Name: Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji antygenów dla przeciwciał IgM z potencjałem terapeutycznym w badaniach nad nowotworami i chorobami układu nerwowego. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych biomarkerów i celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 i R21 NS073684), National Science Foundation (CAREER Award), Minnesota Partnership Award for Biotechnology and Medical Genomics, National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) oraz Mayo Clinic Center for Clinical and Translational Science (CCaTS). Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Fundacji Applebaum, Hilton, Peterson i Sanford, Moon and Marilyn Park Directorship Fund oraz rodziny McNeilus.

Patenty na przeciwciała promujące remielinizację i naprawę OUN są wydawane i są własnością Mayo Clinic. Autorzy mają potencjalny konflikt interesów.

Ludzkie naturalne autoprzeciwciała IgM są atrakcyjnymi kandydatami do immunoterapii i wykazały potencjał terapeutyczny w leczeniu różnych chorób, w tym nowotworów i zaburzeń OUN 1-7. Korzystne jest to, że przeciwciała te nie wywołają odpowiedzi immunologicznej, w której wytwarzanie przeciwciał neutralizujących znacznie zmniejsza skuteczną dawkę terapeutyczną i skuteczność. Co ważne, wszystkie przeciwciała o potencjale terapeutycznym są izotypu IgM i należą do repertuaru NAb 3-5,8,9,37,40,42-45. Główną przeszkodą w potencjalnym klinicznym zastosowaniu przeciwciał IgM jest identyfikacja ich antygenów, które w wielu przypadkach są nieokreślone. Standardowe techniki stosowane w przypadku przeciwciał IgG często nie mają zastosowania do identyfikacji antygenu IgM.
Protokół ten opisuje identyfikację PSA-NCAM jako antygenu regeneracyjnego ludzkiego przeciwciała IgM HIgM12, skutecznego w zwierzęcych modelach SM i ALS 15-18. Zastosowana metodologia ma zasadnicze zastosowanie do wszystkich przeciwciał ludzkich ze specyficznymi łańcuchami lekkimi Vκ VκI, VκIII i VκIV oraz przeciwciał mysich z łańcuchami lekkimi VκI, niezależnie od izotypu przeciwciała.
Najważniejszym krokiem w tym protokole jest zastosowanie przeciwciał IgM w zastosowaniach chromatografii powinowactwa. Mówiąc dokładniej, skuteczne przeciwciała są niezbędne do działania jako czynniki ściągające w immunoprecypitacji w celu wyizolowania lub wzbogacenia antygenu ze złożonych lizatów kultur tkankowych lub komórkowych. Wzbogacone frakcje antygenu można porównać z immunoprecypitacjami z przeciwciał kontrolnych izotypu, a następnie przeanalizować pod kątem różnic za pomocą spektrometrii mas. Jednym z podstawowych wymagań lub ograniczeń tego etapu jest obecność prawidłowego przeciwciała Vκ łańcucha lekkiego i gospodarza (człowieka, myszy), aby umożliwić wiązanie przeciwciała z białkiem L-agarozy. Zastosowanie białka wiążącego mannan związanego z agarozą (zwanego również lektyną wiążącą mannozę) zamiast białka L agarozy jest potencjalną alternatywą dla immunoprecypitatu IgM bez specyficznych łańcuchów lekkich Vκ. Jednak, jak stwierdzili Arnold i wsp. 35, przeciwciała IgM związane z antygenem nie wiążą się z białkiem wiążącym mannan, ponieważ docelowy glikan wydaje się być niedostępny, gdy IgM zwiąże się ze swoim antygenem. Na podstawie tych ustaleń białko wiążące mannan nie może być stosowane jako matryca wiążąca do immunoprecypitacji cząsteczek IgM obciążonych antygenem 35. Innymi potencjalnymi alternatywami może być zastosowanie wtórnych przeciwciał anty-IgM IgG związanych z agarozą 46,47 lub zastosowanie aktywowanych powierzchniowo kulek magnetycznych 48. Przeciwciała IgG skierowane przeciwko IgM mogą być chemicznie sieciowane z agarozą A lub agarozą G w celu zmniejszenia zakresu eluowanego przeciwciała wraz z badanym antygenem. Właściwe porównanie różnych wariantów immunoprecypitacji IgM w odniesieniu do pomyślnie zidentyfikowanych antygenów jest trudne, ponieważ większość immunoprecypitacji przeprowadzono w celu wyizolowania lub zubożenia IgM bez dalszego zainteresowania ich antygenami. Ponadto immunoprecypitacje z wykorzystaniem IgMs stosowano głównie w celu potwierdzenia już znanego lub oczekiwanego pojedynczego antygenu z ekspozycją przeciwciał na oczyszczone antygeny 49. Wadą IgG sprzężonych z agarozą skierowanych przeciwko ludzkim IgM jest bardzo niska wydajność (10 - 15%) immunoprecypitowanych cząsteczek IgM surowicy w porównaniu z materiałem wyjściowym 50. W przeciwieństwie do tego, aktywowane powierzchniowo kulki magnetyczne z powodzeniem zastosowano do przeciwciał o różnych izotypach, w tym IgM, w celu immunoprecypitacji włókienek związanych z trzęsawką 48. Metoda ta nie jest ograniczona do specyficznych łańcuchów kappa (Vκ) lub lambda (λ) ani do konkretnego gospodarza i może znacznie poszerzyć spektrum przeciwciał IgM stosowanych w immunoprecypitacji.
