Name: Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj edycję genomu za pomocą TALEN w Astyanax mexicanus, aby zbadać genetyczne podstawy adaptacji jaskiniowych. Ta metoda umożliwia testowanie funkcji genów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Departament Genetyki, Rozwoju i Biologii Komórki oraz Uniwersytet Stanowy Iowa oraz przez grant NIH EY024941 (WJ).Dr Jeffrey Essner skomentował manuskrypt.

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Stanowym Iowa i Uniwersytecie Maryland.
1. Projekt TALEN
<ol>
	<li>Wprowadź żądaną sekwencję docelową do witryny projektu TALEN. (Na przykład: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a>). Wprowadź wybrane długości tablicy odstępów/powtórzeń.
	<ol>
		<li>Skopiuj sekwencję genomową do pola oznaczonego "Sekwencja".</li>
		<li>W zakładce "Podaj niestandardowe długości dystansu/RVD" wybierz długość dystansu i długość tablicy. 
		Uwaga: Długości dystansów wynoszące 15 par zasad i powtarzające się długości tablic 15-17 działają dobrze i sprawiają, że montaż jest mniej skomplikowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz parę TALEN. Pary TALEN zaprojektowane wokół unikalnego miejsca enzymu restrykcyjnego pozwalają na genotypowanie poprzez trawienie produktu PCR przez enzym restrykcyjny.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji regionu genomowego otaczającego miejsce docelowe TALEN, korzystając ze strony internetowej, takiej jak Primer330-32. Podczas genotypowania za pomocą enzymu restrykcyjnego należy zaprojektować startery, aby wzmocnić region, który zawiera miejsce enzymu restrykcyjnego tylko raz. Zaleca się, aby region ten został amplifikowany i sekwencjonowany przed budową TALEN w celu zidentyfikowania wszelkich polimorfizmów obecnych w populacji laboratoryjnej A. mexicanus, które mają być wykorzystane do mikroiniekcji.</li>
</ol>
2. Zestaw TALEN (zmodyfikowany z protokołu TALEN Kit)33,34
Aby uzyskać dodatkowe informacje i rozwiązywanie problemów, zobacz protokół34.
<ol>
	<li>Przygotuj i zsekwencjonuj niezbędne plazmidy z zestawu TALEN zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustaw reakcje #1 dla reakcji A i B. Uwzględnij reszty o zmiennej powtarzalnej (RVD) 1-10, a wektor docelowy pFUS_A w reakcji A. Uwzględnij RVD 11-(N-1) i wektor docelowy pFUS_B(N-1) w reakcji B, gdzie N jest całkowitą liczbą RVD w TALEN.
	<ol>
		<li>Do każdej reakcji dodać 1 μl każdego plazmidu zawierającego każdy RVD (100 ng/μl), wektor docelowy (100 ng/μl), 1 μl enzymu restrykcyjnego BsaI, 1 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (2 mg/ml), 1 μl ligazy, 2 μl 10x buforu ligazy i x μl wody o całkowitej objętości 20 μl. Na przykład patrz tabela 1. 
		Uwaga: Można również stosować reakcje połówkowe.</li>
		<li>Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom cykl: 10x (37 °C/5 min + 16 °C/10 min) + 50 °C/5 min + 80 °C/5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj reakcje z nukleazą. Do każdej reakcji dodać 1 μl 25 mM ATP i 1 μl nukleazy. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przekształć reakcje.
	<ol>
		<li>Przekształć 2,5 μl każdej reakcji w 25 μl chemicznie kompetentnych komórek. 
		Uwaga: Można użyć domowych kompetentnych komórek. Jednak komórki o niskiej kompetencji mogą powodować brak kolonii.
		<ol>
			<li>Wymieszać 2,5 μl reakcji z 25 μl chemicznie kompetentnych komórek. Inkubować na lodzie przez pięć minut. Inkubować komórki przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.</li>
			<li>Umieść probówki na lodzie na 2 minuty. Dodaj 125 μl bulionu Super Optimal z represją kataboliczną (SOC). Wstrząsać probówkami w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić 100 μl przekształconych komórek na płytkach LB ze spektynomycyną (50 μg/ml), X-galem i izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Uprawiać O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz 2-3 białe kolonie do każdej reakcji i sprawdź za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów pCR8_F1 i pCR8_R1 (Tabela 2).
