jak żele, polimery i systemy dostarczania leków. Zazwyczaj osoby początkujące w tych procedurach powinny mieć świadomość, że nie wszystkie próbki zostaną zamrożone w sposób optymalny lub prawidłowo rozłamane. Aby przeprowadzić krio-utrwalanie tkanek liści poprzez mrożenie pod wysokim ciśnieniem, należy rozpocząć od użycia rogu żyletki do zarysowania dna szczeliny o szerokości 0,1 mm w aluminiowej płytce o grubości od 0,1 do 0,2 mm.Przygotuj co najmniej tuzin płytek dla sześciu próbek. Następnie przemyj płytki absolutnym etanolem i przechowuj je w czystym naczyniu. Po przygotowaniu urządzenia do mrożenia wysokociśnieniowego napełnij pojemnik na próbki ciekłym azotem.Za pomocą żyletki odetnij niewielki fragment liścia z rośliny i używając pęsety, umieść tkankę w probówce do mikrocentryfugi wypełnionej w połowie heksadekanem. Aby przeprowadzić infiltrację przestrzeni międzykomórkowych tkanki liścia, wprowadź końcówkę urządzenia do infiltracji, przygotowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, do otworu w zakrętce probówki i pociągnij tłok, aby wytworzyć próżnię. Po około 30 sekundach zwolnij tłok.Następnie, za pomocą pęsety, wyjmij fragment liścia z probówki. Użyj żyletki, aby wyciąć kawałek wystarczająco mały, by zmieścił się w płytce. W razie potrzeby przytnij liść do grubości poniżej 0,2 milimetra.Aby zapobiec zapadaniu się tkanek, liście są infiltrowane cieczą przed zamrażaniem wysokociśnieniowym. Grubość próbki utrzymuje się poniżej 200 mikronów, aby zmaksymalizować szansę na uzyskanie próbki witryfikowanej. Umieść czystą płytkę z drugą stroną (rysowaną) skierowaną do góry w uchwycie urządzenia do zamrażania.Następnie umieść wycięty fragment liścia w płytce. Użyj heksadekanu, aby wypełnić pozostałą przestrzeń płytki, a następnie przykryj całość drugą płytką, tak aby zadrapania były skierowane w stronę liścia, tworząc strukturę kanapkową. Zamknij i mocno dokręć uchwyt.Zamrozić próbkę, naciskając przycisk jet. Następnie szybko przenieść uchwyt do ciekłego azotu. Za pomocą schłodzonej pęsety wyjąć kanapkę z uchwytu, uważając, aby jej nie uszkodzić.W procedurze występują dwa krytyczne etapy: mrożenie i fraktura, która jest procesem losowym, a jej powodzenie można ocenić dopiero w cryo-SEM, oraz powlekanie dwuwarstwowe, niezbędne do uzyskania obrazów o dużym powiększeniu przy minimalnych uszkodzeniach wywołanych wiązką. Podczas przygotowywania i programowania urządzenia do mrożenia i fraktury zgodnie z instrukcjami producenta, ustaw pistolet platynowo-węglowy (Pt/C) pod kątem 45 stopni, a pistolet węglowy pod kątem 90 stopni. Schłodź platformę systemu mrożenia i fraktury do -140 lub -160 °C.Następnie przymocuj próżniowy transporter kriogeniczny do urządzenia i wypełnij komorę transportera ciekłym azotem. Włóż uchwyt do mrożenia i łamania (freeze-fracturing) do stacji załadunkowej, a następnie wypełnij komorę stacji załadunkowej ciekłym azotem. Następnie, używając pęsety wysokiej precyzji, umieść zamrożoną próbkę typu „sandwich” w uchwycie i mocno ją przytwierdź.Następnie odwróć uchwyt, aby sprawdzić, czy próbka kanapkowa jest zabezpieczona na miejscu, i powtórz czynność dla drugiej próbki. Odłącz schłodzony przenośnik z urządzenia do mrożenia i fraktury, a następnie podłącz go do stacji ładowania. Otwórz zawór przenośnika, wprowadź ramię chwytające do uchwytu, zablokuj je w odpowiedniej pozycji i ponownie wprowadź ramię wraz z uchwytem do przenośnika.Po