Kolejnym ważnym krokiem w protokole jest zdolność przeciwciała do działania jako przeciwciało wykrywające (przeciwciało pierwszorzędowe) w Western blot lub innych platformach przesiewowych. Skuteczne przeciwciała muszą być ukierunkowane na swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem, aby umożliwić wiązanie antygenu w obecności niejonowych lub ewentualnie jonowych detergentów. Przeciwciała o wysokim powinowactwie są powszechne wśród przeciwciał IgG dojrzałych w powinowactwie, ale rzadziej wśród przeciwciał izotypu IgM, co jest jednym z powodów, dla których istnieje stosunkowo niewiele dostępnych na rynku przeciwciał IgM jako środków wykrywających w warunkach biochemicznych. Wysokie powinowactwo wiązania przeciwciał jest wymagane do immunoprecypitacji antygenów molekularnych i do Western blot. Obniżenie stężenia detergentów lub całkowity brak detergentów w IP i do lizy umożliwia celowanie w antygen przez przeciwciała o niskim powinowactwie za pośrednictwem jego domeny Fab. W przeciwieństwie do tego, zdolność przeciwciała do celowania w białko L agaroza poprzez jego część Fc nie jest znacząco zmieniona wśród kontroli izotypów w zakresie różnych stężeń detergentów. Jednak niskie stężenie detergentu w buforze do lizy i buforze IP zapobiega rozerwaniu błony komórkowej i izolacji określonych cząsteczek. Podobnie, niskie stężenie detergentu w do płukania Western blot (np. PBS-T) umożliwia wiązanie antygenu przeciwciał o niskim powinowactwie, ale jednocześnie zwiększa niespecyficzne wiązanie i dlatego nie jest opcją.
Obecność rdzenia białka antygenowego jest kolejnym wymogiem dla tej metody. Białka z modyfikacjami potranslacyjnymi (np. glikoproteiny, lipoproteiny) i niemodyfikowane białka, ale nie same lipidy lub węglowodany, są wykrywalne w Western Bloc. Nie jest możliwe immunoprecypitacja lipidów (np. sfingolipidów) z lizatów tkankowych lub komórkowych w obecności lub bez detergentów. Właściwości fizykochemiczne detergentów i lipidów są zbyt podobne, aby umożliwić selektywne interakcje lipid-przeciwciało, podczas gdy jednocześnie detergenty są niezbędne do rozerwania błon, aby umożliwić selektywną izolację określonych cząsteczek. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, immunoprecypitacje składające się wyłącznie z węglowodanów, przy braku rdzenia białkowego, nie były wcześniej zgłaszane. Staje się to szczególnie istotne, ponieważ przeciwciała IgM często są skierowane przeciwko węglowodanom i glikolipidom, które niekoniecznie są związane z jednostką białkową. Inne techniki chromatograficzne są wymagane do separacji i immunologicznej identyfikacji lipidów i węglowodanów w przypadku braku rdzenia białkowego. Na przykład chromatografia cienkowarstwowa (TLC) lipidów komórkowych z późniejszym wykrywaniem przeciwciał na płytce TLC (immuno-TLC) może być zaimplementowana 51,52.
Inne przeciwciała anty-PSA zostały opisane w poprzednich badaniach i wynikach porównanych z HIgM12, a także z dostępnym na rynku anty-PSA IgM (klon 2-2B). Najczęściej stosowanym przeciwciałem w dziedzinie PSA jest przeciwciało IgG (klon 735) dostępne jako mysie przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne królika 53. To przeciwciało anty-PSA IgG wykrywa PSA na SynCAM i NCAM na różnych typach komórek OUN, w tym komórkach mikrogleju 41. W przeciwieństwie do przeciwciała anty-PSA IgG, ludzkie przeciwciała IgM HIgM12, HIgM42 i mysie przeciwciała anty-PSA IgM (klon 2-2B) nie są w stanie celować w PSA na SynCAM (ale na NCAM) w różnych stadiach embrionalnych i wczesnych stadiach postnatalnych u myszy, podczas gdy niepolisjalilowany SynCAM jest łatwo wykrywalny 15. Zastosowane przeciwciała IgM również nie są w stanie wykryć PSA na komórkach mikrogleju (ryc. 3 + 4). Możliwym wyjaśnieniem różnic obserwowanych między izotypami przeciwciał może być niski poziom PSA-SynCAM w porównaniu z poziomami PSA-NCAM w połączeniu z potencjalnie niższym powinowactwem wiązania przeciwciał IgM w porównaniu z przeciwciałami anty-PSA IgG. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadziliśmy immunoprecypitacje u zwierząt NCAM KO w stadium embrionalnym E17 z obecnymi ogromnymi ilościami SynCAM i użyliśmy HIgM12 jako "środka ściągającego"15. W E17 WT rodzeństwo z miotu kontroluje HIgM12 immunoprecypitowane PSA-NCAM w stopniu, który wykazywał podobną intensywność "ściągniętego" PSA-NCAM w porównaniu z łańcuchem ciężkim IgMs, wykrytym za pomocą densytometrii w kolejnym Western blot przy użyciu eluowanych antygenów. Wynik ten sugerował co najmniej wystarczające powinowactwo HIgM12 do docelowego PSA. W przeciwieństwie do kontroli z miotu WT, HIgM12 nie wykrył PSA przyłączonego do SynCAM u zwierząt NCAM KO. Identyczne wyniki uzyskano w immunoprecypitacjach z użyciem ludzkiego anty-PSA IgM HIgM42. HIgM12 i HIgM42, a także mysi anty-PSA IgM (klon 2-2B) nie były w stanie celować w PSA na SynCAM w Western blot od zwierząt WT i NCAM KO w embrionalnych i postnatalnych stadiach rozwoju. Biorąc pod uwagę niewielką ilość HIgM12 wymaganą (0,1 μg/ml) do specyficznego wykrycia PSA przyłączonego do NCAM w Western blot przy użyciu niewielkich ilości tkanki OUN (0,1 μg tkanki OUN na studzienkę) 15 , wydaje się mało prawdopodobne, aby samo niskie powinowactwo było odpowiedzialne za całkowity brak wykrywania PSA-SynCAM przez HIgM12 w trzech różnych metodach.
