Name: Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji krążących mikroRNA w osoczu i surowicy przy użyciu kropelkowego cyfrowego PCR. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów raka z wysoką czułością bez potrzeby stosowania genów referencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez fundusze z Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem (AIRC) dla MF (MFAG 11676) i dla MN (Special Program Molecular Clinical Oncology - 5 per mille n. 9980, 2010/15) oraz z włoskiego Ministerstwa Edukacji, Uniwersytetów i Badań FIRB 2011 dla MN (Project RBAPIIBYNP).

Izolacja mikroRNA z osocza lub surowicy
Uwaga: Przygotowanie osocza i surowicy jest istotnym krokiem w ilościowym oznaczaniu krążącego miRNA. Nie ma preferowanej procedury przygotowania osocza i surowicy. Jedyną ważną rzeczą do rozważenia jest to, że wszystkie próbki z tego samego eksperymentu muszą być przetwarzane przy użyciu dokładnie tego samego przepływu pracy. Zacznij od 200 μl surowicy lub osocza. Całkowite RNA można wyizolować z surowicy lub osocza za pomocą dostępnych na rynku zestawów.
1. Protokół izolacji całkowitego RNA (w tym miRNA)
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki surowicy/osocza na lodzie.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do lizy (np. QIAzolu) do 200 μl surowicy/osocza.</li>
	<li>Wymieszać przez wirowanie i umieścić probówkę zawierającą homogenat na stole w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 3 μl roztworu 4,16 nM syntetycznego miRNA cel-miR-39-3p z C. elegans.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu. Energicznie wstrząsaj tubką przez 15 sekund. Umieść rurkę na ławce w temperaturze RT na 2 minuty.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania separacji faz: górna faza wodna zawiera RNA.</li>
	<li>Przenieś fazę wodną do nowej probówki, około 700 μl, unikając przenoszenia białego materiału międzyfazowego.</li>
	<li>Dodać 1 ml 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie.</li>
	<li>Odpipetować 700 μl próbki do mini kolumny wirowej umieszczonej na probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę i odwiruj przy 12 000 x g przez 15 sekund. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Powtórz ten krok, używając pozostałej próbki.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu RWT do mini kolumny wirowej, zamknąć pokrywę i wirować przez 15 sekund przy 12 000 x g, aby umyć kolumnę. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Odpipetować 500 μl buforu RPE do mini kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy 12 000 obr./min. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok ponownie.</li>
	<li>Odwirować mini kolumnę wirową z pełną prędkością przez 2 minuty, aby wysuszyć membranę kolumny wirowej z resztek etanolu.</li>
	<li>Przenieść mini wirującą kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i odpipetować 35 μl wody wolnej od RNaz na membranę kolumny.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 12 000 x g w celu elucji RNA.</li>
	<li>Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: Ponieważ nie można dokładnie określić stężenia RNA, należy używać stałych objętości jako miary ilości wejściowej.</li>
</ol>
2. Odwrotna transkrypcja mikroRNA
<ol>
	<li>Rozmrozić składniki mieszanki odczynników do odwrotnej transkrypcji (RT): 5x bufor reakcyjny, woda wolna od nukleaz. Wymieszaj delikatnie odwracając rurki i ułóż na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem wyjmij mieszankę enzymów z zamrażarki i umieść na lodzie. Odkręć wszystkie odczynniki.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę odczynników RT na lodzie, jak opisano w Tabeli 1. Przygotuj co najmniej 10% nadwyżki mieszanki.</li>
	<li>Wymieszać reakcję przez pipetowanie, a następnie odwirować.</li>
	<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Inaktywować odwrotną transkryptazę termicznie przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Rozcieńczenie cDNA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć ilość matrycy cDNA potrzebną do planowanych reakcji ddPCR w wodzie wolnej od nukleaz. Rozcieńczyć reakcję cDNA między 1:50 a 1:500 w wodzie, w zależności od docelowej obfitości miRNA. Rozcieńczony cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczone cDNA okazało się stabilne przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie kropelek i PCR
Uwaga: Wytwarzanie kropel powinno odbywać się na 8 próbkach jednocześnie. Ze względu na wysoką odtwarzalność tej technologii nie są wymagane powtórzenia techniczne 12,15. Próbka bez kontroli szablonu (NTC) powinna być prowadzona na każdej płytce i dla każdego innego warunku ddPCR.