	<ol>
		<li>Przygotuj wzorcową mieszankę odczynników. Na przykład patrz tabela 3.</li>
		<li>Wybierz kolonię i rozsmaruj ją na dnie probówki do PCR, a następnie umieść resztki kolonii w 2 ml LB ze spektynomycyną (50 μg/ml). Umieścić 15 μl mieszanki wzorcowej w probówce z kolonią.</li>
		<li>Uruchom następujący program PCR (Tabela 4)</li>
		<li>Sprawdź PCR (uruchom całą objętość) na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Prawidłowe klony będą miały opaskę o oczekiwanym rozmiarze, a także rozmaz i drabinę pasków. Przykład odpowiedniego rozmazu znajduje się w34,33.</li>
		<li>Hodować 2 ml kultur właściwych klonów w pożywce LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miniprzygotuj plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Sekwencja do sprawdzania sekwencji TALEN za pomocą pCR8_F1 i pCR8_R1. Postępuj zgodnie z wcześniej opisanymi metodami35.</li>
	<li>Używając prawidłowych klonów zweryfikowanych przez sekwencjonowanie, skonfiguruj reakcję #2 (zestaw TALEN), która umieści RVD z wektorów A i B oraz końcowy RVD w wektorze docelowym.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do reakcji 2 (Tabela 5). 
		Uwaga: Można stosować reakcje połówkowe.</li>
		<li>Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom następujący program: 37 °C/10 min + 16 °C/15 min + 37 °C/15 min + 80 °C/5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć reakcje.
	<ol>
		<li>Przekształć 2,5 μl każdej reakcji w 25 μl chemicznie kompetentnych komórek.
		<ol>
			<li>Wymieszać 2,5 μl reakcji z 25 μl chemicznie kompetentnych komórek. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Szok termiczny ogniw przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.</li>
			<li>Umieść probówki na lodzie. Dodać 125 μl SOC. Umieścić probówki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić 100 μl transformowanych komórek na płytkach LB z ampicyliną (100 μg/ml), X-gal i IPTG. Uprawiać O/N w temperaturze 37°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz 1-3 białe kolonie do każdej reakcji i sprawdź za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów TAL_F1 i TAL_R2 (Tabela 2).
	<ol>
		<li>Sporządzić roztwór mieszaniny głównej polimerazy, wody i podkładów, jak opisano w Tabeli 3. Wybierz kolonię i rozsmaruj ją na dnie probówki do PCR, a następnie umieść resztki kolonii w 2 ml LB z ampicyliną (100 μg/ml). Umieścić 15 μl roztworu w probówce z kolonią.</li>
		<li>Uruchom program PCR (Tabela 6).</li>
		<li>Sprawdź PCR na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Prawidłowe klony będą miały rozmazywanie i drabinę pasków. Przykład odpowiedniego rozmazu znajduje się w34,33.</li>
		<li>Hodować 2 ml kultur właściwych klonów w pożywce LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miniprzygotuj plazmidy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Sekwencja do sprawdzenia sekwencji TALEN za pomocą TAL_F1 i TAL_R2 zgodnie z wcześniej opisanymi metodami35.</li>
</ol>
3. Transkrypcja mRNA TALEN-ów
<ol>
	<li>Roztrawić 4 μg zweryfikowanej sekwencyjnie matrycy za pomocą 2 μl workaI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uruchom 2 μl plazmidu strawionego przez worekI na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy. Plazmidy, które są prawidłowo trawione, będą wyświetlać pojedyncze pasmo.</li>
	<li>Oczyść pozostały plazmid strawiony przez worek Izgodnie z protokołem zestawu do oczyszczania PCR. Przemyć dwukrotnie roztworem myjącym przed elucją. Eluować do 30 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem produkcji mRNA T3.
	<ol>
		<li>Ustawić półreakcje za pomocą 0,5 μg zlinearyzowanej matrycy (przygotowanej powyżej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Dodać 0,5 μl DNazy (dołączonej do zestawu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść mRNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować do 30 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przeprowadź 1,5% żel agarozowy za pomocą elektroforezy, aby sprawdzić mRNA.
	<ol>
		<li>Oczyść aparat żelowy produktem eliminującym zanieczyszczenie RNazą i przygotuj 1,2% żel.</li>
		<li>Wymieszaj 1 μl mRNA + 4 μl wody wolnej od nukleaz + 5 μl barwnika ładującego glioksylem. Próbki inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut. Odwiruj krótko probówki i umieść je na lodzie przed uruchomieniem żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić stężenie przy użyciu metody ilościowego oznaczania stężeń kwasów nukleinowych i przechowywać RNA w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C. Wybrać taką wielkość porcji, aby RNA nie był zamrażany/rozmrażany więcej niż raz. 
	Uwaga: Zazwyczaj uzyskuje się stężenia 500-1,000 ng/nl. RNA o niższym stężeniu może być stosowane, o ile zachowana jest integralność RNA (oceniana za pomocą opaski, a nie rozmazu na żelu).</li>
</ol>
4. Wstrzyknąć zarodki Astyanax mexicanus za pomocą mRNA TALEN
<ol>
	<li>Przygotować narzędzia do wstrzykiwań.