Wnioskujemy, że istnieją znaczące różnice między przeciwciałami anty-PSA IgM a często publikowanym przeciwciałem anty-PSA IgG (klon 735). Nie jest jasne, dlaczego dostępne na rynku przeciwciała anty-PSA IgM nie były w przeszłości częściej stosowane w celu potwierdzenia wyników uzyskanych z przeciwciałem anty-PSA IgG 735. Jest to szczególnie interesujące, ponieważ HIgM12 ma już udowodnioną skuteczność w różnych modelach choroby. Podczas gdy inne przeciwciała anty-PSA IgM mogą mieć podobne efekty terapeutyczne, pozostaje niejasne, czy przeciwciało anty-PSA IgG (klon 735) ma podobny wynik terapeutyczny w modelach stwardnienia rozsianego i ALS.
Krótko mówiąc, opisane tutaj metody zostały wykorzystane przede wszystkim do identyfikacji antygenu regeneracyjnego ludzkiego przeciwciała HIgM12 w celu wsparcia potencjalnych badań klinicznych dotyczących stwardnienia rozsianego i prawdopodobnie innych chorób neurodegeneracyjnych. Identyfikacja antygenów dla przeciwciał o aktywności biologicznej jest niezbędnym krokiem do zrozumienia ich mechanizmu działania. Staje się to szczególnie istotne w kontekście licznych przeciwciał monoklonalnych, które są obecnie testowane pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach na ludziach. Chociaż liczba przebadanych klinicznie przeciwciał IgM do tej pory jest niewielka, ostatnie postępy w technologii hybrydoma wraz z rosnącą liczbą badań podkreślających potencjał terapeutyczny tej klasy przeciwciał 1-10,37,40,42-45 wymagają opracowania nowych lub zmodyfikowanych metod mających zastosowanie do identyfikacji niebiałkowych antygenów IgM.

Przeciwciała izotypu IgM wykazują duży potencjał terapeutyczny w leczeniu różnych chorób, w tym raka i zaburzeń OUN 1-7. Grupa Vollmersa zidentyfikowała liczne przeciwciała u pacjentów z rakiem do potencjalnego wykorzystania jako biomarkery specyficzne dla nowotworu lub aktywne terapie, które są w stanie zabijać komórki nowotworowe poprzez indukowanie szlaków apoptotycznych 4,8,9. Co ciekawe, wszystkie zidentyfikowane przeciwciała o potencjale terapeutycznym są izotypu IgM i należą do grupy "naturalnych autoprzeciwciał" (NAbs).
Podobnie, grupa Rodrigueza zidentyfikowała mysie i ludzkie przeciwciała, które stymulują remielinizację w przewlekle zdemielinizowanych zmianach rdzenia kręgowego w modelach stwardnienia rozsianego (MS). Identyczne z przeciwciałami o działaniu przeciwnowotworowym, wszystkie przeciwciała promujące remielinizację są NAbs i mają izotyp IgM 1,6,7,10. Dokładne antygeny dla większości zidentyfikowanych IgM są nadal nieokreślone, w tym ludzkie przeciwciało promujące remielinizację rHIgM22, obecnie w fazie I badań klinicznych dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym 11. Pomimo wielokrotnych wysiłków ekspertów w dziedzinie badań nad lipidami i węglowodanami, zarówno w środowisku akademickim, jak i we współpracy z przemysłem 11, próby identyfikacji antygenu rHIgM22 nie powiodły się. Niepowodzenie standardowych technik stosowanych do identyfikacji antygenów przeciwciał IgG w pracy z przeciwciałami IgM wskazuje na krytyczną potrzebę udoskonalenia metod specyficznych dla tych przeciwciał, które najprawdopodobniej są ukierunkowane na antygeny węglowodanowe lub lipidowe.
Tematem tego manuskryptu jest ludzkie przeciwciało regeneracyjne HIgM12 i eksperymentalne procedury używane do identyfikacji jego antygenu. Przeciwciało HIgM12 zidentyfikowano u pacjentów z makroglobulinemią Waldenstroma, stymuluje wzrost neurytów in vitro 12-14 i jest ukierunkowane na kwas polisjalny (PSA) przyłączony do cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 wydłuża życie w mysim modelu ALS 17 i poprawia wyniki funkcjonalne u myszy zakażonych wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV). W szczególności HIgM12 stymuluje spontaniczną poziomą i pionową aktywność motoryczną u myszy przewlekle zdemielinizowanych i zwiększa liczbę aksonów rdzenia kręgowego o małej i średniej średnicy osiem tygodni po pojedynczej, niskiej dawce przeciwciała wstrzykniętego dootrzewnowo 18.
Cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (NCAM) to glikoproteina z nadrodziny immunoglobulin (Ig) wyrażona na powierzchni komórek neuronów, gleju, mięśni szkieletowych i komórek NK 19-25. Trzy główne izoformy NCAM określane jako NCAM180, NCAM140 i NCAM120, są alternatywnymi wariantami splicingu pierwotnego transkryptu, które różnią się tylko w swojej domenie cytoplazmatycznej. W obrębie OUN NCAM jest główną cząsteczką polisjalilową (> 95%) z długimi, ujemnie naładowanymi homopolimerami kwasu sjalowego. Kwas polisjalowy o n > 10 jest określany jako PSA, ale istnieją krótsze struktury oligomeryczne, które są również istotne biologicznie. Inne białka polisylylowane ulegające ekspresji w OUN to SynCAM1 26, Neuropilina-2 (NRP-2) 27,28 i podjednostka kanału sodowego 25 (w celu zapoznania się z sekcją 29).
