Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja antygenów dla przeciwciał o potencjale terapeutycznym, ze szczególnym uwzględnieniem izotypu IgM. Metoda ta wypełnia lukę w wiedzy w dziedzinie biomedycyny i może pomóc w identyfikacji nowych biomarkerów i środków immunoterapeutycznych do badań nad nowotworami i chorobami ośrodkowego układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że otwiera ona drzwi do zaniedbanej klasy przeciwciał o dużym potencjale terapeutycznym.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania i leczenia wszystkich chorób, które mogą być celem terapii opartej na przeciwciałach. To może dostarczyć informacji na temat antygenów przeciwciał IgM oraz rosnących tkanek i subkultur. Może być również zarazą dla innych izotypów przeciwciał ze wszystkich gatunków.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zdałem sobie sprawę ze specyficznego i wyraźnego wiązania przeciwciała IgM w różnych zastosowaniach biochemicznych. Procedurę zademonstrują Robert Kahoud i Jens Watzlawik. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj nacięcie na czaszce w kierunku przodu na poziomie ucha i oderwij czaszkę.

Następnie delikatnie umieść mózg w 15-mililitrowej tubie i natychmiast przechowuj go na suchym lodzie. Po pięciu minutach przenieś mózg na czystą papier wagowy i szybko usuń móżdżek i pień mózgu za pomocą czystej żyletki. Następnie zważ zamrożony mózg przed przeniesieniem go z powrotem do 15-mililitrowej rurki na lodzie.

Dodaj lodowaty bufor do lizy do końcowego stężenia 150 mikrogramów tkanki mózgowej na mikrolitr buforu do lizy. Następnie homogenizuj mózg w buforze do lizy przez rozcieranie przez jednomililitrową końcówkę pipety, a następnie rozcieranie za pomocą pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27. Następnie inkubuj lizat mózgu przez dodatkowe 30 minut na lodzie, aby umożliwić całkowitą lizę tkanek.

Po 30 minutach usuń detergent, nierozpuszczalny materiał i lipidy mózgowe do seryjnego wirowania. Wyrzucić mielinę i resztki komórek zawierające osad, ale zachować supernatant po każdym etapie wirowania. Porcjuj lizat mózgu i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

W tym kroku przygotuj 200 mililitrów bufora IP z BSA i kolejne 200 mililitrów bufora IP bez BSA. W przypadku reakcji immunoprecypitacji przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny agarozy Protein L do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj jeden mililitr buforu IP z BSA do probówki.

Następnie wymieszaj go ręcznie przez odwrócenie. Następnie umyj kulki agarozy Protein L czterokrotnie przez odwirowanie. Następnie usuń supernatant bez naruszania osadu agarozy i powtórz procedurę mycia jeszcze trzy razy.

Następnie dodać świeży bufor BSA zawierający IP do białka L agarozy i inkubować go przez noc na walcu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W 800 mikrolitrach buforu IP zawierającego BSA i 30 miligramów lizowanej tkanki mózgowej dodaj 20 mikrogramów przeciwciała eksperymentalnego, przeciwciała kontrolnego lub PBS. Inkubować 30 miligramów zlizowanej tkanki mózgowej w lodowatym buforze IP z przeciwciałem IgM w 1,5-milimetrowej probówce mikrowirówkowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia odwiruj kulki agarozy Protein L w wirówce stołowej. Odrzucić sklarowany osad, nie naruszając osadu agarozy. Następnie dodaj schłodzony roztwór lizatu mózgu przeciwciała do białka L agarozy.

Inkubować antygen przeciwciała, zawiesinę białka L agarozy przez dwie godziny na walce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach przemyć kompleks antygenu przeciwciał przyłączony do agarozy L przez odwirowanie. Ostrożnie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i dodać do niego jeden mililitr lodowatego bufora IP zawierającego 0,2% BSA.

Powtórz krok mycia jeszcze raz, używając lodowatego bufora IP zawierającego 0,2% BSA i dwa dodatkowe razy, używając lodowatego bufora IP bez BSA. Następnie odwiruj kompleks antygenu przeciwciała przyłączony do agarozy L. Użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyrzucić supernatant, aż około 50 mikrolitrów roztworu pozostanie na wierzchu na wierzchu granulki agarozy Protein L. Następnie użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby całkowicie go usunąć.