	<ol>
		<li>Wlać płytki iniekcyjne, wlewając 1,2% agarozy do wody rybnej (woda kondycjonowana wodorowęglanem sodu i solą morską do pH 7,4 i przewodności 700 μS) na szalkę Petriego. Umieść formę (plastikowy element z wypustkami do robienia dołków na ikrę rybną) wewnątrz naczynia. Wyjmij formę, gdy agaroza stwardnieje i przechowuj w temperaturze 4 °C. Szczegółowe informacje na temat formy znajdują się w36.</li>
		<li>Wyciągnąć igły do wstrzykiwań za pomocą ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta. 
		Uwaga: W przypadku wstrzyknięć ważna jest odpowiednia długość igły. Igły, które są zbyt długie, będą zbyt elastyczne do wstrzykiwań. Protokół wyciągania igieł będzie się różnić w zależności od sprzętu używanego do wyciągania igieł. Przykład odpowiedniej igły pokazano na rysunku 1. Do naszego sprzętu wyciągamy igły o długości 5-6 cm, które po złamaniu mają zewnętrzną średnicę na końcówce około 0,011 mm. Należy jednak skalibrować igły (krok 4.3.4) w celu określenia szerokości otworu. Przykładowy program do wyciągania igieł znajduje się w tabeli 7.</li>
		<li>Przygotuj szklane pipety do transferu zarodków, rozbijając pipetę tak, aby otwór był wystarczająco duży, aby mogło przez nie przejść jajo. Podpal złamany koniec, aż przestanie być ostry. 
		Uwaga: Ważne jest, aby podczas pracy z jajami i zarodkami A. mexicanus używać szklanych pipet i szklanych misek, ponieważ są one lepkie i przylegają do plastiku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj jaja etapu 1-komórkowego.
	<ol>
		<li>Rasa A. mexicanus zgodnie ze standardowymi protokołami37. 
		Uwaga: Na przykład, jeśli ryby są utrzymywane w cyklu ciemnym 14 światło: 10 i używają czasu Zeitgerbera (ZT) z ZT0 jako włączonymi światłami i ZT14 jako wyłączonymi światłami, nasze ryby powierzchniowe składają ikrę między ZT15 a ZT19. Dokładny czas tarła musi być określony dla każdego laboratorium z osobna.</li>
		<li>Wywołaj tarło poprzez przekarmienie ryb przez 3-4 dni przed kryciem i umieszczeniem ryb w słodkiej wodzie. Podnieś temperaturę o 2 °F. Uwaga: Nasza początkowa temperatura wody wynosi około 74 °F.</li>
		<li>Zbieraj ikrę ryb na powierzchni w ciemności, sprawdzając co 15 minut, aby uzyskać ikrę na etapie 1 komórki. Z jednej pary ryb powierzchniowych można uzyskać setki jaj.</li>
		<li>Zbieraj jaja w szklanych miskach, aby zapobiec przywieraniu do plastikowych powierzchni i sortuj w celu wyizolowania zarodków na etapie 1 komórki przed wstrzyknięciem, obserwując jaja pod mikroskopem i zbierając jaja, które są pojedynczą komórką. Jaja należy przechowywać w wodzie ze słodkiego systemu (woda w zbiorniku, w której trzymane są dorosłe ryby, która została poddana działaniu pH i przewodności).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć mRNA TALEN.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć różne ilości całkowitego mRNA (równe ilości każdego TALEN-a w parze), aby określić optymalne stężenie do wstrzyknięcia, ponieważ toksyczność i skuteczność różnią się w zależności od pary TALEN. Zacznij od wstrzyknięcia stężeń całkowitego mRNA, które wynoszą 400-800 pg. Rozcieńczyć i połączyć mRNA do pożądanych stężeń w celu wstrzyknięcia 1,5 nl.</li>
		<li>Załaduj rozcieńczone mRNA do tylnej części igły i przymocuj igłę do mikrowstrzykiwacza.</li>
		<li>Przełam igłę za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Skalibrować igłę. Na przykład wysuń 10 razy i zbierz powstałą kroplę w mikrokapilarze. W przypadku 10 x 100 jednorazowych 1,0 μl, 32 mm mikrokapilary, kropla powinna wypełnić mikrokapilę do 0,5 mm dla 1,5 nl/1 wstrzyknięcie. W razie potrzeby dostosować czas i ciśnienie wtrysku.</li>
		<li>Włóż igłę do pojedynczej komórki i wstrzyknij mRNA. Wstrzyknij mRNA bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka.</li>
		<li>Zbierz wstrzyknięte zarodki do szklanych misek. Przechowywać zarodki w temperaturze 23-25 °C. Martwe zarodki (zarodki, które stają się mętne i mają nieregularny kształt) należy regularnie usuwać przez kilka pierwszych dni po wstrzyknięciu. Rekordowa liczba martwych i zdeformowanych zarodków z płytki kontrolnej (niewstrzykniętej) i wstrzykniętej. 