Opisane tutaj metody pozwalają na identyfikację antygenu dla ludzkich i mysich immunoglobulin zawierających specyficzne łańcuchy lekkie kappa (Vκ) (łańcuchy lekkie VκI, VκIII lub VκIV dla przeciwciał ludzkich i łańcuchy lekkie VκI dla przeciwciał myszych) niezależnie od izotypu przeciwciała (np. IgG, IgM, IgA, IgD lub IgE). Ograniczenie to opiera się na zastosowaniu białka L agarozy do immunoprecypitacji przeciwciałami o izotypie IgM. Alternatywne strategie mogą obejmować lektyny wiążące mannozę i drugorzędowe przeciwciała IgG anty-IgM kowalencyjnie połączone z kulkami agarozy, co może rozszerzyć zastosowanie tej metody na więcej przeciwciał IgM, w tym te z łańcuchami lekkimi lambda (λ) (patrz dyskusja). Stosunek łańcuchów lekkich IgM Vκ w surowicy do łańcuchów lekkich IgM λ pochodzących od osób zdrowych wynosi 1,5:1 30.
Na podstawie metodologii chromatograficznej użytej tutaj do separacji, wzbogacenia i immunologicznego wykrywania pewnych cząsteczek 31, wszystkie antygeny muszą zawierać co najmniej jedną małą domenę białkową. Specyficzny epitop wiążący przeciwciało może znajdować się w domenie białkowej lub poza nią (np. w glikoproteinach, lipoproteinach). Wstępne etapy biochemiczne stosowane w celu identyfikacji specyficznego antygenu dla HIgM12, odpowiednie do zawężenia listy potencjalnych kandydatów, są najważniejszymi krokami w tej metodzie. Preparaty specyficzne dla typu komórki i charakterystyki oparte na morfologii komórek są opisane dla komórek glejowych, ale ta metodologia może być ekstrapolowana w celu uwzględnienia innych typów komórek w OUN lub poza nim.
Istnieje pilna potrzeba opracowania nowych lub zmodyfikowanych technik mających zastosowanie do rosnącej liczby przeciwciał IgM o potencjale terapeutycznym dla różnych ludzkich zaburzeń, szczególnie w tych przypadkach (większość antygenów IgM), gdzie celem przeciwciał są struktury węglowodanowe lub lipidowe.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Wysoka glukoza, z glutaminą, z pirogronianem sodu, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamina, pirogronian sodu, wysoka glukoza</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>bez surowicy, 10 ml</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sterylna woda do irygacji</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1,000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, Masa cząsteczkowa 30 000-70 000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>frakcji albuminy surowicy bydlęcej V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>frakcja szoku cieplnego, bez proteazy, pH 7,&nbsp; czystość 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Masa cząsteczkowa: 180,16 g / mol, odczynnik ACS, 500 g</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>T9935-100 mg</td><td>zasadniczo bez soli, liofilizowany proszek, 9,000 jednostek BAEE / mg białka</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Typ IV, liofilizowany proszek, 2,000 jednostek Kunitza / mg białka</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko podstawowe Rat FGF R</td><td>& Systemy D</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA jako białko nośnikowe, 25 &#181; g, liofilizowane, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko szczurze PDGF-AA R</td><td>& Systemy D</td><td>1055-AA-50</td><td>bez nośnika, 50 &#181; g, liofilizowane, > 97%, E. pochodna , 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, Bez glutaminy, bez kwasu asparaginowego, bez kwasu glutaminowego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>krystaliczny, 1 kg, klasa odczynnika, Masa cząsteczkowa 30,03 g/mol (jako monomer)</td></tr><tr><td>Tris[hydroksymetylo]aminometan (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, czystość 99,8%, proszek</td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, proszek</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Masa cząsteczkowa: 75,07 g/mol, Biały krystaliczny proszek, 5 kg</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Masa cząsteczkowa: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Masa cząsteczkowa: 119.98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>Bez wapnia i magnezu, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 60 mm z powłoką TC</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm, polistyren poddany działaniu TC, 20 sztuk w opakowaniu, sterylne</td></tr><tr><td>Falcon Szalka Petriego 60 mm x 15 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Bakteriologiczna szalka Petriego bez TC, 20 sztuk w opakowaniu</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 dołków, płaskie dno (pakowane pojedynczo), napromieniowane promieniami gamma, obszar wzrostu 9,5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; kolba do hodowli tkankowych</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U ze skośną szyjką z zatyczką</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Białko L Plus Agaroza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, usieciowana 6% agaroza perałkowa (CL-6B), zdolność wiązania: 10 do 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-dołkowy, 50 &mikro; l, do stosowania z komórkami do elektroforezy Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 &micro; m, rolka 26,5 cm x 3,75 m</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw kwasowi polisjalowemu-NCAM, klon</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 mikrolitrów, Gospodarz: mysz, monoklonalne IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x wstępnie zmieszany bufor do próbek białkowych</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, czystość 98%, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidaza-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 mikrolitrów, 200 i mikro; g/ml, 3,500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Koła nr 1; Grubość: od 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 25 mm</td></tr><tr><td>roztwór buforowy HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, bez wapnia, magnezu, fenolu Czerwona</td></tr><tr><td>papaina</td><td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>liofilizowany proszek, 100 mg</td></tr><tr><td>siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>proszek, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutaminy</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał kappa (vκ) zawierających łańcuch lekki (igm): kwas polisjalowy (psa) dołączony do ncam jako studium przypadku

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Przeciwciała izotypu IgM są często zaniedbywane jako potencjalne terapie w badaniach na ludziach, zwierzęce modele chorób ludzkich, jak również środki wykrywające w standardowych technikach laboratoryjnych. W przeciwieństwie do tego, kilka ludzkich IgM wykazało skuteczność w modelach nowotworowych i modelach zaburzeń OUN, w tym stwardnienia rozsianego (SM) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Powody ich nieuwzględnienia obejmują trudności w ekspresji, oczyszczaniu i stabilizacji przeciwciał IgM, trudności z identyfikacją antygenów (niebiałkowych), niskie powinowactwo wiązania i podstawowe luki w wiedzy w badaniach nad węglowodanami i lipidami. 
