Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest poprawa efektywności wytwarzania zmutowanego wirusa krowianki poprzez zastosowanie technologii CRISPR-Cas9. Metoda ta może pomóc w tworzeniu nowych wektorów wirusa krowianki do badań biologicznych i medycznych, w szczególności do terapii genowej i szczepień. Demonstracja wirusa za pomocą tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ identyfikacja i wychwycenie dodatnich blaszek jest trudne do wykonania.

Główną zaletą tej techniki jest to, że radykalnie poprawia skuteczność w tworzeniu naszego mutanta wirusa krowianki. Zaczynając od zebranych komórek CV-1, dostosuj ich stężenie do 100 000 komórek na mililitr. Następnie wysiewaj dwa mililitry zawiesiny do każdego dołka sześciodołkowej płytki w celu transfekcji.

Następnego dnia należy przetransfekować komórki 0,5 nanograma plazmidu gRNA-N2 i 0,5 nanograma plazmidu pSTCas9. Następnie inkubuj je przez 24 godziny. 24 godziny później wymień pożywkę.

Następnie przygotuj wirusa VVL15. Rozcieńczyć wirusa szkieletu VVL15 za pomocą DMEM do 200 000 PFU na mililitr. Następnie dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki transfekowanych komórek CV-1.

Dwie godziny później przetransfekuj komórki jednym mikrogramem wektora dawcy wahadłowego w celu ekspresji HR i inkubuj komórki przez 24 godziny. Następnego dnia odłącz transfekowane komórki CV-1 za pomocą skrobaka do komórek. Następnie zbierz zawiesinę komórek do kriowialnego i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Aby rozpocząć pierwszą rundę oczyszczania zmodyfikowanego VV, wysiewaj 15 sześciodołkowych płytek z 300 000 niezmodyfikowanych komórek CV-1 na dołek. Następnego dnia rozmrażaj zamrożoną zawiesinę transfekowanych komórek CV-1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie energicznie wiruj zawiesinę przez 30 sekund, aby zlizować komórki. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr lizatu trzema mililitrami DMEM.

Dodać pół mililitra tego rozcieńczenia do każdej płytki z niezmodyfikowanymi komórkami CV-1. Następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze na dwa dni. Dwa dni później zidentyfikuj blaszki RFP-dodatnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Można je dostrzec za pomocą obiektywu 10X. Po ich zidentyfikowaniu dokładnie oznacz tabliczki pod tabliczką za pomocą markera. Teraz przygotuj kriowial zawierający 200 mikrolitrów DMEM bez surowicy dla każdej dodatniej płytki nazębnej, która ma zostać zebrana.

Następnie ważne jest, aby zassać całe podłoże ze studzienek za pomocą oznaczonych blaszek. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, zestaw do zasysania 30 mikrolitrów, częściowo załaduj pipetę 10 mikrolitrami pożywki z kriowialu, a następnie zeskrob płytkę nazębną i wyciągnij komórki z pozostałą aspiracją. Wyrzuć to do kriowialu i powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy, celując w tę samą płytkę RFP-dodatnią, aby zebrać jak najwięcej komórek.

Przechowuj kolekcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub, jeśli druga runda oczyszczania ma być wykonana natychmiast, zamroź kriowiale na suchym lodzie na 10 minut. Druga runda oczyszczania zmodyfikowanego VV jest wykonywana tak samo jak pierwsza przy użyciu zamrożonych komórek z pierwszej rundy. Jednak dla każdej linii z dodatnim zapytaniem ofertowym można wybrać więcej niż sześć tabliczek z dodatnim wynikiem zapytania ofertowego.

Powtarzaj proces selekcji, aż wszystkie blaszki utworzone z jednej dodatniej płytki będą dodatnie RFP, co oznacza, że tabliczka jest czysta, co może zająć dodatkowe trzy do pięciu rund. Dzień wcześniej przygotuj sześciościenną płytkę z pół milionem komórek CV-1 na studzienkę. Następnego dnia rozmrażaj zamrożoną oczyszczoną płytkę nazębną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Następnie energicznie wiruj płytkę nazębną przez 30 sekund, aby uzyskać lizat. Dodać cały lizat, w tym resztki komórek, do studzienki z komórkami CV-1 i inkubować płytkę przez trzy dni. Nie używaj pozostałych pięciu studzienek.

Codziennie sprawdzaj komórki pod mikroskopem. Gdy więcej niż połowa komórek wydaje się cytopatyczna, zbierz zainfekowane komórki. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie komórki były cytopatyczne.

Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki w 15-mililitrowej probówce z pożywką hodowlaną. Następnie granuluj komórki w wieku 300 g przez trzy minuty. Odrzuć supernatant i kontynuuj stosowanie PCR w celu sprawdzenia modyfikacji zmutowanego VV lub zamroź osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby zrobić to później.

Opisana metoda poprawia wydajność rekombinacji ponad 100-krotnie w porównaniu z konwencjonalnymi protokołami. Na przykład VV N1LG był przeznaczony do modyfikacji. Jak opisano, plazma eksprymująca Cas9 i gRNA specyficzne dla N1L były współtransfekowane do komórek CV-1 w celu zwiększenia ich skuteczności w rekombinacji homologicznej.

Jednego dnia po transfekcji RFP uległo ekspresji w komórkach CV-1. Następnie komórki CV-1 zostały zakażone całym lizatem z rekombinacji homologicznej. W komórkach CV-1 zaobserwowano zarówno blaszki RFP-dodatnie, jak i ujemne.

Zgodnie z protokołem oczyszczania uzyskano czysty rekombinant. Wszystkie blaszki po zakażeniu lizatem komórkowym pochodzącym z czystej płytki ze zmutowanym wirusem krowianki stanowiły sygnał RFP. Do weryfikacji delecji docelowego genu użyto PCR.

Zmodyfikowany wirus wykazał pozytywny sygnał dla RFP i brak sygnału dla N1L, w przeciwieństwie do nienaruszonej kontroli N1L. Wszystkie były dodatnie dla niedocelowego genu A52R. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko stworzyć nowy wektor wirusa krowianki.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie nauk biomedycznych do badania nowych wektorów wirusowych w opracowywaniu środków biologicznych do leczenia i zapobiegania nowotworom i chorobom zakaźnym.