Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST
7 grudnia 2016
Opisana jest skuteczna i prosta metodologia komputerowej analizy zachowania nicieni podczas pływania w cieczy. Metoda ta wymaga niewielkich lub żadnych inwestycji dla laboratoriów C. elegans. Używany sprzęt jest standardowy, a oprogramowanie komputerowe do analizy behawioralnej (CeleST) jest oprogramowaniem typu open source.
Ogólnym celem tej metodologii jest ilościowa ocena zachowania pływackiego C.Elegans przy użyciu oprogramowania do widzenia komputerowego o nazwie CeleST, od C.Elegans Swim Test"Ta metoda analizy może pomóc w rozwiązaniu problemu wpływu mutacji genetycznych lub interwencji farmakologicznych na zachowanie pływackie C.elegans. Może również łatwo ocenić związany z wiekiem spadek zdolności lokomotyw. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wiele zwierząt może być śledzonych jednocześnie, przy czym różne aspekty postawy pływackiej są analizowane w celu uzyskania ośmiu parametrów zachowania podczas pływania oraz automatyczna ocena danych.
Zacznij od uzyskania mikroskopu stereoskopowego i cyfrowej kamery CCD, a także komputera z oprogramowaniem do cyfrowego nagrywania wideo i oprogramowaniem do widzenia komputerowego do analizy zachowania C.Elegans podczas pływania. W oprogramowaniu do cyfrowego nagrywania wideo skonfiguruj następujące ustawienia:Przykryj mikroskop ciemną szmatką, aby zapobiec odblaskom w obszarze kropli pływania na szkiełku mikroskopu i poprawić jakość obrazu. Dostosuj odległość roboczą i powiększenie mikroskopu, aby uzyskać pełny widok obszaru pływania, i wyreguluj lustro podstawowe, aby uzyskać ostry kontrast zwierząt na tle.
Następnie ustaw oświetlenie na ciemne pole, aby wizualizować ciała dorosłych jako białe na czarnym tle. Następnie odpipetuj 60 mikrolitrów 1 x bufor M9 do 10-milimetrowego pierścienia, wstępnie wydrukowanego na szkiełku mikroskopowym i upewnij się, że kropla całkowicie pokrywa wewnętrzną część pierścienia. Przenieś cztery dorosłe nicienie do kropli buforu 1 x M9, minimalizując transport bakterii, które mogą zmętnieć płyn.
Zminimalizuj ilość bakterii w studni pływackiej, pozwalając nicieniom na chwilę czołgać się po nieosadzonym obszarze płytki przed przeniesieniem lub lekko mieszając kąpiel, aby rozproszyć drobne ślady bakterii przed nagraniem. Następnie umieść szkiełko załadowane dorosłymi nicieniami na podstawie mikroskopu, aby zarejestrować ich zachowanie podczas pływania w cieczy w 30-sekundowych filmach. Aby nagrać, wybierz Nowa sekwencja w pamięci RAM pod nagłówkiem Strona główna, a następnie naciśnij czerwony przycisk nagrywania.
Na koniec, po zakończeniu nagrywania, kliknij nagłówek Strona główna i wybierz Eksportuj pełną sekwencję, aby podzielić wideo na sekwencję klatek obrazu. Zacznij od uruchomienia oprogramowania Computer Vision do analizy zachowania pływania C.elegans z Mat Lab, klikając przycisk Uruchom. Na ekranie głównym programu do analizy pływania użyj przycisków Dodaj jeden film"lub Dodaj wiele filmów", aby przesyłać sekwencje klatek obrazów pojedynczo lub w grupach, dołączając odpowiednie etykiety, takie jak genotyp, data, próba i czas trwania.
Następnie kliknij Przetwarzaj filmy", aby umożliwić jednoczesne śledzenie wielu zwierząt w przesłanych sekwencjach. Na nowym ekranie, który się pojawi, wybierz żądane filmy w lewym polu i kliknij Dodaj do listy"Następnie wyznacz strefę pływania, wybierając trzy punkty wewnątrz pierścienia i rozpocznij przetwarzanie, klikając Przetwarzaj wszystkie filmy wymienione powyżej. Wyświetlanie postępu przetwarzania wideo na środku u dołu ekranu.
Po zakończeniu zamknij ekran przetwarzania wideo. Zacznij od kliknięcia Miary obliczeniowe"aby otworzyć nowy ekran, na którym przetworzone filmy można przesyłać pojedynczo, aby zweryfikować lub odrzucić śledzenie pojedynczych zwierząt. Użyj tego kroku ręcznego, aby skupić się na obszarach pominiętego śledzenia, pokazanych w czerwonych blokach, i porównać je z pomyślnym śledzeniem odnotowanym w zielonych blokach.