Ten manuskrypt używa HIgM12 jako przykładu, aby dostarczyć szczegółowy protokół wykrywania antygenów za pomocą Western blot, immunoprecypitacji i immunocytochemii. HIgM12 jest ukierunkowany na kwas polisjalny (PSA) przyłączony do cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych (NCAM). Wczesna pourodzona tkanka mózgowa myszy od myszy typu dzikiego (WT) i myszy z nokautem NCAM (KO) bez trzech głównych wariantów splicingu ośrodkowego układu nerwowego (OUN) NCAM180, 140 i 120 wykorzystano do oceny znaczenia NCAM w wiązaniu z HIgM12. Dalsze trawienie enzymatyczne tkanki OUN i hodowanych komórek OUN przy użyciu endoneuraminidaz doprowadziło nas do zidentyfikowania PSA jako specyficznego epitopu wiążącego dla HIgM12.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, które można uzyskać badając ludzkie antygeny PSA specyficzne dla IgM w OUN. Przedstawiono zastosowanie ludzkich przeciwciał IgM zawierających specyficzne lekkie łańcuchy Vκ w warunkach biochemicznych oraz w fluorescencyjnej immunocytochemii.
Przeciwciało HIgM12 immunoprecypituje swój antygen z lizatów mózgu i służy jako czynnik detekcyjny (przeciwciało pierwszorzędowe) w analizach Western blot. Ani przeciwciało kontrolne izotypowe, ani kulki agarozowe L nie immunoprecypitują analogicznego antygenu, co dowodzi swoistości procesu pull-down (Rysunek 1). Analizy Western blot z wykorzystaniem lizatów OUN myszy WT oraz NCAM KO wykazują swoistość wiązania HIgM12 z NCAM zawierającym PSA (Rysunek 2A). Trawienie enzymatyczne tkanki OUN myszy WT za pomocą ENDO-NF pozwala zidentyfikować PSA przyłączone do NCAM jako specyficzny epitop wiązania dla HIgM12 (Rysunek 2B). Zastosowanie opisanej tutaj metody pozwala na uzyskanie wysokiej czystości kultur mikrogleju szczurzego z dodatnim wynikiem na IBA-1 (Rysunek 3). Dostępne komercyjnie przeciwciało anty-PSA (klon 2-2B) nie znakuje pul PSA na powierzchni komórki ani wewnątrz niej w utrwalonych i permeabilizowanych komórkach mikrogleju IBA-1-dodatnich podczas mikroskopii fluorescencyjnej. Zgodnie z wcześniej opublikowaną literaturą, w której nie zgłoszono ekspresji PSA-NCAM na powierzchni komórek mikrogleju 16,41, HIgM12 nie znakuje antygenów powierzchniowych w oczyszczonym mikrogleju szczura. Co ciekawe, znakowanie HIgM12 utrwalonego i permeabilizowanego mikrogleju skutkuje wewnątrzkomórkowym obrazem perynuklearnym, który nie jest ograniczony do konkretnych organelli (Rysunek 3). Wyniki te stoją w sprzeczności z uzyskanymi przy użyciu przeciwciała anty-PSA IgG (klon 735) 26, które celuje w PSA-SynCAM w mikrogleju na poziomie aparatu Golgiego 41.
W przeciwieństwie do mikrogleju, HIgM12 i A2B5 celują w antygeny powierzchniowe komórek w silnie wzbogaconych kulturach OPC szczura w warunkach żywych komórek (Rycina 4). Kultury OPC zawierają ~ 5% zanieczyszczających komórek mikrogleju. Rycina 5 przedstawia niemal identyczny wzór barwienia powierzchni komórek dla HIgM12 i przeciwciała mAb anty-PSA (klon 2-2B) w astrocytach GFAP-dodatnich (Rycyna 5A). Barwienie immunofluorescencyjne WT astrocytów trawionych ENDO-NF w porównaniu z WT astrocytami traktowanymi buforem kontrolnym przy użyciu HIgM12 wykazuje obecność astrocytarnego PSA (Rycina 5B). Obecność astrocytów PSA-dodatnich in vivo wciąż wymaga potwierdzenia.