		Uwaga: Zwiększone stężenie mRNA może prowadzić do zwiększonej toksyczności i deformacji/śmierci zarodków. W związku z tym toksyczność w stosunku do skuteczności musi być zrównoważona, aby określić najlepsze stężenie mRNA do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Założyciel fenotypu Ryba i ocena efektywności TALEN
<ol>
	<li>Składanie w ofierze embrionów zgodnie z instytucjonalnym protokołem zwierzęcym. 
	Uwaga: Eutanazja embrionów odbywa się poprzez szybkie schładzanie na lodzie.</li>
	<li>Pobrać zarodki do probówek z paskami PCR o pojemności 0,8 μl za pomocą pipety transferowej. 
	Uwaga: Genotypowanie można przeprowadzić na pojedynczych zarodkach lub pulach zarodków.</li>
	<li>Ekstrakcja DNA.
	<ol>
		<li>Umieścić zarodki w 100 μl 50 mM wodorotlenku sodu (NaOH) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 30 minut, a następnie schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
		<li>Dodać 1/10objętości (10 μl) 1 M Tris-HCl pH 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj PCR w regionie przy użyciu starterów zaprojektowanych w kroku 1.3 (patrz tabele 8 i 9 dla przykładowych protokołów). Dla pojedynczych zarodków 1 μl DNA jest wystarczający do reakcji PCR.</li>
	<li>Otrzymany produkt PCR należy strawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym i przeprowadzić 1,5% żel agarozowy metodą elektroforezy.
	<ol>
		<li>Na przykład w celu genotypowania locus albinizmu oczno-skórnego 2 (oca2) w wstrzykniętych zarodkach należy strawić produkt PCR za pomocą enzymu restrykcyjnego BsrI, dodając 0,5 μl BsrI bezpośrednio do 12,5 μl zakończonej reakcji PCR, inkubując w temperaturze 65 °C przez 2 godziny. Niestrawiony i strawiony produkt należy rozprowadzić na żelu. Pasma oporne na enzymy restrykcyjne (tj. prążki, które nie trawią) wskazują, że obecne są mutacje indukowane przez TALEN (ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Oblicz procentowy współczynnik mutacji, określając procent nieoszlifowanego produktu, analizując obrazy żeli w Fidżi38 za pomocą narzędzia do analizy żeli w celu obliczenia wartości intensywności każdego pasma, jak opisano wcześniej29.</li>
	<li>Określ sekwencję zmutowanych alleli przez TA, klonowanie zmutowanych pasm odpornych na żel, opornych na enzymy restrykcyjne i sekwencjonowanie klonów.
	<ol>
		<li>Żel oczyszcza oporne na enzymy restrykcyjne zmutowane pasmo zgodnie z instrukcjami producenta. TA sklonuj opaskę zgodnie z instrukcjami producenta. Zbieraj kolonie i hoduj w 1,5 ml LB O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
		<li>Miniprep kultur zgodnie z instrukcjami producenta. Wyślij DNA do sekwencjonowania.</li>
		<li>Korzystając z programu, takiego jak ApE, wyrównaj sekwencje mutantów do sekwencji typu dzikiego.
		<ol>
			<li>Skopiuj i wklej obie sekwencje do plików ApE. Wybierz narzędzie "Wyrównaj dwie sekwencje" z menu "Narzędzia".</li>
			<li>Określ dwie sekwencje DNA za pomocą menu rozwijanych. 
			Uwaga: Może być konieczne użycie odwrotnego dopełnienia sklonowanej sekwencji w zależności od kierunku, w którym PCR przeszedł do wektora klonowania. Jeśli sekwencje nie są wyrównane, powtórz kroki, zaznaczając pole "Rev-Com" w polu "Align DNA".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń ryby założycielskie pod kątem fenotypów na odpowiednim etapie i przy użyciu odpowiednich metod dla oczekiwanego fenotypu29 (na przykład ryc. 3). Metody fenotypowania będą oparte na oczekiwanym fenotypie genu, na który ukierunkowany jest badacz za pomocą protokołu.</li>
</ol>
6. Ekran transmisji linii zarodkowej
Uwaga: A. mexicanus osiąga dojrzałość płciową w wieku 4-8 miesięcy.