Znajdź ważność podzielonej na segmenty treści"na pierwszym kolorowym pasku w poprzek ekranu w dolnej połowie. Zwróć uwagę, że odsetek prawidłowych ramek jest zaznaczony na zielono, a odsetek odrzuconych ramek jest na czerwono. Następnie nawiguj i modyfikuj bloki prawidłowych lub odrzuconych ramek, korzystając z następnego bloku, Przełącz ważność"Podziel blok"i Izoluj ramkę"opcje.
W rzadkich przypadkach, gdy dwa zwierzęta skrzyżują ścieżki w niezatłoczonej strefie pływania, zamień ich numery identyfikacyjne w określonym zakresie ramek za pomocą przycisku Przełącz". Na koniec kliknij Zapisz i oblicz miary"aby zapisać dane wejściowe ważności przed przesłaniem kolejnego przetworzonego filmu. Następnie wybierz Zamknij", aby wyjść z ekranu Miary obliczeniowe.
Należy pamiętać, że oprogramowanie oblicza mapy krzywizny wydajności pływania poszczególnych zwierząt w tle, a także osiem parametrów wskazanych później. Na ekranie głównym oprogramowania do przetwarzania obrazów kliknij opcję Wyświetl wyniki", aby uzyskać dane wyjściowe analizy. Następnie utwórz grupy próbek do obróbki statystycznej, zaznaczając żądane analizowane sekwencje ramek w lewym polu i przenosząc je do nowszej istniejącej grupy próbek, klikając przycisk Dodaj do wybranej próby"lub Dodaj do nowej próbki".
Kliknij Pokaż wykresy dla tych próbek", aby przejść do drugiego ekranu, który wyświetla wykresy i kluczowe statystyki próbek dla każdego z ośmiu parametrów według wyboru u góry ekranu. Następnie wybierz histogramy 2D", aby wykreślić kombinacje dowolnych dwóch parametrów za pomocą miary na osi X i zmierz na osi Y menu rozwijanych po lewej stronie ekranu. Kliknij Zamknij"aby wyjść i powrócić do ekranu Wyświetl wyniki".
Następnie wybierz przycisk eksportu w lewym górnym rogu ekranu, aby zapisać szczegółowe dane liczbowe jako plik csv do otwarcia i dalszej obróbki w programie arkusza kalkulacyjnego. Na koniec wybierz Zamknij"aby wyjść z ekranu Wyświetl wyniki"ekran i wróć do ekranu głównego. Kliknij przycisk Zakończ", aby zapewnić zapisanie bazy danych zawierającej analizowane sekwencje wideo.
Niektóre parametry pływania, takie jak szybkość inicjacji fal, wskaźnik aktywności, pociągnięcia pędzla i prędkość przemieszczania się stopniowo spadały wraz z wiekiem, nawet w korzystnym tle genetycznym. Z drugiej strony, liczba fal ciała, asymetria, rozciągliwość i parametry zwijania się wykazywały tendencję wzrostową wraz z wiekiem u dzikich i starzejących się zmutowanych dorosłych. Chociaż wszystkie nicienie zaczynają jako zdrowe dorosłe osobniki, niektóre szybko tracą sprawność fizyczną, podczas gdy inne utrzymują wigor przez dłuższy czas, co wskazuje, że osoby w złym wieku mają znacznie krótszy okres zdrowia niż osoby w podeszłym wieku.
Po opanowaniu analizy czterech pływających robaków można uzyskać w ciągu kilku minut. Obliczenia trwają około sześciu minut na film i można je wykonać zdalnie. Możliwe jest przetworzenie 250 zwierząt dziennie.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać filmy z prób pływania i przetwarzać dane, aby uzyskać ocenę lokomocji w cieczy.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prostą metodologię analizy zachowania pływackiego C. elegans przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania CeleST. Podejście to jest kosztowo efektywne i wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny, co czyni je dostępnym dla różnych warunków badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Genetyka
Wstęp
- C. elegans jest organizmem modelowym powszechnie wykorzystywanym w badaniach genetycznych i behawioralnych.
- Zrozumienie zachowań pływackich może dostarczyć wiedzy na temat wpływu mutacji genetycznych i interwencji farmakologicznych.
- Zmiany w zdolnościach lokomocyjnych związane z wiekiem mogą być oceniane ilościowo.