<img alt="Wynik immunoprecypitacji; Western blot wykazuje prążki białkowe; masy cząsteczkowe 39-204 kDa." src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: HIgM12 działa jako czynnik „wyciągający” (pull-down) w immunoprecypitacjach. Immunoprecypitacje z całkowitego lizatu mózgu trzymiesięcznych myszy z użyciem HIgM12, ludzkiej kontroli izotypowej HIgM126 lub wyłącznie kulek agarozowych L jako czynników „pull down”. Eluowane białka poddano analizie Western blot z użyciem membran inkubowanych z przeciwciałem HIgM12. Masa cząsteczkowa białek eluowanych z kulek powlekanych HIgM12 mieściła się w zakresie 160–20 kDa, oprócz ciężkiego łańcucha IgM (~ 65–73 kDa). Rysunek został zmodyfikowany z J. Neurochem.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot, nokaut NCAM za pomocą ENDONO, mózg. Prążki białkowe: HlgM12, PSA, β-aktyna." src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2: HIgM12 celuje w motyw kwasu polisjalowego (PSA) w białku NCAM. A. Homogenaty mózgowe myszy z całkowitym znokautowanym genem NCAM (total KO) oraz heterozygotyczne kontrolne myszy z miotu w wieku P7, P13, P16 i P27 poddano analizie Western blot; membrany inkubowano z przeciwciałami przeciwko HIgM12, PSA oraz β-aktynie jako kontroli ładunku. B. 10 µg lizatu mózgu dorosłej myszy WT w 1% NP40 w PBS, pH 6.5 poddano inkubacji przez noc w 37 ºC z endoneuraminidazą N (ENDO-N), (ekso)neuraminidazą o specyficzności wobec polimeru kwasu polisjalowego α2-3 (Sialidaza) lub PBS, a następnie analizowano w parach metodą Western blot, inkubując membrany z przeciwciałami przeciwko HIgM12, PSA oraz β-aktynie jako kontroli ładunku. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie J. Neurochem.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, IBA-1, HlgM12, PSA (2-2B), DAPI, komórki żywe i utrwalone, porównanie nałożonych obrazów." src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Brak PSA na mikrogleju szczura odzwierciedla brak oznakowania HIgM12. Mikroglię szczurzą hodowano przez 48 h na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną, a następnie znakowano albo na lodzie w warunkach żywych za pomocą HIgM12, albo po fiksacji za pomocą HIgM12 lub przeciwciała monoklonalnego anty-PSA (klon 2-2B). Komórki poddano potrójnemu znakowaniu z wykorzystaniem markera mikroglejowego IBA-1 (zielony), HIgM12/PSA (czerwony) oraz DAPI (niebieski). Obrazy wykazują brak wiązania HIgM12 z powierzchnią komórek mikrogleju (górny rząd) oraz brak wiązania anty-PSA (klon 2-2B) z powierzchnią komórkową i zapasami wewnątrzkomórkowymi w pierwotnej mikroglei szczurzej (dolny rząd). Na podstawie dwubiegunowej morfologii i braku barwienia IBA-1 zasugerowano, że mała komórka PSA-dodatnia (dolny rząd) jest OPC. W komórkach ufiksowanych barwienie HIgM12 dało punktowy obraz okołojądrowy, który nie był ograniczony do konkretnych organelli i uznano go za wiązanie niespecyficzne (środkowy rząd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej przedstawiające markery różnicowania komórkowego: A2B5, CD68, DAPI." src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: HIgM12 celuje w powierzchniowe PSA-NCAM na OPC szczura. Kultury OPC i mikroglei szczura hodowano przez 4 dni w pożywce proliferacyjnej na szkiełkach przedmiotowych pokrytych poli-D-lizyną, a następnie poddano potrójnemu znakowaniu żywych komórek w temperaturze 0°C przy użyciu przeciwciał HIgM12 lub A2B5 (zielony), wewnętrznego markera makrofagów/monocytów CD68 (klon ED-1) (czerwony) oraz DAPI (niebieski). Obrazy przedstawiają populacje komórek w przeważającej mierze pozytywne pod kątem markera OPC A2B5 (górny rząd) i HIgM12 (dolny rząd), z niewielką liczbą mikroglei pozytywnych pod kątem CD68 (~ 5%). Dodano obrazy w kontraście fazowym oraz DAPI, aby ukazać integralność komórek i liczebność poszczególnych populacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunobarwienie astrocytów; GFAP, HIgM12, PSA. Schemat; WT vs NCAM KO, bufor vs Endo-NF." src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: HIgM12 oraz przeciwciało monoklonalne przeciwko PSA wspólnie znakują subpopulację astrocytarną w mieszanych glejach myszy. A. Mieszane komórki glejowe myszy pochodzące od zwierząt WT oraz NCAM total KO, zawierające astrocyty, komórki linii oligodendrocytów oraz mikroglej, hodowano przez 3 dni, a następnie poddano barwieniu na żywo w lodzie z użyciem HIgM12 (zielony), przeciwciała monoklonalnego anty-PSA (klon 2-2B) (czerwony), a następnie markerem astrocytarnym GFAP (fioletowy) oraz DAPI (niebieski). HIgM12 i anty-PSA wykazują niemal identyczny wzorzec barwienia w przypadku GFAP-dodatnich astrocytów WT, lecz nie wiążą się z hodowanymi astrocytami myszy NCAM KO. Rysunek został zmodyfikowany z J. Neurochem.15. B. Mieszane gleje hodowano w sposób identyczny z opisanym w punkcie A. i inkubowano przez noc z endoneuraminidazą-NF (uprzejmie udostępnioną przez dr Martinę Muehlenhoff) lub kontrolnie z PBS. Komórki znakowano na żywo w temperaturze 0°C za pomocą HIgM12 (zielony), a następnie barwiono na markery wewnętrzne GFAP (czerwony) i DAPI (niebieski). HIgM12 wiąże antygeny powierzchniowe komórek w mieszanych kulturach glejowych traktowanych kontrolnie PBS, ale nie w mieszanych glejach traktowanych endoneuraminidazą-NF. Rycina została zmodyfikowana z JNSCI16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wszystkie obrazy zostały wykonane przy 60-krotnym powiększeniu z zastosowaniem tych samych ustawień urządzenia i przetworzone w identyczny sposób.