<ol>
	<li>Krzyżuj dojrzałe płciowo ryby założycielskie z rybami typu dzikiego.</li>
	<li>Należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków lub dorosłych ryb przy użyciu metod opisanych w krokach 5.1-5.7 (ryc. 4). W przypadku dorosłych ryb po znieczuleniu można przyciąć kawałek ogona.
	<ol>
		<li>Znieczulenie ryb poprzez zanurzenie ryb w roztworze trykainy (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego) w celu zmniejszenia stresu podczas obcinania płetw. Po obcięciu płetw pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie. Ryby szybko się regenerują; Obserwuj, aż wyzdrowieją (będą normalnie pływać).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).</li>
<li>Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+mutation+contributes+to+adaptive+beach+mouse+color+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern.</a> Science. 313 (5783), 101-104 (2006).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+means+of+an+easy+TALEN+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy.</a> J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).</li>
<li>Bannister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs+mediate+efficient+and+heritable+mutation+of+endogenous+genes+in+the+marine+annelid+Platynereis+dumerilii%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii.</a> Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+Xenopus+embryos+using+engineered+transcription+activator-like+effector+nucleases+%28TALENs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Ansai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+medaka+using+custom-designed+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases.</a> Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+doublesex-+and+mab-3-related+transcription+factor+6+and+its+involvement+in+spermatogenesis+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia.</a> Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evol Biol. 12, 105(2012).</li>
<li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax+fasciatus+%28Characidae%2C+Pisces%29+-+support+for+the+neutral+mutation+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li>
<li>Teyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+in+neuromasts+of+the+blind+cave+fish+Astyanax+hubbsi+and+the+sighted+river+fish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus.</a> Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetische+Untersuchungen+zur+Evolution+des+Geschmacksapparates+bei+cavernicolen+Fischen%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zool+Syst+Evolutionforsch%22%5BJournal%5D)">Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen.</a> Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).</li>
<li>Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggressive+behavior+of+an+epigean+population+of+Astyanax+mexicanus+%28Characidae%2C+Pisces%29+and+some+observations+of+three+subterranean+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Processes%22%5BJournal%5D)">Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations.</a> Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).</li>
<li>Parzefall, J., Fricke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+reaction+and+schooling+in+population+hybrids+of+Astyanax+fasciatus+%28Pisces%2C+Characidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoires+e+Biospeologie%22%5BJournal%5D)">Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae).</a> Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Genetics+of+Feeding+Behavior+in+the+Cave+Fish+Astyanax+mexicanus+F.+anoptichthys%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Tierpsychol%22%5BJournal%5D)">Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys.</a> Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).</li>
<li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).</li>
<li>Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+adaptive+behavior+and+its+sensory+receptors+promotes+eye+regression+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish.</a> BMC Biol. 10, 108(2012).</li>
<li>Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schooling+Behavior+in+Cavefish+through+Sight-Dependent+and+Sight-Independent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms.</a> Curr Biol. , (2013).</li>
<li>Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+craniofacial+changes+in+blind+cave-dwelling+fish+are+mediated+by+genetically+symmetric+and+asymmetric+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci.</a> Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+controls+eye+degeneration+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish.</a> Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> PLoS One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).</li>
<li>Primer3 v. 0.4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ </a> (2015).</li>
<li>Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3- new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).</li>
<li>Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf</a> (2011).</li>
<li>Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: <a target="_blank" href="http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf">http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf</a> (2012).</li>
<li>Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection">https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection</a> (2009).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FokI+dimerization+is+required+for+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FokI dimerization is required for DNA cleavage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).</li>
<li>Elipot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+enzyme+monoamine+oxidase+explains+part+of+the+Astyanax+cavefish+behavioural+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome.</a> Nat Commun. 5, 3647(2014).</li>
<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nat Commun. 5, 5307(2014).</li>
<li>Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li>
<li>Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system--keeping+zebrafish+gene+targeting+fresh%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh.</a> Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289 (5479), 631-633 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w kierunku zrozumienia genetycznych podstaw ewolucji cech. Chociaż zidentyfikowano geny kandydujące leżące u podstaw ewolucji wielu cech, testowanie tych genów in vivo nadal było wyzwaniem ze względu na brak podatności genetycznej większości interesujących ewolucyjnie gatunków. W tym artykule przedstawiamy metodę edycji genomu u A. mexicanus, gatunku używanego do badania ewolucji zwierząt jaskiniowych. Badania mapowania genetycznego1,21,23 i podej...