Przechowywać wszystkie próbki na lodzie. Następnie dodaj 40 mikrolitrów buforu elucyjnego IP do każdej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Przesuń palcem rurkę sześć razy i podgrzewaj ją przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Następnie umieść próbkę na lodzie na dwie minuty i obracaj ją przez 30 sekund. Następnie przenieś 35 mikrolitrów supernatantu do świeżej 1,5-milimetrowej probówki do mikrowirówki, nie naruszając osadu. Następnie potwierdź brak kulek agarozy Protein L, spłukując niewielką ilość rozcieńczonej próbki na ściance rurki wewnętrznej.

Jeśli obecne są kulki białka L agarozy, odwirowywać próbkę przez kolejne 30 sekund z prędkością 13 000 g i przenieść supernatant do czystej probówki. Powtarzaj ten krok, aż nie będą wykrywalne żadne kulki agarozy. Następnie załaduj 10-20 mikrolitrów rozcieńczonych próbek na studzienkę na żel poliakrylamidowy SDS i system buforowy SDS tris-glicyny i uruchom żel na około godzinę przy napięciu 100 woltów na stole bez dodatkowego chłodzenia.

Następnie przenieś białka do membrany PVDF. Białka są przenoszone przez dwie i pół godziny w chłodni pod napięciem 100 woltów za pomocą buforu do przenoszenia na zimno. Zablokuj membranę suchym mlekiem w proszku o masie 10% na objętość w PBS-T na jedną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na stołowej wytrząsarce orbitalnej.

Umyj go dwa razy przez 10 minut za każdym razem za pomocą PBS-T. Sondować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem w 5% BSA w PBS-T. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w chłodni przez noc.

Następnego ranka przemyj membranę raz nadmiarem PBS-T w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnie trzy przepłucz PBS-T przez 10 minut każde na wytrząsarce orbitalnej. Następnie dodaj przeciwciało wtórne i 5% suchego mleka w proszku w PBS-T do membrany i inkubuj przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej. Następnie przemyj membranę raz nadmiarem PBS-T w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnie trzy razy przepłucz PBS-T przez 10 minut każde na wytrząsarce orbitalnej.

Wymieszaj jeden mililitr schłodzonego, wzmocnionego chemiluminescencyjnego substratu HRP składnika A z jednym mililitrem składnika B w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przenieś membranę na ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie osusz pojemnik ręcznikami papierowymi przed ponownym przeniesieniem do niego membrany.

Natychmiast dodaj dwa mililitry wstępnie zmieszanego substratu HRP o wzmocnionej chemiluminescencji HRP do membrany i inkubuj go przez dwie minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przechylaj pojemnik ręcznie co 20 sekund, aby równomiernie zwilżyć membranę. Następnie przenieś membranę do przezroczystego plastikowego rękawa i usuń nadmiar płynu i pęcherzyków powietrza ręcznikami papierowymi.

Przyklej plastikową tuleję do kasety i zamknij ją. Rysunek ten pokazuje, że HigM12 immunoprecypituje swój antygen z lizatów mózgowych mózgu i działa jako środek wykrywający w zachodnich plamach. Ani przeciwciało kontrolne izotypu, ani kulki L agarozy nie wytrącają immunologicznie podobnego antygenu, co świadczy o swoistości ściągania w dół.

W tym przypadku Western blot przy użyciu lizatów OUN od myszy typu dzikiego i myszy z nokautem NCAM wykazują specyficzność wiązania HIgM z PSA zawierającym NCAM'Enzymatyczne trawienie tkanki OUN od myszy typu dzikiego przy użyciu ENDO-NF identyfikuje PSA przyłączone do NCAM jako specyficzny apitop wiążący dla HIgM12. Stosując metodę opisaną w niniejszym dokumencie, uzyskuje się IBA-1-dodatnie hodowle mikrogleju szczurów o wysokiej czystości. W przeciwieństwie do mikrogleju, antygeny powierzchniowe komórek docelowych HIgM12 i A2B5 były wysoce wzbogacone w hodowlach OPC szczurów w warunkach żywych komórek.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 13 godzin roboczych. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak Biacore lub technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego, w celu identyfikacji powinowactwa przeciwciał do stałej asocjacji i asocjacji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem, immunoterapiami i naturalnymi autoprzeciwciałami do identyfikacji apitopów węglowodanowych na podobnych białkach jako antygenów dla terapeutycznych przeciwciał IgM u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować antygeny glikoproteinowe do prac badawczych zawierających ludzkie przeciwciała IgM. Dane te wskazują na nowy cel terapii stwardnienia rozsianego. PSA ENCAP, opracowana przez nas terapia przeciwciałami, jest jedną z pierwszych, która wykazała poprawę funkcjonalną w pudełku aktywności przy użyciu rygorystycznego modelu, który jest w chorobie i dewaluuje chorobę podobną do stwardnienia rozsianego.