<img alt="Przepisy na bufory do western blotu i hodowli komórkowych, tabela, zastosowanie badawcze, komponenty metody." src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Składy buforów i roztworów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>tkanka OUN</td>
			<td>ENDO-NF/PBS</td>
			<td>Bufor lizujący</td>
			<td>Objętość całkowita</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. mysz WT</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl (12 µg) ENDO-NF</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Myszy typu dzikiego (WT)</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl PBS</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Myszy typu dzikiego (WT)</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>bez PBS lub ENDO-NF</td>
			<td>9.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. mysz z knockautem genu NCAM (NCAM KO)</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl (12 µg) ENDO-NF</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Mysz z nokautem genu NCAM (NCAM KO)</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>2 µl PBS</td>
			<td>7.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Myszy z nokautem genu NCAM (NCAM KO)</td>
			<td>67 µg (0.45 µl)</td>
			<td>bez PBS lub ENDO-NF</td>
			<td>9.55 µl</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Trawienie tkanki OUN myszy WT i NCAM KO w wieku P7 za pomocą ENDO-NF.

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja antygenów dla przeciwciał o potencjale terapeutycznym, ze szczególnym uwzględnieniem izotypu IgM. Metoda ta wypełnia lukę w wiedzy w dziedzinie biomedycznej i może pomóc w identyfikacji nowych biomarkerów oraz czynników immunoterapeutycznych w badaniach nad rakiem i chorobami ośrodkowego układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że otwiera ona drogę do zbadania zaniedbanej klasy przeciwciał o dużym potencjale terapeutycznym.Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę i leczenie wszystkich chorób, które mogą być celem terapeutyków opartych na przeciwciałach. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat antygenów przeciwciał IgM oraz hodowli tkankowych i subkultur. Może ona również być wykorzystana w odniesieniu do innych izotypów przeciwciał u wszystkich gatunków.Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie po zauważeniu specyficznego i wyraźnego wiązania przeciwciał IgM w różnych zastosowaniach biochemicznych. Procedurę zaprezentują Robert Kahoud i Jens Watzlawik. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj nacięcie na czaszce w przedniej części na wysokości uszu i odchyl fragment czaszki.Następnie delikatnie umieść mózg w probówce o pojemności 15 ml i natychmiast przechowuj go na suchym lodzie. Po pięciu minutach przenieś mózg na czystą papierową tackę wagową i szybko usuń móżdżek oraz pień mózgu, używając czystej żyletki. Następnie zważ zamrożony mózg przed ponownym przeniesieniem go do probówki 15 ml na lodzie.Dodaj lodowaty bufor lizujący do uzyskania końcowego stężenia 150 µg tkanki mózgowej na 1 µL buforu lizującego. Następnie zhomogenizuj mózg w buforze lizującym poprzez tryturację za pomocą końcówki do pipety 1 mL, a następnie za pomocą strzykawki 5 mL wyposażonej w igłę 27G. Po tym czasie inkubuj lizat mózgu przez kolejne 30 minut na lodzie, aby umożliwić całkowitą lizę tkanki.Po 30 minutach usuń detergent, materiały nierozpuszczalne i lipidy mózgowe poprzez centryfugację seryjną. Odrzuć osad zawierający mielinę i szczątki komórkowe, ale zachowaj nadsącz po każdym etapie centryfugacji. Podziel lizat mózgu na aliquoty i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza.W tym kroku należy przygotować 200 mililitrów buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer) z BSA oraz kolejne 200 mililitrów buforu do immunoprecypitacji bez BSA. W celu przeprowadzenia reakcji immunoprecypitacji należy przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny Protein L agarose do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Do probówki należy dodać jeden mililitr buforu do immunoprecypitacji z BSA.Następnie wymieszaj zawiesinę ręcznie poprzez odwracanie. Dalej, przemyj kuleczki Protein L agarose cztery razy poprzez wirowanie. Po tym usuń nadosad, nie naruszając osadu z agarozy, i powtórz procedurę płukania jeszcze trzy razy.Następnie do Protein L agarose dodaje się świeże BSA zawierające bufor IP i inkubuje przez noc na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do 800 µL buforu IP zawierającego BSA oraz 30 mg lizowanej tkanki mózgowej dodaje się 20 µg przeciwciała eksperymentalnego, przeciwciała kontrolnego lub PBS. 30 mg lizowanej tkanki mózgowej w lodowatym buforze IP z przeciwciałem IgM inkubuje się w probówce do mikrocentryfugi 1,5 mm przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia odwirować kulki agarozowe Protein L w wirówce laboratoryjnej. Odlać nadsącz, nie naruszając osadu agarozy. Następnie dodać schłodzony roztwór lizatu mózgu z przeciwciałem do agarozy Protein L.Inkubować zawiesinę przeciwciała-antygenu w agarozie Protein L przez dwie godziny na rollerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach przemyć kompleks przeciwciało-antygen związany z agarozą L poprzez wirowanie. Ostrożnie odlać supernatant, nie naruszając osadu, i dodać do niego jeden mililitr lodowatego buforu IP zawierającego 0,2% BSA.Powtórz etap płukania jeszcze raz, używając lodowatego buforu IP zawierającego 0,2% BSA, a następnie dwa kolejne razy, używając lodowatego buforu IP bez BSA. Następnie odwiruj kompleks przeciwciało-antygen przyczepiony do agarose L. Użyj pipety 200 µL, aby usunąć nadsącz, aż nad osadem z agarose Protein L pozostanie około 50 µL roztworu. Następnie użyj pipety 10 µL, aby całkowicie go usunąć.Wszystkie próbki należy przechowywać w lodzie. Następnie do każdej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml należy dodać 