Zrozumienie genetycznych podstaw ewolucji cech jest kluczowym celem badawczym biologów ewolucyjnych. Poczyniono znaczne postępy w identyfikacji loci leżących u podstaw ewolucji cech i wskazywaniu genów kandydujących w tych loci (na przykład1-3). Jednak funkcjonalne testowanie roli tych genów pozostaje wyzwaniem, ponieważ wiele organizmów wykorzystywanych do badania ewolucji cech nie jest obecnie genetycznie podatnych na manipulacje. Pojawienie się technologii edycji genomu znacznie zwiększyło możliwości manipulacji genetycznej szeroką gamą organizmów. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) zostały wykorzystane do wygenerowania ukierunkowanych mutacji w genach w wielu organizmach (na przykład4-11). Narzędzia te, zastosowane do systemu istotnego z ewolucyjnego punktu widzenia, mają potencjał, aby zrewolucjonizować sposób, w jaki biolodzy ewolucyjni badają genetyczne podstawy ewolucji.
Astyanax mexicanus to gatunek ryby, który występuje w dwóch formach: formy powierzchniowej zamieszkującej rzekę (ryba powierzchniowa) i wielu form żyjących w jaskiniach (ryby jaskiniowe). Ryba jaskiniowa A. mexicanus wyewoluowała z przodków ryb powierzchniowych (omówionych w12). Populacje ryb jaskiniowych wyewoluowały szereg cech, w tym utratę oczu, spadek lub utratę pigmentacji, zwiększoną liczbę kubków smakowych i neuromastów czaszkowych oraz zmiany w zachowaniu, takie jak utrata zachowania szkolnego, zwiększona agresja, zmiany w postawie żywieniowej i hiperfagia13-19. Ryby jaskiniowe i powierzchniowe są interferentne, a eksperymenty z mapowaniem genetycznym przeprowadzono w celu zidentyfikowania loci i genów kandydujących do cech jaskiniowych1,20-26. Niektóre geny kandydujące zostały przetestowane pod kątem funkcjonalnej roli w przyczynianiu się do cech jaskiniowych w hodowli komórkowej1,19, w organizmach modelowych innych gatunków21 lub przez nadekspresję27 lub przejściowy knockdown przy użyciu morpholinos28 u A. mexicanus. Jednak każda z tych metod ma ograniczenia. Zdolność do generowania zmutowanych alleli tych genów u A. mexicanus ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji w ewolucji ryb jaskiniowych. Tak więc A. mexicanus jest idealnym organizmem kandydującym do zastosowania technologii edycji genomu.
Tutaj przedstawiamy metodę edycji genomu u A. mexicanus za pomocą TALENs. Metoda ta może być wykorzystana do oceny ryb założycielskich z wstrzyknięciem mozaiki pod kątem fenotypów oraz do izolowania linii ryb ze stabilnymi mutacjami w genach będących przedmiotem zainteresowania29.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacja</td><td></td><td></td><td></td>iniekcyjna</tr><tr><td>Aparat</td><td></td><td></td><td></td>żelowy</tr><tr><td>Ściągacz</td><td></td><td></td><td></td>igieł</tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uwaga: O ile nam wiadomo, można korzystać z materiałów eksploatacyjnych różnych firm, chyba że zaznaczono</td><td></td><td></td><td></td>inaczej</tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulowany)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Podłoża mikrobiologiczne: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 w 50% EtOH</td><td>Teknova (zamówiony przez Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek spektynomycyny, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicylina (1,000x roztwór)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, gotowy do użycia</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (zamówiony przez Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (zamówione przez Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Użyj BsaI, a nie BsaI-HF (zgodnie z opisem w protokole Golden Gate TALEN i TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>wyposażone w enzymy</td><td></td>restrykcyjne</tr><tr><td>10x bufor ligazy T4</td><td>Promega (zamówiony przez Fishera)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (zamówiony przez Fishera)</td><td>PRM7123</td><td>Można użyć innego Taq, ale reakcję należy odpowiednio dostosować</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego podwiązywania</td><td>New England Biolabs (zamówiony przez Fishera)</td> <td>50-811-728</td><td>Używamy Quick Ligase do wszystkich reakcji montażu TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Można użyć innych kompetentnych chemicznie komórek lub kompetentnych komórek domowej roboty</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (zamówione przez Fishera)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczne dla plazmidu epicentrum DNazy zależne od ATP</td><td>(zamówione przez Fishera)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Zestaw