Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR
June 26th, 2016
Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie krążących mikroRNA i płynów biologicznych, takich jak osocze lub surowica, przy użyciu kropelkowej technologii cyfrowego PCR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytanie w dziedzinie biorynku. Identyfikując nowotwory diagnostyczne i prognostyczne biomarketingowe.
Główną zaletą tej techniki jest wysoka czułość. Może być stosowany do ilościowego oznaczania również mniej obfitych mikroRNA bez konieczności stosowania androgynicznego genu referencyjnego. Implikacje tej metody rozciągają się na diagnostykę raka, ponieważ ma ona potencjał do identyfikacji osób z wczesnym stadium raka.
Może być również stosowany w innych chorobach, takich jak zaburzenia neurologiczne lub kardiologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby muszą zwracać uwagę na manipulację kropelkami przed krokiem cyklu termicznego, aby uniknąć ich zakłócenia. W związku z tym wizualna demonstracja powstawania kropel ma kluczowe znaczenie, ponieważ kropelki mogą zostać zniszczone przez nieostrożną manipulację lub zbyt szybkie pipetowanie.
Rozpocznij tę procedurę od wyizolowania mikroRNA osocza lub surowicy. Następnie odwróć ich transkrypcję i rozcieńcz zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. Wyjmij zestaw starterów mikroRNA EvaGreen master mix i cDNA z zamrażarki i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej.
Po rozmrożeniu kilkakrotnie odwróć rurkę z mieszanką główną. A następnie odkręć wszystkie odczynniki. Przygotować roztwór roboczy w postaci kropli, mieszanki cyfrowej lub ddPCR zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie.
Przygotuj wystarczającą ilość na maksymalnie osiem próbek z kontrolą bez matrycy dla każdego stanu plus nadmiar 10%Po złożeniu dokładnie wymieszaj i odkręć mieszankę ddPCR. Należy pamiętać, że repliki techniczne nie są wymagane ze względu na wysoką odtwarzalność tej technologii. Po odwirowaniu dozuj 12 mikrolitrów mieszanki ddPCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.
Dodaj osiem mikrolitrów rozcieńczonej matrycy cDNA do każdej studzienki. Następnie włóż wkład generatora kropel do uchwytu wkładu. Do środkowego rzędu wkładu generatora kropel ostrożnie przenieś 20 mikrolitrów każdej przygotowanej próbki.
Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza na dno studni. Napełnij każdy z szybów naftowych w dolnym rzędzie 70 mikrolitrami oleju z generatora kropelk. Zaczepić uszczelkę nad uchwytem naboju.
Włóż do generatora kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć wytwarzanie kropel. Po zakończeniu generowania kropel otwórz pokrywę, wyjmij wkład z generatora kropel i usuń jednorazową uszczelkę. Górne studzienki wkładu zawierają kropelki.
Powoli i płynnie przenieś 40 mikrolitrów z każdej z ośmiu górnych studzienek do jednej kolumny 96-dołkowej płytki PCR. Natychmiast uszczelnij płytkę folią, aby uniknąć parowania. W ciągu 30 minut od zapieczętowania płytki należy rozpocząć cykle termiczne przy użyciu protokołu PCR opisanego w tabeli trzeciej dokumentu towarzyszącego.
Włącz czytnik kropel. Następnie przenieś płytkę z termocyklera do czytnika kropel. Umieścić 96-dołkową płytkę PCR zawierającą kropelki po PCR w podstawie uchwytu płytki w czytniku kroplomierzy.
Umieść górną część uchwytu na płytce PCR. Mocno dociśnij oba zaczepy zwalniające w dół, aby zamocować płytkę PCR w uchwycie. Uruchom oprogramowanie QuantaLife z komputera systemowego. Kliknij przycisk Setup (Konfiguracja) i otwórz plik danych szablonu, który zawiera informacje o próbkach, genach docelowych i testach.
Na pasku nawigacyjnym po lewej stronie wybierz pozycję Uruchom. Pojawi się okno Opcje uruchamiania. Z menu Dye Set wybierz EVA i kliknij OK, aby rozpocząć odczyt kropli.
Po zakończeniu przebiegu użyj wykresu amplitudy 2D w oprogramowaniu do analizy, aby wybrać dodatnie krople. Aby wybrać dodatnie kropelki, użyj narzędzia lasso z paska nawigacyjnego po lewej stronie. Następnie kliknij kartę Zdarzenia, aby sprawdzić liczbę dodatnich i całkowitych kropel.
Całkowita liczba 18 000 kropelek jest zwykle osiągana za pomocą ddPCR bez sondy. Następnie kliknij zakładkę Stężenie, aby zwizualizować końcową próbkę stężenia. Na koniec użyj opcji Eksportuj.
CSV do eksportu wartości stężenia mikroRNA. mRNA miR-181a-5p oznaczono ilościowo w dwóch próbkach osocza, S1 i S2, przy użyciu 0,5 i jednego mikrolitra stężenia startera w temperaturach wyżarzania 58 i 60 stopni Celsjusza. Rysunek ten przedstawia kopie mikroRNA na mikrolitr w reakcji amplifikacji dla każdego stanu.