40 µl buforu do elucji IP. Probówkę należy lekko opukać palcem sześć razy, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze 95 °C.Następnie umieść próbkę na lodzie przez dwie minuty i odwiruj ją przez 30 sekund. Potem przenieś 35 µL supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu. Następnie potwierdź brak kulek agarozy z Proteiną L, spłukując niewielką ilość rozcieńczonej próbki przy wewnętrznej ściance probówki.Jeśli obecne są kulki agarozowe z Proteiną L, odwiruj próbkę przez kolejne 30 sekund przy 13 000 ×g i przenieś supernatant do czystej probówki. Powtarzaj ten krok, aż kulki agarozowe nie będą już widoczne. Następnie nałóż 10-20 µL rozcieńczonych próbek na każdą studzienkę żelu poliakrylamidowego SDS w systemie buforowym SDS tris-glicyna i prowadź elektroforezę przez około jedną godzinę przy napięciu 100 V na blacie, bez dodatkowego chłodzenia.Następnie przenieś białka na membranę PVDF. Transfer białek trwa dwie i pół godziny w pomieszczeniu chłodniczym przy napięciu 100 V z wykorzystaniem zimnego buforu do transferu. Zablokuj membranę, stosując 10% m/v proszku mleka odtłuszczonego w PBS-T przez jedną godzinę w temperaturze 25 °C na laboratoryjnym wstrząsarce orbitalnej.Przemyj membranę dwukrotnie przez 10 minut za każdym razem w PBS-T. Inkubuj membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym w 5% BSA w PBS-T. Inkubuj na wytrząsarce orbitalnej w chłodni przez noc.Następnego ranka przemyj membranę raz nadmiarem PBS-T w temperaturze 25°C, a następnie przemyj ją trzy razy PBS-T przez 10 minut każdy cykl na wytrząsarce orbitalnej. Następnie nanieś na membranę przeciwciało wtórne i 5% proszku mleka odtłuszczonego w PBS-T i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 25°C na wytrząsarce orbitalnej. Po tym czasie przemyj membranę raz nadmiarem PBS-T w temperaturze 25°C, a następnie przemyj ją trzy razy PBS-T przez 10 minut każdy cykl na wytrząsarce orbitalnej.Wymieszaj jeden mililitr schłodzonego substratu HRP do wzmocnionej chemiluminescencji, komponent A, z jednym mililitrem komponentu B w temperaturze 25 °C. Przełóż membranę na ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar cieczy. Następnie osusz pojemnik ręcznikami papierowymi przed ponownym przełożeniem do niego membrany.Natychmiast dodaj dwa mililitry wcześniej przygotowanego substratu HRP do wzmocnionej chemiluminescencji na membranę i inkubuj ją przez dwie minuty w temperaturze 25 °C. Co 20 sekund przechylaj ręcznie pojemnik, aby równomiernie zwilżyć membranę. Następnie przenieś membranę do przezroczystej plastikowej koperty i usuń nadmiar cieczy oraz pęcherzyki powietrza za pomocą ręczników papierowych.Przymocuj plastikową tulejkę do kasety za pomocą taśmy i zamknij ją. Rysunek ten pokazuje, że HigM12 immunoprecypituje swój antygen z lizatów mózgu oraz działa jako czynnik detekcyjny w analizach Western blot. Ani przeciwciało kontrolne izotypowe, ani kulki agarozowe L nie immunoprecypitują podobnego antygenu, co potwierdza specyficzność procesu pull-down.W niniejszym przypadku analizy Western blot z wykorzystaniem lizatów OUN myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem NCAM wykazują specyficzność wiązania HIgM do NCAM zawierającego PSA. Trawienie enzymatyczne tkanki OUN myszy typu dzikiego za pomocą ENDO-NF pozwala zidentyfikować PSA przyłączone do NCAM jako specyficzny epitop wiązania dla HIgM12. Stosując opisaną tutaj metodę, uzyskano wysokiej czystości hodowle mikrogleju szczurzego wykazujące pozytywny wynik dla IBA-1. W przeciwieństwie do mikrogleju, antygeny powierzchniowe komórek będące celami dla HIgM12 i A2B5 były silnie wzbogacone w hodowlach OPC szczura w warunkach żywych komórek.Po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 13 godzin roboczych. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak Biacore lub technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego, aby określić powinowactwa wiązania przeciwciał oraz stałe asocjacji i dysocjacji. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie onkologii, immunoterapii i naturalnych autoprzeciwciał do identyfikacji epitopów węglowodanowych na białkach pełniących rolę antygenów dla terapeutycznych przeciwciał IgM u ludzi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować antygeny glikoproteinowe w pracach badawczych z wykorzystaniem ludzkich przeciwciał IgM. Uzyskane dane wskazują na nowy cel terapii SM. PSA ENCAP, opracowana przez nas metoda leczenia przeciwciałami, jest jedną z pierwszych, która wykazała poprawę funkcjonalną w klatce aktywności z zastosowaniem rygorystycznego modelu naśladującego przebieg choroby podobnej do stwardnienia rozsianego.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji bispecyficznego przeciwciała GPC3-S-Fab w Escherichia coli. Oczyszczony GPC3-S-Fab ma silną cytotoksyczność wobec komórek raka wątroby GPC3-dodatnich.

Bispecyficzne przeciwciało ukierunkowane na GPC3, GPC3-S-Fab, o silnej cytotoksyczności

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Tutaj opisana jest metoda określania powinowactwa (KD) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów. KD jest stałą dysocjacji równowagi, którą można wyznaczyć na podstawie eksperymentu wiązania nasycenia, mierząc całkowite, specyficzne i niespecyficzne wiązanie przeciwciała znakowanego radioaktywnie w różnych stężeniach z jego antygenem.

Określanie powinowactwa wiązania (KD) przeciwciał znakowanych radioaktywnie do unieruchomionych antygenów

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj metodę identyfikacji antygenów dla przeciwciał IgM z potencjałem terapeutycznym w badaniach nad nowotworami i chorobami układu nerwowego. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych biomarkerów i celów terapeutycznych.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku (Wideo) | JoVE Journal

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Przeglądaj więcej filmów