Qiagen powinien być używany do wstępnego przygotowania plazmidu (zgodnie z opisem w protokole Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Szybkie rozpuszczenie Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (zamówiony przez Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Barwnik do ładowania próbek&nbsp;</td><td>Ambion (zamówiony przez Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (zamówiony przez Fishera)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła sodowo-wapniowego</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek Eppendorf Femtotips do mikrowtryskiwacza Femtojet</td><td>Eppendorf (zamówione przez Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genomu w astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (talen)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identyfikacja alleli genów leżących u podstaw zmian ewolucyjnych jest niezbędna do zrozumienia, jak i dlaczego ewolucja zachodzi. W tym celu wiele ostatnich prac skupiło się na identyfikacji genów kandydujących do ewolucji cech u różnych gatunków. Jednak do niedawna walidacja funkcjonalna interesujących genów kandydujących była wyzwaniem. Niedawno opracowane narzędzia inżynierii genetycznej umożliwiają manipulowanie określonymi genami w wielu różnych organizmach. Zastosowanie tej technologii w organizmach istotnych z ewolucyjnego punktu widzenia pozwoli na bezprecedensowy wgląd w rolę genów kandydujących w ewolucji. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) to gatunek ryby o formach zarówno żyjących na powierzchni, jak i w jaskiniach. Wiele niezależnych linii form żyjących w jaskiniach wyewoluowało od przodków ryb powierzchniowych, które przenikają się ze sobą i z rybami powierzchniowymi, co pozwala na wyjaśnienie genetycznych podstaw cech jaskiniowych. A. mexicanus był używany w wielu badaniach ewolucyjnych, w tym w analizie sprzężeń w celu zidentyfikowania genów kandydujących odpowiedzialnych za szereg cech. Tak więc A. mexicanus jest idealnym systemem do zastosowania edycji genomu w celu zbadania roli genów kandydujących. Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN) do mutacji genów w powierzchni A. mexicanus. Edycja genomu za pomocą TALEN-ów u A. mexicanus została wykorzystana do generowania mutacji w genach pigmentacji. Technika ta może być również wykorzystana do oceny roli genów kandydujących dla wielu innych cech, które wyewoluowały w formach jaskiniowych A. mexicanus.

Iniekcje par TALEN prowadzą do wiązania RVD ze specyficznymi nukleotydami DNA, a w konsekwencji do dimeryzacji domen FokI, co skutkuje pęknięciami obu nici DNA39, które mogą zostać naprawione poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). NHEJ często wprowadza błędy, które prowadzą do insercji lub delecji (indeli). Indele można zidentyfikować poprzez amplifikację regionu otaczającego miejsce docelowe TALEN i trawienie otrzymanego amplikonu enzymem restrykcyjnym, który...

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie mutacji do określonych genów u ryby jaskiniowej Astyanax mexicanus. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ewolucyjnej dotyczące podstaw genetycznych ewolucji cech jaskiniowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przetestowania efektu utraty konkretnego genu u Astyanax mexicanus.Po zaprojektowaniu i złożeniu nukleaz typu TALEN (transcription activator-like effector nucleases) zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 2 µL enzymu Sac1 do trawienia 4 µg zweryfikowanej sekwencyjnie matrycy w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie należy nałożyć 2 µL plazmidu trawionego enzymem Sac1 na 1,5% żel agarozowy i sprawdzić obecność pojedynczego prążka w celu weryfikacji trawienia. Aby przeprowadzić produkcję mRNA T3, należy użyć 0,5 µg zlinearyzowanej matrycy do przygotowania półreakcji zgodnie ze standardowym protokołem.Inkubować w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Następnie dodać 0,4 µL DNazy i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut. Po oczyszczeniu mRNA, w celu sprawdzenia jego jakości, należy użyć produktu eliminującego zanieczyszczenia RNazą do oczyszczenia aparatury do elektroforezy żelowej.Następnie przygotuj żel o stężeniu 1,2%. Wymieszaj 1 µL mRNA, 4 µL wody wolnej od nukleaz oraz 5 µL barwnika do ładowania z glioksalem. Próbki inkubuj w temperaturze 50 °C przez 30 minut.Następnie krótko odwiruj probówki, a potem umieść je w lodzie przed przeprowadzeniem elektroforezy w żelu. Po sprawdzeniu stężenia mRNA przygotuj alikwoty przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym.Po przygotowaniu igieł do iniekcji oraz