- Techniki komputerowego rozpoznawania obrazu zwiększają precyzję analizy behawioralnej.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowej oceny zachowania pływackiego C. elegans.
- Ocena wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie podczas pływania.
- Ułatwienie analizy związanego z wiekiem spadku sprawności lokomocyjnej.
Wykorzystane metody
- Wykorzystanie stereomikroskopu i cyfrowej kamery CCD do rejestracji wideo.
- Zastosowanie oprogramowania CeleST do śledzenia i analizy zachowań pływackich.
- Rejestracja zachowań pływackich w kontrolowanym środowisku przy minimalnych zakłóceniach bakteryjnych.
- Przetwarzanie danych wideo w celu wyodrębnienia kluczowych parametrów behawioralnych i przeprowadzenia analiz statystycznych.
Główne wyniki
- Możliwe jest jednoczesne śledzenie wielu osobników C. elegans, co pozwala na przeprowadzenie kompleksowej analizy.
- Zaobserwowano związane z wiekiem spadki w określonych parametrach pływania.
- Niektóre nicienie zachowały sprawność fizyczną dłużej niż inne, co wskazuje na zmienność procesu starzenia się.
- Metoda ta umożliwia szybką analizę zachowań pływackich, zwiększając efektywność badań.
Wnioski
- Oprogramowanie CeleST stanowi niezawodną platformę do analizy zachowań pływackich C. elegans.
- Metodyka ta może w znacznym stopniu przyczynić się do badań nad genetyką i procesami starzenia.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać to podejście do zgłębiania dalszych kwestii behawioralnych i fizjologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana analiza zachowania pływackiego C. elegans umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie fenotypowe w celu odkrywania związków neuroaktywnych oraz walidacji celów terapeutycznych. Poprzez kwantyfikację parametrów lokomocji w cieczy, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku interwencji genetycznych i farmakologicznych w skalowalnym i powtarzalnym systemie modelowym. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania poprzez powiązanie wyników behawioralnych z funkcją obwodów neuronalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościową ocenę funkcji neuromięśniowych u mutantów genetycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez jednoczesne śledzenie ośmiu parametrów zachowania pływackiego u setek zwierząt.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję portfela związków poprzez identyfikację substancji, które modyfikują związany z wiekiem spadek zdolności lokomocyjnych.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów procesu poprzez ustandaryzowane wyznaczanie stref pływania i automatyczne śledzenie.
- Wyniki ilościowe: Generowanie map krzywizny oraz ośmiu parametrów opartych na postawie bez zastosowania progów odcięcia, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Skalowalność: Przetwarzanie 250 zwierząt na dobę przy wykorzystaniu obliczeń zdalnych, co pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Łączy fenotypy zachowań pływackich z modelami starzenia się i neurodegeneracji poprzez trendy parametrów związanych z wiekiem.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez utrzymanie spójnych odczytów behawioralnych w obrębie przepływów pracy.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnianie nowych fenotypów w dobrze scharakteryzowanych tłach genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – dostarczając ilościowych odczytów behawioralnych, które pozwalają na zrozumienie mechanizmów działania oraz priorytetyzację związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez zautomatyzowaną analizę postawy podczas pływania oraz dynamiki ruchu.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki jednoczesnemu śledzeniu wielu zwierząt i standaryzowanemu przetwarzaniu wideo.
- Analityka: Dostarcza wyniki statystyczne i kluczowe statystyki dla każdego z ośmiu parametrów, umożliwiając porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez dopasowanie biomarkerów związanych z wiekiem w trajektoriach spadku zdolności lokomozyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania do przesiewania behawioralnego w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji nerwowo-mięśniowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanej ocenie danych i minimalnej interwencji manualnej.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki wczesnej redukcji ryzyka fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: Optymalizacja priorytetów i decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o ilościowe progi zachowań pływaków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obsłudze oprogramowania do analizy obrazu (computer vision) oraz w pracy z C. elegans.
- Niezbędny jest stereomikroskop, cyfrowa kamera CCD oraz komputer z oprogramowaniem CeleST do przechwytywania i analizy wideo.
- Wymagana jest standaryzacja w obrębie zespołów w zakresie wyznaczania strefy pływania oraz etykietowania filmów pod kątem genotypu, daty, próby i czasu trwania.
- Konieczne jest uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy różnych systemach modelowych ze względu na poleganie na testach lokomocji w środowisku ciekłym.
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność minimalizacji zanieczyszczeń bakteryjnych w studniach do pływania w celu zachowania jakości obrazu.