<ol>
	<li>Rozmrozić i zrównoważyć mieszankę główną (np. EvaGreen Master Mix), zestaw starterów mikroRNA i cDNA w RT.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj Master Mix, kilkakrotnie odwracając probówkę. Odkręć wszystkie odczynniki.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę ddPCR zgodnie z opisem w Tabeli 2. Gdy przeprowadza się wiele reakcji ddPCR, należy przygotować roztwór roboczy mieszaniny ddPCR. Przygotuj co najmniej 10% nadwyżki mieszanki.</li>
	<li>Po złożeniu dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę ddPCR.</li>
	<li>Dozuj 12 μl mieszanki ddPCR do 96-dołkowej płytki PCR lub probówek PCR.</li>
	<li>Dodać 8 μl rozcieńczonej matrycy cDNA do każdej probówki/studzienki.</li>
	<li>Włóż wkład generatora kropel do uchwytu.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść 20 μl każdej przygotowanej próbki do dołków na próbki (środkowy rząd) wkładu generatora kropel, unikając pęcherzyków powietrza na dnie studzienki.</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę olejową (dolny rząd) 70 μl oleju z generatora kropelk.</li>
	<li>Zaczepić uszczelkę nad uchwytem wkładu i włożyć do generatora kropel.</li>
	<li>Zamknij pokrywę, aby rozpocząć wytwarzanie kropel zgodnie z protokołem producenta. Po zakończeniu wytwarzania kropel otwórz pokrywę, wyjmij jednorazową uszczelkę. Górne studzienki wkładu zawierają kropelki.</li>
	<li>Powoli i płynnie odpipetować 40 μl zawartości ośmiu górnych studzienek (kropelek) do pojedynczej kolumny 96-dołkowej płytki PCR.</li>
	<li>Natychmiast po przeniesieniu kropel należy uszczelnić płytkę do PCR folią, aby uniknąć parowania. Używaj przebijalnych uszczelek z płytek foliowych, które są kompatybilne z igłami w czytniku kropelkowym.</li>
	<li>Rozpocznij cykl termiczny (PCR) w ciągu 30 minut od uszczelnienia płytki.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem kolarskim zgodnie z tabelą 3.</li>
</ol>
5. Odczyt kropli
<ol>
	<li>Włącz czytnik kropel.</li>
	<li>Przenieś płytkę z termocyklera do czytnika kropel.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę do PCR zawierającą kropelki po PCR w podstawie uchwytu płytki.</li>
	<li>Umieść górną część uchwytu na płytce PCR. Mocno dociśnij oba zaczepy zwalniające w dół, aby zamocować płytkę PCR w uchwycie.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie z komputera systemowego.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Ustawienia, aby zdefiniować eksperyment (kwantyfikacja bezwzględna), a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć odczyt kropli.</li>
		<li>Po zakończeniu odczytu kropelki kliknij przycisk "Analizuj", aby otworzyć i przeanalizować dane.</li>
		<li>Użyj wykresu amplitudy 2D w oprogramowaniu do analizy, aby wybrać dodatnie krople (narzędzie lasso) (rysunek 1B).</li>
		<li>Użyj karty Zdarzenia, aby sprawdzić liczbę dodatnich i całkowitych kropel. Całkowita liczba 18 000 - 21 000 kropel jest zwykle osiągana za pomocą ddPCR bez sondy.</li>
		<li>Po wybraniu dodatnich kropel wyeksportuj wartości stężenia miRNA za pomocą opcji eksportu .csv z zakładki Stężenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krążące miRNA są obecne we krwi w bardzo niskich stężeniach, a ilość RNA, którą można wyekstrahować z próbek osocza i surowicy, jest niska. Z tego powodu trudno je określić ilościowo za pomocą innych technik, takich jak sekwencjonowanie mikromacierzy i RNA. Co więcej, istnieje uogólniony brak zgody co do normalizacji danych i obecności endogennych "referencyjnych" miRNA we krwi. W tym kontekście bardzo atrakcyjna jest czuła technologia, taka jak cyfrowy PCR kropelkowy, zdolna do zliczania kopii miRNA na ml surowicy lub o...