Krople dodatnie do PCR dla każdej próbki są pokazane na niebiesko, a kropelki ujemne są pokazane na czarno. Jak widać tutaj, próbka kontrolna nie ma dodatnich kropel zgodnie z oczekiwaniami. Wykonanie PCR w temperaturze 60 stopni Celsjusza przy użyciu 0,5 lub jednego mikrolitra startera skutkowało lepszą separacją dodatnich i ujemnych kropel.
Na tym rysunku słupki błędów reprezentują 95-procentowy przedział ufności Poissona. A tutaj liczba dodatnich kropel pokazanych na niebiesko jest porównana z całkowitą liczbą kropel pokazanych na zielono. Podsumowując, dane te pokazują, że kropelkowy cyfrowy PCR może być wykorzystany do określenia bezwzględnej liczby kopii mikroRNA na mikrolitr płynu biologicznego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić kwantyfikację mRNA za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR. Po opanowaniu 96 próbek można przeanalizować w ciągu zaledwie kilku godzin, co jest optymalnym wynikiem w warunkach klinicznych. Po każdym opracowaniu technika ta toruje drogę do dziedziny płynnej biopsji w celu zbadania mikroRNA i innych kwasów nukleinowych jako biomarkerów choroby.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje wrażliwą i dokładną metodę ilościowego określania krążących mikroRNA w płynach biologicznych z wykorzystaniem technologii kroplowej dygitalnej PCR. Technika ta jest szczególnie przydatna do identyfikacji biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych w raku.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Biomarkery
Tło
- Krążące mikroRNA są ważne w diagnostyce raka.
- Obecne metody mogą brakować wrażliwości dla mniej obfitujących mikroRNA.
- Kroplowa dygitalna PCR oferuje wysoką wrażliwość bez potrzeby stosowania genów referencyjnych.
- Identyfikowanie raka na wczesnym etapie może poprawić wyniki dla pacjentów.
Cel badania
- Rozwój metody ilościowego określania mikroRNA w osoczu lub surowicy.
- Ulepszenie wykrywania biomarkerów dla diagnozy raka.
- Dostarczenie niezawodnej techniki dla badaczy w dziedzinie biomarkerów.
Stosowane metody
- Chemia oparta na barwniku do ilościowego określania mikroRNA.
- Technologia kroplowej dygitalnej PCR dla wysokiej wrażliwości.
- Analiza płynów biologicznych takich jak osocze i surowica.
- Ocenianie potencjału diagnostycznego i prognostycznego w raku.
Główne wyniki
- Metoda wykazuje wysoką wrażliwość w ilościowym określaniu mikroRNA.
- Może efektywnie wykrywać rzadko występujące mikroRNA.
- Potencjalne zastosowania w identyfikacji raka na wczesnym etapie.
- Wspiera postęp w diagnostyce raka i badaniach nad biomarkerami.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia cenną narzędzie dla badaczy w dziedzinie biomarkerów.
- Ulepsza zdolność do identyfikacji raka na wczesnym etapie poprzez analizę mikroRNA.
- Wysoka wrażliwość techniki jest znaczącą zaletą w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying circulating microRNAs in plasma or serum using droplet digital PCR (ddPCR) enables highly sensitive detection of disease-associated biomarkers, supporting early-stage diagnostic and prognostic efforts. This approach enhances predictive confidence in biomarker-driven discovery and translational research, particularly in oncology and other disease areas where microRNA signatures inform portfolio decisions. The method's absolute quantification and reproducibility position it as a strategic asset for biopharma R&D pipelines seeking robust, scalable biomarker validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of disease-associated microRNA signatures for target validation.
- Supports biological de-risking by providing quantitative evidence of biomarker relevance.
- Facilitates predictive confidence in linking circulating microRNAs to disease states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated quantitative assays for downstream biomarker screening workflows.
- Delivers high sensitivity and reproducibility, eliminating the need for endogenous reference genes.
- Enables reliable evaluation of low-abundance microRNAs in complex biological fluids.
Translational & Preclinical Research
- Aligns circulating microRNA quantification with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of liquid biopsy markers.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate biomarkers toward clinical development.
Pipeline & Workflow Integration
This ddPCR-based quantification method integrates from early biomarker discovery through preclinical validation, supporting lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative microRNA measurement enables hypothesis testing and pathway clarification in disease models.
- Screening: High-throughput, reproducible assay format supports scalable biomarker screening and validation.
- Analytics: Absolute quantification and Poisson-based confidence intervals provide robust statistical outputs for condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment of circulating microRNA data with disease-relevant biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: The platform's scalability and reproducibility enable broad application across biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker validation.
- Operational Value: Standardizes quantification workflows and minimizes technical replicates due to high reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early, quantitative biomarker assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomarker candidates for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in droplet digital PCR setup and droplet handling to avoid sample loss.
- Needs compatible instrumentation for droplet generation, thermal cycling, and droplet reading.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis protocols.
- Adaptable to various biological fluids but sensitive to sample handling and preparation quality.
- Practical limitations include careful droplet manipulation and timely processing to maintain assay integrity.
