Skuteczna metoda uzyskiwania odróżnicowanych komórek tłuszczowych

Ogólnym celem tej nowatorskiej metody hodowli komórkowej jest generowanie odróżnicowanych komórek tłuszczowych z większą wydajnością. Nasza metoda może pomóc naukowcom pracującym w dziedzinie medycyny regeneracyjnej odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące kilku procesów związanych z wytwarzaniem komórek adipogennych, osteogennych i chondrogennych. Ponieważ główną zaletą naszego protokołu hodowli komórkowej jest to, że poprawia on jakość komórek DEFAT, może on zostać zastosowany w najbliższej przyszłości w celu ulepszenia obecnych zastosowań w terapii komórkowej i inżynierii tkankowej.

Po przyniesieniu próbki podskórnej tkanki tłuszczowej pacjenta do laboratorium z sali operacyjnej, zważ tkankę i umieść jedno- lub dwugramową próbkę tkanki tłuszczowej w 15-mililitrowej probówce. Następnie umyj próbkę pięcioma mililitrami PBS, a następnie przenieś próbkę do 10-centymetrowego plastikowego naczynia. Usuń PBS.

Następnie dodaj 10 mililitrów sterylnej kolagenazy o masie 0,1% na objętość do naczynia zawierającego próbkę. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych zmiel tkankę, aż osiągnie puree z puree. Przenieś zmieloną tkankę i roztwór kolagenazy do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i trawić w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 60 obr./min.

Po mineralizacji przefiltrować strawioną próbkę przez filtr o średnicy 100 mikronów do świeżej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie przepuść przez filtr 10 mililitrów pożywki hodowlanej DEFAT uzupełnionej o 2% FBS. Aby wyizolować komórki tłuszczowe z zawiesiny komórkowej, najpierw odwiruj przefiltrowane komórki z prędkością 100 razy g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Podczas wirowania przygotuj pięć mililitrów DCM uzupełnionych 2% FBS w 15-mililitrowej probówce. Następnie za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów należy pobrać pływające komórki tłuszczowe z odwirowanej probówki i dodać komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę. Delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać pożywkę DCM z komórkami.

Następnie odwirować probówkę o sile 100 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu użyj igły o rozmiarze 18 G i strzykawki o pojemności 20 mililitrów, aby usunąć pożywkę z dna probówki. Następnie dodaj do komórek 10 mililitrów DCM uzupełnionego 2% FBS i wymieszaj, delikatnie potrząsając probówką.

Ponownie odwirować komórki w temperaturze 100 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć powlekanie, dodaj 41 mililitrów DCM lub DMEM uzupełnionych 20% FBS do kolby o średnicy 12,5 centymetra. Następnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów pobrać 40 mikrolitrów komórek tłuszczowych i dodać je do kolby.

Następnie napełnij kolbę DCM lub DMEM uzupełnionym 20% FBS. Bardzo ważne jest, aby komórki były rozproszone w pożywce. Umieścić kolbę na pokrywie okrągłej szalki Petriego, aby była płaska.

Na koniec umieść kolbę w inkubatorze ustawionym na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją w spokoju na siedem dni. Po tygodniu inkubacji odwróć kolbę i sprawdź, czy nie ma odróżnicowanych komórek tłuszczowych. Następnie odessać pożywkę, a następnie dodać do kolby pięć mililitrów DCM lub DMEM uzupełnionego 20% FBS.

Pozwól komórkom DEFAT rosnąć przez kolejny tydzień po zmianie pożywki. Po tygodniu użyj licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek DEFAT wygenerowanych w różnych warunkach hodowli komórek. Ten obraz przedstawia kolonie komórek DEFAT po 14 dniach hodowli w DMEM.

Tutaj komórki DEFAT są pokazane po 14 dniach hodowli w DCM. W każdym przypadku podziałka reprezentuje 200 mikronów. Proliferację komórek DEFAT określono ilościowo za pomocą licznika komórek, a następnie porównano skuteczność DCM i DMEM w generowaniu komórek DEFAT.

Jak widać tutaj, zwiększoną proliferację komórek obserwuje się przy użyciu DCM. W tym przypadku ludzkie komórki DEFAT, wygenerowane przy użyciu DCM, hodowano przez trzy tygodnie w odpowiedniej pożywce indukcyjnej w celu oceny zdolności komórek DEFAT do reróżnicowania i różnicowania. Komórki były dodatnie pod względem zdolności osteogennej przez barwienie fosfatazą alkaliczną i barwienie czerwienią Alizaryn S. Wreszcie, zdolność adipogenną wykazano za pomocą barwienia czerwienią olejową O.

Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że kolagenaza z rudymentem i izolacja komórek tłuszczowych są wykonywane z najwyższą starannością, aby skutecznie generować wysokiej jakości komórki DEFAT. Dzięki tym wysiłkom nasza zwalidowana metoda hodowli komórkowych ma na celu ułatwienie zarówno obecnych, jak i przyszłych wysiłków badawczych w dziedzinie biologii rozwojowej i medycyny regeneracyjnej.