płytek zgodnie z protokołem tekstowym, indukuj tarło u A.mexicanus poprzez nadmierne karmienie ryb przez trzy do czterech dni przed rozmnażaniem, a następnie umieść ryby w świeżej wodzie. Podnieś temperaturę wody o dwa stopnie Fahrenheita do około 76 stopni Celsjusza. Co 15 minut sprawdzaj w ciemności, czy na powierzchni pojawiły się ikry, i przenoś je do szklanych mis, aby zapobiec ich przywieraniu do powierzchni.Z jednej pary ryb powierzchniowych można uzyskać setki jaj. Pod mikroskopem należy posortować wyizolowane jaja i przenieść te znajdujące się w stadium jednej komórki do świeżej wody systemowej. Należy nabić rozcieńczone mRNA do tylnej części igły, a następnie podłączyć igłę do mikroinjektora.Następnie, używając pęsety, odłam igłę. Aby skalibrować igłę, wykonaj 10 wstrzyknięć i zbierz powstałą kroplę do mikrokapilary. Kropla powinna wypełnić jednorazową mikrokapilarę o rozmiarze 10x100 µl i długości 32 mm w stopniu 0,5 mm na każde 1,5 nL wstrzykniętej cieczy.Następnie wprowadź igłę do pojedynczej komórki i wstrzyknij mRNA. Zbierz wstrzyknięte embriony do szklanych miseczek i inkubuj je w temperaturze od 23 do 25 °C. Przez pierwsze kilka dni po wstrzyknięciu regularnie usuwaj martwe embriony.Zapisz liczbę martwych i zdeformowanych embrionów z płytek kontrolnych (nie wstrzykiwanych) oraz płytek po wstrzyknięciu. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym. Po uśmierceniu ryb zgodnie z protokołem IACUC Twojej instytucji, w celu ekstrakcji DNA, zbierz embriony do 100 µL 50 mM wodorotlenku sodu i inkubuj w temperaturze 95 °C przez 30 minut.Następnie schłodzić do 4 °C. Do schłodzonych embrionów dodać objętość odpowiadającą jednej dziesiątej objętości próbki 1 M Tris-HCl o pH 8. Następnie przeprowadzić PCR, stosując primery, na przykład dla genu albinizmu oczno-skórnego typu 2 lub OCA2.W przypadku pojedynczych zarodków do reakcji PCR wystarcza jeden mikrolitr DNA. Aby przeprowadzić genotypowanie locus OCA2, należy użyć enzymu restrykcyjnego DSR1 do trawienia otrzymanego produktu PCR, dodając 0,5 µL enzymu bezpośrednio do 12,5 µL gotowej reakcji PCR. Po inkubowaniu w temperaturze 65 °C przez dwie godziny należy poddać reakcję oraz próbkę nietrawionego produktu PCR elektroforezie na żelu agarozowym o stężeniu 1,5%.Należy przeprowadzić dodatkowe analizy zgodnie z protokołem tekstowym. Iniekcje TALEN mogą prowadzić do pęknięć obu nici DNA, które mogą zostać naprawione poprzez niehomologiczne łączenie końców, ale mogą również wprowadzić insercje lub delecje (INDELs). Wykorzystując PCR z trawieniem restrykcyjnym końców w celu ukierunkowania na region spacer TALEN, można zidentyfikować INDELs poprzez obecność prążka opornego na enzym restrykcyjny.Iniekcje TALEN mogą wywoływać biallelne mutacje genowe u A.mexicanus, dzięki czemu niektóre fenotypy można ocenić u ryb założycieli. Przykładowo, przeanalizowano gen OCA2, który według hipotez odpowiada za albinizm u ryb jaskiniowych. Jak pokazano tutaj, u ryb po iniekcji TALEN dla genu OCA2 zidentyfikowano plamy albinotyczne, które nie występowały u ryb niepoddanych iniekcji.Na tym obrazie żelu zbadano produkty PCR o długości 306 par zasad z eksonu dziewiątego genu OCA2 u A.mexicanus pod kątem utraty miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego w pulach 10 ryb F1 pochodzących od wstrzykniętej ryby założycielskiej. Amplikon z zarodka kontrolnego uległ trawieniu, podczas gdy część amplikonów w zarodkach F1 z wstrzykniętych ryb była oporna na trawienie restrykcyjne. Ponadto wykazano, że prążki oporne na trawienie restrykcyjne zawierają INDEL-e.Po opanowaniu techniki, wstrzyknięcia te można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tego procesu należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z RNA, aby zapobiec jego degradacji, oraz o dokonywaniu wstrzyknięć na etapie jednej komórki. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać analizę fenotypową w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy konkretny gen odpowiada za kluczowy fenotyp ryby w przypadku mutacji u osobników pływających przy powierzchni.Technika ta utoruje drogę badaczom z dziedziny biologii ewolucyjnej do scharakteryzowania roli genów kandydackich w ewolucji ryby jaskiniowej Astyanax mexicanus. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu wstrzykiwania mRNA TALEN do embrionów Astyanax mexicanus.

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj edycję genomu za pomocą TALEN w Astyanax mexicanus, aby zbadać genetyczne podstawy adaptacji jaskiniowych. Ta metoda umożliwia testowanie funkcji genów in vivo.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Przeglądaj więcej filmów