MikroRNA (miRNA) są uwalniane do krwiobiegu przez potencjalnie wszystkie komórki organizmu, w wyniku aktywnego uwalniania lub procesów nekrotycznych i apoptotycznych. Bezkomórkowe miRNA zostały wykryte w krwiobiegu albo jako wolne, stabilne cząsteczki, albo połączone z lipoproteinami lub otoczone wewnątrz egzosomów i mikropęcherzyków 1-3. Uważa się, że funkcjonują one jako komunikatory międzykomórkowe 4, a ich ilość zmienia się w przypadku raka, zaburzeń pracy serca lub chorób autoimmunologicznych 5-7. Ich dokładna i powtarzalna kwantyfikacja stanowi podstawę do ich oceny jako biomarkerów choroby. Jednak z kilku powodów opisanych już w innym miejscu 8,9, kwantyfikacja miRNA w surowicy lub osoczu, a także w innych płynach ustrojowych, może być bardzo trudna 10,11. Niedawno opracowaliśmy metodę bezwzględnej kwantyfikacji krążących miRNA, opartą na starterach LNA specyficznych dla miRNA i technologii cyfrowego PCR (ddPCR) z kropelkami barwnika wiążącego DNA 12. Metodologia ta została zastosowana do walidacji biomarkerów raka piersi miRNA 13,14. 
Po podziale każdej cząsteczki miRNA z odwrotną transkrypcją wewnątrz kropli o rozmiarze nanolitra, możliwe jest policzenie liczby kopii każdego miRNA w każdej próbce, zasadniczo licząc liczbę zielonych, a więc dodatnich, fluorescencyjnych kropel. Gdy tylko dojdzie do reakcji PCR, uzyskuje się dodatnią liczbę, bez konieczności ustalania krzywej wzorcowej lub uwzględniania skuteczności PCR przy obliczaniu ilości docelowej, jak ma to miejsce w przypadku ilościowego RT-PCR (RT-qPCR). Ponadto ddPCR okazał się bardziej czuły i dokładny niż RT-qPCR w kwantyfikacji krążącego miRNA 15. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół tej metodologii, omawiając najistotniejsze kroki, a w szczególności biorąc pod uwagę próbki kliniczne surowicy i osocza.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Kolumny do całkowitego RNA, w tym miRNA, ekstrakcji z surowicy/osocza</td></tr><tr><td>100 nmol RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Sekwencja niestandardowa</td><td>: UCACCGGGUGUAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do syntezy cDNA II, 8-64 rxns</td><td>Zestaw Exiqon</td><td>203301</td><td>do odwrotnej transkrypcji mikroRNA</td></tr><tr><td>Zestaw starterów MicroRNA LNA PCR&NBSP;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx i 2100000-21xxxxx</td><td>Startery do amplifikacji miRNA wewnątrz kropel</td></tr><tr><td>Generator kropel QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Przyrząd do odczytu</td></tr><tr><td>kropel Czytnik kropel QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Przyrząd do generowania kropel</td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantaSoft</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Oprogramowanie do zbierania i analizy danych</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do płytek PX1 PCR</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Zgrzewarka do płyt</td></tr><tr><td>DG8 wkłady i uszczelki generatora kropel</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Wkłady służące do mieszania próbki i oleju w celu wytworzenia kropel</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 olej do generatora kropel do barwnika EvaGreen</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Olej do wytwarzania kropelek</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja krążącego mikrorna przy użyciu chemii barwnika wiążącego dna i kropelkowego cyfrowego pcr

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Krążące (bezkomórkowe) mikroRNA (miRNA) są uwalniane z komórek do krwiobiegu. Ilość specyficznych mikroRNA w krążeniu została powiązana ze stanem chorobowym i może być wykorzystana jako biomarker choroby. Niedawno opracowano czułą i dokładną metodę kwantyfikacji mikroRNA w krążeniu przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii cyfrowego PCR kropelkowego. W szczególności, przy użyciu starterów specyficznych dla miRNA na bazie zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA) z zielonym fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA w kompatybilnym cyfrowym systemie PCR kropelkowym, możliwe jest uzyskanie bezwzględnej kwantyfikacji określonych miRNA. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób wykonanie tej techniki oceny ilości miRNA w płynach biologicznych, takich jak osocze i surowica, jest zarówno wykonalne, jak i skuteczne.

Bezwzględną ilość specyficznych miRNA na ml osocza lub surowicy można oznaczyć przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA oraz technologii droplet digital PCR. Rysunek 1 przedstawia proces selekcji kropel pozytywnych, który określa końcowe stężenie miRNA (kopii/µl) w reakcji amplifikacji obliczane przez oprogramowanie analityczne. Ilość każdego miRNA we krwi jest bardzo zróżnicowana, a niektóre gatunki miRNA występują częściej niż inne. Stosując cDNA r...

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe oznaczenie krążących mikroRNA w płynach biologicznych, takich jak osocze lub surowica, przy użyciu technologii droplet digital PCR. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z dziedziny biomarkerów poprzez identyfikację diagnostycznych i prognostycznych markerów nowotworowych.Główną zaletą tej techniki jest wysoka czułość. Może ona być wykorzystywana do ilościowego oznaczenia również rzadziej występujących mikroRNA bez konieczności stosowania endogennego genu referencyjnego. Zastosowanie tej metody obejmuje diagnostykę nowotworów, ponieważ posiada ona potencjał do identyfikacji osób z rakiem we wczesnym stadium.Metoda ta może być również zastosowana w innych schorzeniach, takich jak zaburzenia neurologiczne lub kardiologiczne. Zazwyczaj osoby przeprowadzające badanie muszą zwrócić uwagę na manipulację kropelkami przed etapem cyklicznego ogrzewania, aby uniknąć ich rozpadu. Dlatego też wizualna demonstracja generowania kropelek jest kluczowa, ponieważ mogą one zostać zniszczone w wyniku nieuwagi podczas manipulacji lub zbyt szybkiego pipetowania.Przystąp do tej procedury od wyizolowania mikroRNA z osocza lub surowicy. Następnie przeprowadź odwrotną transkrypcję i rozcieńczenie zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Wyjmij z zamrażarki zestaw starterów do mikroRNA, master mix EvaGreen oraz cDNA i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.Po rozmrożeniu należy kilkukrotnie odwrócić probówkę z master miksem. Następnie należy odwirować wszystkie odczynniki. Przygotuj roboczy roztwór do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR) zgodnie z instrukcjami zawartymi w załączonym dokumencie.Przygotować mieszaninę dla maksymalnie ośmiu próbek wraz z kontrolą bez matrycy dla każdego stanu oraz z 10% nadmiarem. Po przygotowaniu dokładnie wymieszać i odwirować mieszaninę ddPCR. Należy zauważyć, że powtórzenia techniczne nie są wymagane ze względu na wysoką powtarzalność tej technologii. Po wirowaniu odmierzyć 12 µL mieszaniny ddPCR do każdego dołka płyty PCR z 96 dołkami.Dodaj 8 µL rozcieńczonej matrycy cDNA do każdej studni. Następnie włóż wkład generatora kropel do uchwytu na wkłady. Do środkowego rzędu wkładu generatora kropel ostrożnie przenieś 20 µL każdej przygotowanej próbki.Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza na dno studzienki. Napełnić każdą z olejowych studzienek w dolnym rzędzie 70 µL oleju do generatora kropel. Zahaczyć uszczelkę o uchwyt wkładu.Włóż do generatora kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć generowanie kropel. Po zakończeniu procesu otworzy pokrywę, wyjmij kartridż z generatora kropel i usuń jednorazową uszczelkę. Górne studzienki kartridża zawierają krople.Powoli i płynnie przenieś 40 µL z każdego z ośmiu górnych dołków do jednej kolumny płytki PCR z 96 dołkami. Natychmiast szczelnie zamknij płytkę folią, aby uniknąć odparowania. W ciągu 30 minut od zamknięcia płytki rozpocznij cykli termiczne zgodnie z protokołem PCR opisanym w tabeli trzy załączonego dokumentu.Włącz czytnik kropel. Następnie przenieś płytkę z termocyklera do czytnika kropel. Umieść płytkę PCR z 96 dołkami zawierającą krople po reakcji PCR w podstawie uchwytu na płytki w czytniku kropel.Umieść górną część uchwytu na płytce PCR. Mocno dociśnij oba zaczepy blokujące, aby zabezpieczyć płytkę PCR w uchwycie. Uruchom oprogramowanie QuantaLife na komputerze systemowym. Kliknij Setup i otwórz plik danych szablonu, który zawiera informacje o próbkach, genach docelowych oraz analizach.Z paska nawigacyjnego po lewej stronie wybierz Run. Pojawi się okno Run Options. Z menu Dye Set wybierz EVA, a następnie kliknij OK, aby rozpocząć odczyt kropelek.Po zakończeniu analizy należy użyć wykresu amplitudy 2D w oprogramowaniu analitycznym, aby zaznaczyć krople pozytywne. W celu zaznaczenia kropli pozytywnych należy użyć narzędzia lasso z paska nawigacyjnego po lewej stronie. Następnie należy kliknąć kartę Events, aby sprawdzić liczbę kropli pozytywnych oraz całkowitą liczbę kropli.W przypadku bezsondowego ddPCR zazwyczaj uzyskuje się łącznie 18 000 kropelek. Następnie kliknij kartę Concentration, aby wyświetlić końcowe stężenie próbki. Na koniec skorzystaj z opcji Export.Plik CSV służący do eksportu wartości stężeń mikroRNA. Ilość mRNA miR-181a-5p została określona w dwóch próbkach osocza, S1 i S2, przy zastosowaniu stężeń starterów 0,5 i 1 µL w temperaturach przymieścania 58 i 60 °C. Rysunek ten przedstawia liczbę kopii mikroRNA na mikrolitr w reakcji amplifikacji dla każdego z warunków.Kropelki PCR dodatnie dla każdej próbki są zaznaczone na niebiesko, a kropelki ujemne na czarno. Jak widać, próbka kontrolna nie wykazuje kropelki dodatnich, zgodnie z oczekiwaniami. Przeprowadzenie reakcji PCR w temperaturze 60 °C przy użyciu 0,5 lub 1 µL primera pozwoliło na lepsze rozdzielenie kropelek dodatnich i ujemnych.Na tym rysunku słupki błędów reprezentują 95% przedział ufności Poissona. Tutaj liczba kropel pozytywnych, zaznaczona kolorem niebieskim, jest zestawiona z całkowitą liczbą kropel, zaznaczoną kolorem zielonym. Wspólnie dane te dowodzą, że cyfrowy PCR kropelkowy może być wykorzystany do wyznaczania bezwzględnej liczby kopii microRNA na mikrolitr płynu biologicznego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania kwantyfikacji mRNA przy użyciu cyfrowego PCR kropelkowego (droplet digital PCR). Po opanowaniu tej metody można przeanalizować 96 próbek w ciągu zaledwie kilku godzin, co stanowi optymalną wydajność w warunkach klinicznych. Dzięki każdemu kolejnemu udoskonaleniu technika ta otwiera drogę do biopsji płynnej w celu badania microRNA i innych kwasów nukleotynowych jako biomarkerów chorób.

circulating-microrna-quantification-using-dna-binding-dye-chemistry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Poznaj metodę kwantyfikacji krążących mikroRNA w osoczu i surowicy przy użyciu kropelkowego cyfrowego PCR. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów raka z wysoką czułością bez potrzeby stosowania genów referencyjnych.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Przeglądaj więcej filmów