ponownym zamocowaniu adaptera do urządzenia do mrożenia i łamania, wprowadź uchwyt do komory za pomocą ramienia chwytaka. Następnie ustaw wysokość noża mikrotomu do mrożenia i łamania tak, aby odbił on górne płytki próbek. Za pomocą noża mikrotomu szybko rozłam próbki.Następnie należy bezzwłocznie podnieść nóż, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek przez pozostałości przyklejone do noża. Umieść schłodzoną przesłonę nad nowo odsłoniętą płaszczyzną, aby chronić próbki przed możliwym zanieczyszczeniem cząsteczkami wody w komorze. Następnie, aby pokryć próbki platyną, naciśnij Setup, by wyświetlić Layer 1 na ekranie.Następnie włącz pistolet Pt/C, naciskając przycisk GUN 1, a następnie przycisk ON. Sprawdź szybkość odparowania, a gdy osiągnie ona wartość od 0,02 do 0,04 nanometrów na sekundę, naciśnij przycisk Measure, aby monitorować grubość osadzanej warstwy podczas jednoczesnej ekspozycji próbek. Aby przeprowadzić napylanie węglem, wybierz GUN 2, a następnie naciśnij przycisk ON.Gdy szybkość parowania wyniesie około 0,1 nm/s, należy nacisnąć przycisk Measure i jednocześnie przesunąć migawkę, aby odsłonić próbki. Po zakończeniu nanoszenia powłoki należy ogrzać stół do -120 °C. Aby przygotować skaningowy mikroskop elektronowy do pracy w warunkach kriogenicznych, z menu głównego należy wybrać Stage, Stage Initialize i zatwierdzić wybór.W zakładce Vacuum kliknij przycisk Vent, aby odpowietrzyć komorę mikroskopu. Następnie wybierz Tools, Goto Panel i otwórz panel Stage Points List. Wybierz pozycję CRYO EXCHANGE, aby przesunąć stolik do odpowiednich współrzędnych w celu przyjęcia uchwytu próbki.W czystych rękawiczkach otwórz komorę na preparat i zamocuj stolik kriogeniczny na głównym stoliku mikroskopu. Zamknij komorę i w karcie Próżnia (Vacuum) kliknij przycisk Pompa (Pump). Następnie schłodź mikroskop, napełniając zespół chłodzący mikroskopu ciekłym azotem.Gdy temperatura stolika spadnie poniżej -120 °C, uruchom funkcję grzania w jednostce transferu kriogenicznego, aby ogrzać stolik do -120 °C. Następnie przymocuj wahadło transferowe do mikroskopu i przenieś uchwyt próbki za pomocą ramienia chwytaka do stolika kriogenicznego mikroskopu. Używając dżojstika, ostrożnie przesuń uchwyt próbki w pobliże obiektywu.W zakładce Apertures wybierz aperturę 10-micron. Następnie w zakładce Gun dwukrotnie kliknij pole EHT Target, wprowadź wartość 10 kilovolts dla docelowego EHT i kliknij OK. Aby włączyć napięcie przyspieszające, kliknij dolną zakładkę EHT i wybierz EHT On. W zakładce Detectors wybierz InLens z listy rozwijanej. Następnie przejdź do zakładki Scanning i wybierz prędkość skanowania równą 1, co stanowi szybkie skanowanie w celu zminimalizowania uszkodzeń wiązką, oraz rozdzielczość zapisu 1024 by 768 pixels.Z listy rozwijanej Noise Reduction wybierz opcję Line Average i ustaw wartość n w zakresie od 20 do 30 linii w celu przeprowadzenia wyszukiwania. Następnie, naciskając klawisze Control oraz Tab na klawiaturze, użyj funkcji centerpoint, aby przesunąć próbkę do interesujących obszarów, jednocześnie stosując powiększenie w celu zidentyfikowania regionów z uszkodzonymi komórkami. Po zidentyfikowaniu obszarów z uszkodzonymi komórkami, przeskanuj próbkę przy powiększeniu, aby odnaleźć uszkodzony chloroplast.Następnie należy zmienić wartość średniej liczby linii (line average n) na wartość większą niż 100 w celu redukcji szumów. W zakładce Scanning należy nacisnąć Freeze, aby zatrzymać skanowanie. Za pomocą kombinacji klawiszy Control Shift Tab na klawiaturze uruchamia się funkcję centrowania obiektu (center-feature), aby powiększyć interesujące powierzchnie przełomów chloroplastów; następnie wykonuje się obrazy przy dużym powiększeniu, korzystając z tych samych parametrów co wcześniej.Na koniec naciśnij przycisk Save TIFF, aby zapisać obraz. Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym. Na tej rycinie przedstawiono obraz cryo-SEM płytki zawierającej zamrożony pod wysokim ciśnieniem i rozłupany fragment liścia Craterostigma pumilum z dużym obszarem rozłupanych komórek.W tym przykładzie fragmentu liścia brakuje, jednak pozostała część tkanki liściowej pozostała przyczepiona do rowków noża na płytce. Po znalezieniu udanego przełomu wykonuje się obrazy komórek przy małym powiększeniu, aby zidentyfikować obszary zainteresowania, takie jak przełamane chloroplasty. Następnie pozyskuje się obrazy pojedynczych przełamanych chloroplastów w celu zidentyfikowania płaszczyzn przełomu błon tylakoidów.Na przedstawionym przykładzie widoczny jest obraz thylakoidów w liściach C.Pumilum w dużym powiększeniu. Można wyróżnić cztery różne powierzchnie przełomu: egzoplazmatyczne powierzchnie przełomu błon ułożonych w stosy i nieułożonych, odpowiednio EFs i EFu, oraz protoplazmatyczne powierzchnie przełomu błon ułożonych w stosy i nieułożonych, odpowiednio PFs i PFu.Fotosystem II, lub PS2, znajduje się zarówno w regionach błon grana tworzących stosy w EFs, jak i w regionach błon stromalamelarnych w EFu. Po nawodnieniu gęstość PS2 jest w EFs około trzykrotnie wyższa niż w EFu, co pozwala odróżnić te dwie powierzchnie. Podczas dehydratacji C.Pumilum gęstość PS2 w EFs stopniowo spada, osiągając poziom wynoszący w przybliżeniu połowę gęstości w warunkach nawodnienia.Warto zauważyć, że po dalszym odwodnieniu do poziomu 5 do 10% wzglisnej zawartości wody, kompleksy PS2 organizują się w rzędy i macierze. Rozwój techniki replikowania mrożonego przełomu utorował drogę do badania rozmiarów kompleksów białek błonowych oraz ich rozmieszczenia w błonach biologicznych. Połączenie mrożonego przełomu z mrożeniem pod wysokim ciśnieniem w cryo-SEM pozwala na badanie różnych rodzajów próbek w wielu skalach wielkości, od poziomu tkankowego i komórkowego aż po poziom makromolekularny w stanie zbliżonym do natywnego.Oprócz zaprezentowanej tutaj techniki, w cryo-SEM można zastosować również takie metody jak spektroskopia rentgenowska z detekcją energii, EDS, na przykład w celu analizy biominerałów alkalizujących.

studying-supramolecular-organization-photosynthetic-membranes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Obserwacja rozkładu wody w ksylemie dostarcza istotnych informacji na temat dynamiki przepływu wody w roślinach drzewiastych. W tym badaniu demonstrujemy praktyczne podejście do obserwacji dystrybucji wody ksylemu in situ przy użyciu kriostatu i krio-SEM, co eliminuje sztuczne zmiany stanu wody podczas przygotowywania próbki.

Dystrybucja wody ksylemu w roślinach drzewiastych wizualizowana za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj metodę krioskanningowej mikroskopii elektronowej do badania supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści. Technika ta pozwala na szczegółowe obrazowanie tylakoidów w ich naturalnym kontekście komórkowym.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów