Name: Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę analizy zachowania pływackiego C. elegans przy użyciu oprogramowania CeleST. Technika umożliwia jednoczesne śledzenie wielu osobników i automatyczną ocenę ośmiu parametrów pływania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój CeleST był wspierany przez granty NIH R21AG027513 i U01AG045864. Dane i niektóre krótkie reprezentacje wideo są zaadaptowane z Restif et al. (2014)8, które zostały opublikowane na licencji Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Dziękujemy Ricardo Laranjeiro za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

1. Wzrost i postępowanie z nicieniami
<ol>
	<li>Hoduj C. elegans na standardowych płytkach Petriego zawierających NGM nakrapiany OP50-1 Escherichia coli jako źródło pożywienia1-3.</li>
	<li>Przechowuj kultury w inkubatorze, który utrzymuje żądaną temperaturę. C. elegans dobrze rośnie w temperaturze od 15 do 25 °C, przy czym standardową temperaturą wzrostu jest 20 °C. 
	UWAGA: Pływanie jest silnym fenotypem, jednak na wigor pływania mogą wpływać czynniki środowiskowe, w tym zanieczyszczenie talerzy i przegrzanie kultur i zjeżdżalni. Należy dołożyć wszelkich starań, aby utrzymać stabilne warunki.</li>
	<li>Użyj domowej roboty kilofa do nicieni wykonanego z platynowego drutu uszczelnionego płomieniem w szklanym pręcie, aby poradzić sobie z przenoszeniem pojedynczych zwierząt4.</li>
</ol>
2. Konfiguracja do analizy pływania
<ol>
	<li>Korzystaj ze zintegrowanego systemu składającego się z mikroskopu stereoskopowego, cyfrowej kamery CCD i oprogramowania do cyfrowego nagrywania wideo. Oprogramowanie CeleST może być używane na osobnym komputerze.
	<ol>
		<li>Przykryj mikroskop ciemną szmatką (np. filcem), aby zapobiec odblaskom w obszarze kropli pływania na szkiełku mikroskopu i poprawić jakość obrazu.</li>
		<li>Dostosuj odległość roboczą i powiększenie mikroskopu, aby uzyskać pełny widok obszaru pływania, a lustro podstawowe, aby uzyskać ostry kontrast zwierząt na tle. Ustaw oświetlenie na ciemne pole, aby wizualizować ciała dorosłych jako białe na czarnym tle, co bardzo dobrze sprawdza się w wizualizacji obliczeniowej i śledzeniu za pomocą oprogramowania do analizy pływania.</li>
		<li>Zadbaj o to, aby miejsce pracy, szkiełko mikroskopowe i kropla pływacka były bardzo czyste. Szczątki mogą zakłócać analizę, blokując swobodne pływanie dorosłych, a cienkie nitki włókien mogą być wykrywane jako nieporuszające się zwierzęta podczas śledzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt do analizy sprawności fizycznej w płynie
<ol>
	<li>Odpipetować 60 μl 1x bufor M9 do pierścienia o średnicy 10 mm wydrukowanego na szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że kropla całkowicie zakrywa wewnętrzną część pierścienia. Oprogramowanie wydobywa więcej informacji o pływaniu przy użyciu tego rozmiaru kropli zawartego na zjeżdżalni, niż w przypadku korzystania z płytek wielodołkowych.</li>
	<li>Zbieraj pojedyncze dorosłe nicienie i przenieś je do kropli 1x buforu M9, minimalizując transport bakterii, które mogą zmętnić płyn. Zminimalizuj bakterie, najpierw umieszczając zwierzęta do przeniesienia na stronę talerza, która nie zawiera dużo bakteryjnego trawnika, pozwalając im się czołgać, a następnie delikatnie podnosząc je.
	<ol>
		<li>Podczas przenoszenia nicieni do kropli należy użyć lunety sekcyjnej w pobliżu stacji analitycznej, aby skrócić czas pływania, co może wpłynąć na zachowanie zwierząt25.</li>
		<li>Umieść tylko 4 dorosłe osoby w kropli, jeśli poruszają się energicznie i często krzyżują ścieżki. Jako wskazówkę, aby zminimalizować nakładanie się pływaków (co zakłóca analizę obliczeniową), rozważ umieszczenie 4 zwierząt na kroplę, gdy są tak samo aktywne jak młode, zdrowe dorosłe WT i 5 zwierząt na kroplę, gdy są starsze i wykazują mniej wigoru. 
		UWAGA: Zdrowe nicienie WT instynktownie zaczynają pływać wkrótce po umieszczeniu w płynie. Za pomocą kilofa do nicieni delikatnie oddziel dorosłe osobniki w kropli, jeśli się zbijają.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza sprawności fizycznej w płynie — Nagranie wideo z pływania
<ol>
	<li>Umieść szkiełko załadowane dorosłymi osobnikami na podstawie mikroskopu, aby zarejestrować ich pływanie. Filmy z 30 sekund rejestrują szczegóły zachowania poszczególnych zwierząt w płynie (Wideo 1), a pobieranie próbek dużej liczby takich zapisów jest łatwe do zrealizowania, gdy jest wspomagane przez oprogramowanie CeleST8,26; jednak dłuższe okresy pływania mogą być idealne dla innych specyficznych badań behawioralnych25. Co ważne, upewnij się, że utrzymujesz to samo powiększenie we wszystkich nagraniach, ponieważ różnice w powiększeniu wpływają na analizę pływania i będą zniekształcać porównanie. 
	UWAGA: Te kroki mają charakter wskazówek dotyczących korzystania z oprogramowania do cyfrowego nagrywania wideo wymienionego w Tabeli materiałów; Oprogramowanie otwartego dostępu VirtualDub może zastąpić, chociaż tego nie testowaliśmy.
	<ol>
		<li>Użyj następujących ustawień jako wskazówek dla udanej analizy pływania: rozmiar obrazu 696 x 520 pikseli, rozdzielczość obrazu 0,02 mm/piksel i szybkość 18 klatek/s. Wersje tych ustawień o wyższej rozdzielczości mogą ułatwić śledzenie, ale nie wpłyną na miary obliczane przez program. 
		UWAGA: Strefa pływania zapewniona przez kroplę 60 μl bufora 1x M9 na szkiełku mikroskopowym nie ma dużej głębokości, co minimalizuje ruch pływania w górę i w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W Ustawieniach przejdź do "Nagrywanie", ustaw "Ogranicz rozmiar sekwencji" na "545 klatek na dysku". Pod tym samym nagłówkiem zaznacz pole "Użyj Menedżera nagrywania". Kliknij przycisk "Edytuj bieżący skrypt nagrania... ', a w sekcji "Polecenia" wybierz opcję "Chwyć ramkę", a następnie w sekcji "Warunki zatrzymania" wpisz "Zatrzymaj po godzinie 0:00:30.00".</li>
	<li>Aby nagrać, wybierz "Nowa sekwencja w pamięci RAM" pod nagłówkiem głównym, a następnie naciśnij czerwony przycisk "Nagraj". Oprogramowanie przechwyci 545 klatek w ciągu 30 s za pomocą aparatu cyfrowego i umieści je w pamięci RAM.</li>
</ol>
5. Analiza sprawności fizycznej w płynie — Leczenie wideo
<ol>
	<li>Podziel wideo na sekwencję klatek obrazu, klikając nagłówek główny i wybierając opcję "Eksportuj pełną sekwencję do..." w oprogramowaniu do nagrywania wideo. 
	UWAGA: Oprogramowanie do cyfrowego nagrywania wideo może zapisywać klatki jako .bmp, .jpg, .tif lub .png, z których wszystkie można odczytać za pomocą przedstawionego tutaj programu do analizy pływania. Należy pamiętać, że pliki .tif zajmują więcej miejsca na dysku, ale niektóre formaty, takie jak .jpg, mogą pogorszyć jakość obrazu.</li>
	<li>Uruchom program do analizy pływania z programu MATLAB, klikając przycisk uruchom.</li>
	<li>Na ekranie głównym programu do analizy pływania użyj przycisków "Dodaj jeden film" lub "Dodaj wiele filmów", aby przesłać sekwencje klatek obrazu pojedynczo lub w grupach, dołączając odpowiednie etykiety, takie jak genotyp, data, próba i czas trwania. Oprogramowanie tworzy bazę danych oznaczonych sekwencji.</li>
	<li>Włącz jednoczesne śledzenie wielu zwierząt w przesłanych sekwencjach, klikając "1. Przetwarzaj filmy". Na nowym ekranie wybierz żądane filmy w lewym polu i kliknij "Dodaj do listy". Dla każdego filmu kliknij jego nazwę na liście w prawym górnym rogu, aby wyświetlić pierwszy obraz filmu w prawym dolnym rogu. Wyznacz strefę pływania, wybierając 3 punkty wewnątrz pierścienia, i rozpocznij przetwarzanie, klikając "Przetwarzaj wszystkie filmy wymienione powyżej". Wyświetlanie postępu przetwarzania na środku u dołu.</li>
	<li>Po zakończeniu "Zamknij" ekran przetwarzania wideo.</li>
</ol>
6. Analiza sprawności fizycznej w płynie — Pomiar
<ol>
	<li>Kliknij na "2. Obliczenia mierzone", aby otworzyć nowy ekran, na którym przetworzone filmy mogą być przesyłane, pojedynczo, w celu sprawdzenia lub odrzucenia śledzenia pojedynczych zwierząt. Filmy, które zostały przetworzone, pojawią się na liście po lewej stronie, gdzie można kliknąć nazwę filmu, aby go przesłać.</li>
	<li>Użyj tego ręcznego kroku, aby skupić się na obszarach pominiętego śledzenia (czerwone bloki), w przeciwieństwie do udanego śledzenia (zielone bloki). 
	UWAGA: Alternatywnie można polegać na automatycznym wyprowadzeniu prawidłowego śledzenia, ponieważ oprogramowanie ma solidny system śledzenia (94,1% trafności, jak zaobserwowano w 2,020 zwierzętach z 404 filmów8).
	<ol>
		<li>Znajdź "Ważność podzielonej na segmenty treści" na pierwszym kolorowym pasku w poprzek ekranu w dolnej połowie. Odsetek "Prawidłowych ramek" jest zaznaczony na zielono, a odsetek "Odrzuconych ramek" jest zaznaczony na czerwono. ≥80% prawidłowych klatek oznacza, że informacje o śledzeniu używane do obliczania miar pochodzą z co najmniej 432 z 540 klatek w 30-sekundowej próbie pływania zarejestrowanej z prędkością 18 klatek/s.</li>
		<li>Z łatwością nawiguj i modyfikuj bloki prawidłowych/odrzuconych ramek, korzystając z opcji "Następny blok", "Przełącz ważność", "Podziel blok" i "Izoluj ramkę". W rzadkich przypadkach, gdy 2 zwierzęta skrzyżują ścieżki w niezatłoczonej strefie pływania, zamień ich numery identyfikacyjne w określonym zakresie ramek za pomocą przycisku "Przełącz".</li>
		<li>Wyświetl wykresy słupkowe w dolnej połowie ekranu, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat śledzenia i nakładania się wyników. Długość podzielonego na segmenty ciała (długość ciała zwierzęcia na klatkę) koreluje z nakładającymi się częstościami występowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli jakiekolwiek jasne punkty na filmie zakłócają analizę, dostosuj jasne obszary w strefie pływania, wybierając funkcję "Strefy olśnienia".</li>
	<li>Kliknij "Zapisz i oblicz miary", aby zapisać dane wejściowe ważności przed przesłaniem kolejnego przetworzonego filmu. Na tym etapie oprogramowanie oblicza w tle (nie pokazywane użytkownikowi) mapy krzywizn dotyczące pływania poszczególnych zwierząt oraz parametry wskazane poniżej (Wideo 2). 
	UWAGA: Mierzone parametry, na których się tutaj skupiamy, opisano w tabeli 1. Szybkość inicjacji fali, liczba fal ciała, asymetria, rozciąganie i zwijanie są obliczane na podstawie map krzywizny, które oprogramowanie oblicza dla zwierząt; Parametry Prędkość ruchu, Pociągnięcie pędzlem i Indeks aktywności nie są oparte na mapach krzywizn.</li>
	<li>Kliknij "Zamknij", aby wyjść z ekranu "Miary obliczeniowe".</li>
</ol>
7. Analiza sprawności fizycznej w płynie — wyniki
Uwaga: Oprogramowanie może raportować wiele pomiarów ruchu pływania, które obejmują od jawnych do bardzo subtelnych cech behawioralnych, które nie są łatwe do oceny wzrokowej (filmy 3 i 4). Tutaj nacisk kładziony jest na 8 parametrów, które zazwyczaj pokazują dobry zakres dynamiki: szybkość inicjacji fali, liczba fal ciała, asymetria, rozciąganie, curling, prędkość ruchu, pociągnięcie pędzlem i indeks aktywności.
<ol>
	<li>Na ekranie głównym programu kliknij "3. Wyświetl wyniki", aby uzyskać wyniki analizy.</li>
	<li>Utwórz grupy próbek do obróbki statystycznej, zaznaczając żądane analizowane sekwencje ramek w lewym polu i przenosząc je do nowej lub istniejącej grupy próby, klikając przycisk "Dodaj do wybranej próby" lub "Dodaj do nowej próby".</li>
	<li>Kliknij "Pokaż wykresy dla tych próbek", aby przejść do drugiego ekranu, który wyświetla wykresy i kluczowe statystyki próbek dla każdego z 8 parametrów według wyboru u góry ekranu.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby dostosuj reprezentację wykresów słupkowych w lewym górnym rogu ekranu za pomocą selektorów "Kolory", "# histogramów" i "# robaków".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj opcji "Histogramy 2D", aby wykreślić kombinacje dowolnych dwóch parametrów za pomocą menu rozwijanych "Zmierz na osi X" i "Zmierz na osi Y" po lewej stronie ekranu. Kliknij "Zamknij", aby wyjść i powrócić do ekranu "Wyświetl wyniki".</li>
	<li>Użyj przycisku "Eksportuj..." w lewym górnym rogu ekranu, aby zapisać szczegółowe dane liczbowe jako plik .csv celu otwarcia i dalszej obróbki w programie arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>"Zamknij" ekran "Wyświetl wyniki", aby wrócić do ekranu głównego i kliknij "Zakończ", aby zapewnić zapisanie bazy danych zawierającej analizowane sekwencje wideo.</li>
</ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans">http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans</a> (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASI+regulates+satiety+quiescence+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ASI regulates satiety quiescence in C. elegans.</a> J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).</li>
<li>Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dictionary+of+behavioral+motifs+reveals+clusters+of+genes+affecting+Caenorhabditis+elegans+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).</li>
<li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li>
<li>Restif, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeleST%3A+computer+vision+software+for+quantitative+analysis+of+C.+elegans+swim+behavior+reveals+novel+features+of+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion.</a> PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702(2014).</li>
<li>Ibanez-Ventoso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+microRNA+expression+during+adult+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).</li>
<li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat Commun. 6, 8919(2015).</li>
<li>Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+by+machine+vision+of+the+rate+of+motor+activity+decline+as+a+lifespan+predictor+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans.</a> Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aging+in+the+nervous+system+contributes+to+age-dependent+motor+activity+decline+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans.</a> Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).</li>
<li>Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+spectrofluorimetry+reveals+endogenous+biomarkers+that+report+healthspan+and+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li>
<li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li>
<li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Track-a-worm%2C+an+open-source+system+for+quantitative+assessment+of+C.+elegans+locomotory+and+bending+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior.</a> PLoS One. 8 (7), e69653(2013).</li>
<li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> J Vis Exp. (69), e4094(2012).</li>
<li>Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+approach+for+simultaneous+tracking+and+feature+extraction+of+C.+elegans+populations+in+fluid+environments%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).</li>
<li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).</li>
<li>Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+behavioral+decline+in+Caenorhabditis+elegans+with+the+Rag+GTPase+raga-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1.</a> PLoS Genet. 6 (5), e1000972(2010).</li>
<li>Fang-Yen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+analysis+of+gait+adaptation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).</li>
<li>Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput%2C+motility+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+and+parasitic+nematodes%3A+Applications+in+the+search+for+new+anthelmintics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).</li>
<li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+C.+elegans+swimming+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%222011+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%3A+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).</li>
<li>Friedman, D. B., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+age-1+gene+in+Caenorhabditis+elegans+lengthens+life+and+reduces+hermaphrodite+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility.</a> Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).</li>
<li>Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+mutants%2C+selective+breeding%2C+and+transgenics+in+the+dissection+of+aging+processes+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans.</a> Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).</li>
<li>Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidylinositol-3-OH+kinase+family+member+regulating+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).</li>
<li>Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16%3A+An+HNF-3%2Fforkhead+family+member+that+can+function+to+double+the+life-span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans.</a> Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).</li>
<li>Ogg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fork+head+transcription+factor+DAF-16+transduces+insulin-like+metabolic+and+longevity+signals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans.</a> Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).</li>
<li>Ziv, E., Hu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+insulin%2FIGF-1+signaling+pathways+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity.</a> Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).</li>
<li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li>
<li>Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network.</a> PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066(2011).</li>
<li>Jarrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+connectome+of+a+decision-making+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The connectome of a decision-making neural network.</a> Science. 337 (6093), 437-444 (2012).</li>
<li>Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+segmentation+using+texture-based+models+for+motility+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie C. elegans jako systemu modelowego stale rośnie ze względu na jego plastyczność genetyczną, wykonalność eksperymentalną i anatomię opisaną z najdrobniejszymi szczegółami. Na przykład, struktura neuronalna i łączność hermafrodyty C. elegans jest wyraźnie odwzorowana34-36, co znacznie ułatwia badania określonych obwodów neuronalnych, które kontrolują określone zachowania. 302 neurony stanowią układ nerwowy dorosłego hermafrodyty, który przetwarza szeroki zakres bodźców sensorycznych na podstawowe wyjścia behawioralne, takie jak lokomocja. Opisano również strukturę bardziej złożonego męskiego układu nerwowego37, co umożliwia zajęcie się obwodami specyficznymi dla płci. 37
Zachowanie C. elegans zostało szeroko zbadane na standardowych płytkach hodowlanych zawierających pożywki stałe. Ponieważ WT C. elegans porusza się w przewidywalnych falach sinusoidalnych na płytkach wypełnionych agarem, odchylenia od ogólnego wzorca mogą być wykrywane wzrokowo i oceniane ręcznie. Takie podejście podlega jednak kryterium eksperymentatora i jest pracochłonne. Narzędzia sprzętowe i programowe zaprojektowane do śledzenia i pomiaru lokomocji C. elegans na podłożach stałych eliminują stronniczość subiektywności i pozwalają na badania na dużą skalę, umożliwiając rozwiązywanie bardziej wyrafinowanych problemów biologicznych. Najnowsza behawioralna baza danych stworzona przez laboratorium Schafera16 jest doskonałym przykładem analitycznego rozszerzenia i głębokości, które zostały osiągnięte dzięki systemowi obliczeniowemu do poruszania się na płytach.
Po umieszczeniu WT C. elegans w płynie zwierzę szybko dostosowuje swój ruch do nowego środowiska, inicjując pływanie. Pływanie C. elegans wykorzystuje większy zakres ruchu niż czołganie się i może być bardziej nieregularne8. Oprogramowanie takie jak CeleST ma na celu wypełnienie luki w szczegółowej analizie zachowania C. elegans w cieczy, umożliwiając ilościowe określenie parametrów związanych z ruchem, które nie są łatwo mierzone przez nieuzbrojone oko lub które można osiągnąć szybciej niż ręczna ocena. W ciągu 8 ciężkich godzin osoba może przetworzyć do 200 filmów, ~ 1,000 nagrań dziennie.
Oprogramowanie definiuje parametry oceny pływania, które służą jako kompleksowy odcisk palca sprawności fizycznej i zachowania. Oprócz wzbogacenia wiedzy na temat złożonych aspektów zachowania C. elegans w cieczach i leżących u ich podstaw szlaków molekularnych, oprogramowanie to może być wykorzystywane do badania wielu aspektów biologii, w tym reakcji farmakologicznych, starzenia się i odrębnego zachowania. Przedstawiony tutaj przegląd ilościowych zmian, które zachodzą w sprawności fizycznej dorosłych C. elegans wraz z wiekiem, jest jednym z przykładów takiego zastosowania oprogramowania (bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w Restif i wsp.8). W kontekście starzenia się niektóre mierzone parametry spadły, podczas gdy inne wzrosły lub nie zmieniały się konsekwentnie w typie dzikim. Tendencje te zostały w dużym stopniu potwierdzone przez profil obliczeniowy mutantów długowieczności oraz względne profile pełnych wdzięku i złych kohort populacji w tym samym wieku utrzymywanych w jednakowych warunkach środowiskowych. Wysoka rozdzielczość oprogramowania może również ujawnić subtelne fenotypy, które wcześniej nie były znane w szeroko scharakteryzowanych mutantach (np. wiek-1 (hx546) na rysunku 1).
Istnieje kilka szczególnie krytycznych kroków opisanego protokołu. Utrzymanie stałej temperatury między środowiskiem pływania a kulturą na płytce szczepowej jest ważne dla odtwarzalności pływania, dlatego eksperymentatorzy są gorąco zachęcani do dołożenia wszelkich starań, aby uniknąć przypadkowych zmian temperatury. Płyny do pływania powinny mieć tę samą temperaturę co płytki. Podobnie, zwrócenie szczególnej uwagi na wielkość kropli podczas pływania pomoże zapewnić powtarzalność. Wreszcie, rozsądnie jest pomyśleć z wyprzedzeniem o odciążeniu dużych plików wideo, które się gromadzą. Zaleca się przetwarzanie obrazów w witrynie poza komputerem do przechwytywania wideo.
Korzystanie z przedstawionego tutaj oprogramowania do analizy pływania ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, chociaż programy mogą jednocześnie śledzić wiele zwierząt, jeśli więcej niż pięć zwierząt jest analizowanych wspólnie, istnieje zwiększona szansa, że zwierzęta będą przepływać obok siebie na obrazach wideo. Gdy program nie może jednoznacznie określić, które zwierzę było które, cenzuruje te ramki danych. Chociaż ta funkcja programu zapewnia, że dane dotyczące poszczególnych zwierząt są wysokiej jakości, ogranicza przepustowość. Po drugie, obrazy powinny być dość czyste, to znaczy wolne od kurzu, smug i odblasków od światła, ponieważ powiązane sygnały mogą również zakłócić analizę obrazu. Jak zauważono w sekcji 2.1.1 protokołu, bardzo mało zaawansowaną technologicznie inwestycją, która może znacznie pomóc w przechwytywaniu obrazu poprzez wyeliminowanie komplikacji związanych z wahaniami oświetlenia otoczenia, jest pokrycie obszaru sceny ciemną tkaniną, która nie pozwala światłu otoczenia dotrzeć do sceny. Po trzecie, program jest zoptymalizowany pod kątem zwierząt w wieku dorosłym. Młode larwy pływają bardzo szybko i mają małe ciała, co zwiększa błąd programu. Po czwarte, część oprogramowania korzysta z MATLAB, a gdy są aktualizacje wersji i/lub aktualizacje systemu operacyjnego, niektóre łącza programów mogą zostać zakłócone. Obecnie oprogramowanie jest zoptymalizowane do użytku w MATLAB 2015b i Mac OS w wersji 10.10, ale spodziewamy się, że wkrótce opublikujemy wersję oprogramowania, która będzie bardziej odporna na takie zmiany. Wreszcie, pliki danych wideo mogą szybko stać się duże i wymagać przydzielenia miejsca na dysku.
Podsumowując, przedstawiona tutaj jest prosta metodologia, która może być łatwo wdrożona przez każde laboratorium bez większych inwestycji w tworzenie filmów z pływaniem C. elegans do analizy CeleST. Cechy pakietu oprogramowania obejmują rozbudowaną automatyzację od śledzenia po analizę, jednoczesne śledzenie wielu zwierząt oraz wykorzystanie podstaw matematycznych (tj. pomiarów krzywizny) do ilościowego określania większości parametrów lokomocji. Oprogramowanie jest open source, a kod i wersje demonstracyjne są publicznie dostępne, jak opisano w Restif et al.8. Chociaż program oferuje zaawansowaną komputerową analizę wizyjną do śledzenia, inne opublikowane systemy śledzenia (np. Greenblum i in., 201438) są kompatybilne z analizą parametrów przedstawionego tutaj oprogramowania. Przyszłe ulepszenia będą ukierunkowane na przekształcenie oprogramowania w bardziej solidny pakiet, który nie ogranicza użytkowania do określonych wersji systemów operacyjnych wymienionych powyżej (również wskazanych w Tabeli Materiałów).

Zdefiniowanie, w jaki sposób genetyka, epigenetyka, doświadczenie i środowisko wpływają na zachowanie, jest głównym wyzwaniem we współczesnej biologii. Proste, genetycznie podatne modele, które można śledzić i mierzyć obliczeniowo, mogą wnieść kluczowy wkład w osiągnięcie tego celu. Nicień Caenorhabditis elegans jest jednym z takich modeli. Celem tego artykułu jest pokazanie, w jaki sposób można śledzić i określać ilościowo lokomocję pływania C. elegans w celu uzyskania informacji na temat ośmiu nowych cech o znaczeniu biologicznym.
C. elegans ma stosunkowo krótką długość życia około 2 - 3 w i okres reprodukcji około 4 dni w temperaturze 20 °C1,2. W standardowych kulturach laboratoryjnych ten mikroskopijny nicień jest hodowany na płytkach Petriego zawierających pożywki wzrostu nicieni (NGM), które są przenoszone za pomocą bakteryjnego źródła pożywienia3,4. Zwierzęta WT N2 poruszają się aktywnie w eleganckich falach sinusoidalnych na płytkach wypełnionych agarem; Zmieniają tempo poruszania się podczas wędrowania (poszukiwanie pożywienia), przebywania (przeglądanie) lub regeneracji po posiłku (spoczynek sytości nieaktywnej)5. Upośledzenie6 lub wiek7-12 lat może również radykalnie zmienić ruch na talerzach.
Geny, które modulują zachowanie, zdrowie lub starzenie się, mogą być funkcjonalnie scharakteryzowane poprzez analizę wzorców ruchowych lub lokomocji C. elegans. Jednym z podejść do pomiaru długości zdrowia jest klasyfikacja starzejących się dorosłych na trzy kategorie (np. A, B i C) zgodnie z ich lokomocją, przy czym energiczna aktywność fizyczna należy do klasy A, a paraliż do klasyC 7,8,13. Chociaż takie jakościowe sortowanie jest przydatne do ujawnienia różnic w sprawności fizycznej, kategorie są szerokie bez wyraźnych granic, a zatem ich punktacja jest podatna na stronniczość eksperymentatora.
Rosnąca liczba trackerów podniosła obiektywność, wyrafinowanie i precyzję analizy ruchu C. elegans na stałym podłożu14-18. Poruszanie się C. elegans na płytkach jest w większości ograniczone do płaszczyzny, w której zwierzę styka się z twardą powierzchnią podłoża. (C. elegans może również indukować eksplorację poprzez odnoszenie głowy od reszty ciała, która nadal styka się z twardą powierzchnią, ustawiając ciało w wielu płaszczyznach. Jednak takie zachowanie jest niezwykłe.) Po umieszczeniu w płynie nicień ten inicjuje ruch falowy lub pływanie, który charakteryzuje się bardziej rozległymi ruchami wymiarowymi, większym zakresem prędkości i głębokości ruchu oraz zwiększoną częstością występowania z wiekiem ruchu przedniego i tylnego inaczej niż u zwierząt na twardych powierzchniach. W ramach szybkiej analizy sprawności fizycznej i reakcji na nowe środowisko, eksperymentator może umieścić pojedyncze zwierzę w kropli płynu i ocenić częstotliwość zgięć ciała pod lunetą sekcyjną. Nagrywanie wideo może ułatwić ocenę obecnego i przyszłego wigoru pływackiego zwierzęcia. Jednak podejście ręczne ogranicza liczbę cech, które można ocenić, i jest w pełni ograniczone do punktacji jednego zwierzęcia na raz.
Lokomocja w płynie była mniej badana niż lokomocja na stałych podłożach. Rzeczywiście, istnieje kilka opcji oprogramowania, które są solidne i łatwe do wdrożenia w laboratorium do pomiaru lokomocji w cieczy19-24. Oprogramowanie CeleST (C. elegans Swim Test) oferuje prostotę obsługi i pomiary matematyczne, które dostarczają danych (wyniki krzywizny) bezpośrednio związanych z naturą ruchu8; (szczegółowy opis cech i zalet w Restif i wsp.8). Ponadto analiza obliczeniowa umożliwia wyjaśnienie cech fenotypowych, które są niemożliwe do oceny przez ludzkie oko. W tym miejscu przedstawiono dane, które ilustrują rozwiązanie tego podejścia do analizy i opisano łatwy do wdrożenia protokół rejestrowania prób pływania do późniejszej analizy CeleST.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>C. elegans WT (przodek).</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Poziom bezpieczeństwa biologicznego: BSL-1.</td></tr><tr><td>OP50-1 Escherichia Coli&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Oporny na streptomycynę szczep OP50.&nbsp; Poziom bezpieczeństwa biologicznego: BSL-1.</td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Drukowane szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td><td></td><td>Mikroszkiełka fluorescencyjne przeciwciał Thermo Fisher Scientific Gold Seal: 3032-002</td><td>mają dwa wytrawione okręgi o średnicy 10 mm wyznaczone białym tuszem ceramicznym</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)</td><td>Na 1 l: 17 g agaru, 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu, 25 ml 1 M buforu KPO4, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 l. Sterylizować w autoklawie.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Utrzymanie C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>Bufor M9</td><td>Dla 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L. Sterylizować w autoklawie.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Utrzymanie C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CeleST</td><td>Driscoll Lab, Rutgers University<</td><td>em>C. elegans Test pływania</td><td>Open Source, patrz http://celestmod.github.io/CeleST/ i http://celest.mbb.rutgers.edu/</td></tr> <tr><td>MATLAB</td><td>www.mathworks.com/downloads</td><td>MatLab wersja 2015b (najlepsza)</td><td>Przedstawiona tutaj wersja CeleST ma najlepszą funkcjonalność z Mac OS 10.10 i MatLab 2015b. MATLAB 2015B wprowadził zmiany w sposobie obsługi grafiki przez MATLAB, w tym nową konwencję kodowania i składnię. Te zmiany rozwiązały problem, którego nie można było elegancko rozwiązać (głównie dlatego, że wnętrze MATLABa naprawdę wymagało gruntownego remontu grafiki zaimplementowanego w MATLAB 2015B). Z tego powodu CeleST powinien być zawsze uruchamiany na MATLAB 2015B lub nowszych wersjach. Jednak dla użytkowników bez dostępu do MATLAB w wersji 2015B lub nowszej (lub w ogóle MATLAB) stworzyliśmy program CeleST, który nie potrzebuje MATLABa na komputerze na w. Instalator jest pobierany przez potencjalnego użytkownika, a następnie instaluje się na komputerze za pomocą kilku monitów, jak większość programów. &nbsp;</td></tr><tr><td>Mac OS</td><td>www.apple.com</td><td>wersja 10.10</td><td>Obecnie CeleST został przeniesiony na główne systemy operacyjne (Windows, Mac i Linux). Bieżący kod może być uruchomiony na dowolnym z systemów operacyjnych i istnieją wersje dla każdego systemu operacyjnego, które nie wymagają nawet od użytkowników posiadania MATLABa do korzystania z CeleST (ta wersja wymaga dużego pobrania). Wersja dla systemu Windows została przetestowana w najmniejszym stopniu i jako taka jest najbardziej podatna na błędy. Linux został poddany umiarkowanym testom. A Mac był i nadal jest intensywnie testowany (przede wszystkim dlatego, że jest to system operacyjny w naszym laboratorium).</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty diagnostyczne</td> <td>do pomiaru światła przechodzącego</td><td>TLB 3.1</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do cyfrowego nagrywania wideo</td><td>Norpix</td><td>Streampix Version 3.17.2</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana analiza zachowania c. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania celest

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Analiza obwodów neuronalnych i nerwowo-mięśniowych, które regulują zachowanie, pozostaje głównym wyzwaniem w biologii. Nicień Caenorhabditis elegans okazał się nieocenionym organizmem modelowym, który pomaga stawić czoła temu wyzwaniu, począwszy od inspirujących podejść technologicznych, poprzez budowanie konektomu ludzkiego mózgu, aż po faktyczne rzucenie światła na konkretne czynniki molekularne odpowiedzialne za podstawowe wzorce funkcjonalne. Większość badań behawioralnych na C. elegans przeprowadzono na podłożach stałych. W cieczach zwierzęta wykazują wzorce zachowań, które obejmują ruch z różnymi prędkościami w 3D, a także częściowe ruchy ciała, takie jak tylne ugięcie bez zmiany kształtu przedniego, co wprowadza nowe wyzwania w zakresie oceny ilościowej. Poniżej przedstawiono etapy prostej procedury i zastosowania oprogramowania, które umożliwia analizę zachowania C. elegans podczas pływania w wysokiej rozdzielczości. Oprogramowanie o nazwie CeleST wykorzystuje specjalistyczny program komputerowy, który śledzi wiele zwierząt jednocześnie i zapewnia nowatorskie pomiary lokomocji C. elegans w cieczach (pływanie). Miary są w większości oparte na postawie zwierząt i opierają się na matematyce używanej w widzeniu komputerowym i rozpoznawaniu wzorców, bez wymagań obliczeniowych dotyczących wartości granicznych. Narzędzie programowe może być wykorzystywane zarówno do oceny ogólnej sprawności pływackiej setek zwierząt na podstawie połączonych prób w małych partiach, jak i do ujawniania nowych fenotypów nawet u dobrze scharakteryzowanych mutantów genetycznych. Przygotowanie próbek do analizy za pomocą CeleST jest proste i nieskomplikowane technicznie, co umożliwia szeroką adaptację przez społeczność naukową. Zastosowanie opisanego tu podejścia obliczeniowego powinno zatem przyczynić się do lepszego zrozumienia zachowania i obwodów behawioralnych w modelu C. elegans.

Dzięki analizie lokomocji w cieczy (pływania) można wyjaśnić fenotypy, które nie są łatwo zauważalne na podłożach stałych (pełzania). W celu ilościowego określenia lokomocji pływnej opracowaliśmy specjalistyczne oprogramowanie, które mierzy dziesięć nowych parametrów zachowania podczas pływania8. Osiem z tych parametrów, najbardziej użytecznych, zostało szczegółowo opisanych w Tabeli 1. Parametry te to: częstotliwość inicjacji fali (Wave initiation rate), liczba fal ciała (Body wave number), asymetria (Asymmetry), rozciągnięcie (Stretch), zwijanie (Curling), prędkość przemieszczania się (Travel speed), ruch pędzla (Brush stroke) oraz indeks aktywności (Activity index). Badania wykazujące skuteczność oprogramowania pozwoliły określić spadek funkcji u setek starzejących się osobników z genotypem WT, mutantami behawioralnymi lub mutantami długowieczności8, a także przeanalizować dobrze zbadane mutanty długowieczności age-1(hx546) oraz daƒ-16(mgDƒ50), które posiadają mutacje zaburzające prawidłową ścieżkę sygnalizacji insulinowej. Gen age-1 koduje podjednostkę katalityczną kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PIK3) i w przypadku wystąpienia mutacji hx546 powoduje wydłużenie czasu życia oraz odporność na stres27-29. Gen daƒ-16 koduje czynnik transkrypcyjny z rodziny forkhead box O (FOXO), którego delecja skraca czas życia i upośledza odpowiedź stresową30-33.
Niektóre parametry pływania, takie jak częstość inicjacji fal (Wave initiation rate), prędkość przemieszczania się (Travel speed), ruchy szczeczek (Brush stroke) oraz indeks aktywności (Activity index), stopniowo spadały wraz z wiekiem, nawet w sprzyjających liniach genetycznych (Rysunek 1). Zgodnie z aktualną wiedzą, długowieczne mutanty age-1(hx546) wykazywały wyższą sprawność fizyczną niż szczepy WT w wieku zaawansowanym i bardzo podeszłym. Zgodnie z przewidywaniami, krótkożyjące mutanty daƒ-16(mgDƒ50) wykazywały upośledzoną sprawność, szczególnie w bardzo podeszłym wieku. Co niezwykłe, dopiero dzięki zastosowaniu pakietu wizji komputerowej i algorytmów matematycznych CeleST można było wykryć lepszą sprawność pływania mutantów age-1(hx546) już na początku dorosłości. Fakt, że age-1(hx546) prowadzi do zwiększenia sprawności fizycznej w młodej dorosłości, sugeruje, że mutacja ta wpływa na prawidłowy rozwój i/lub fenotyp młodych osobników dorosłych w sposób, który nie był wcześniej dostrzeżony (Rysunek 1).
Parametry liczby fal ciała, asymetrii, rozciągania i zwijania wykazywały tendencję wzrostową wraz z wiekiem u osobników WT oraz dorosłych mutantów starzejących się (Rysunek 2). Co ciekawe, poziom rozdzielczości oprogramowania ujawnił subtelniejsze cechy behawioralne, takie jak utrzymująca się symetria mutantów age-1(hx546) przez cały okres ich życia oraz niezdolność bardzo starych mutantów daƒ-16(mgDƒ50) do rozciągania się i zwijania w takim stopniu, w jakim robią to osobniki WT i dorosłe mutanty age-1(hx546) w tym samym wieku.
Oprócz ogólnego i nieuniknionego spadku sprawności fizycznej związanego z wiekiem, każdy dorosły osobnik wykazuje unikalny wzorzec progresji w procesie starzenia, nawet w przypadku niemal jednorodnego tła genetycznego i środowiskowego7. (Poprzez kontrolę genetyki i środowiska zminimalizowano możliwe zakłócające działanie tych czynników, co ujawniło istotny wkład stochastyczności w degenerację związaną z wiekiem). Zsynchronizowana populacja C. elegans o podobnym tle genetycznym, utrzymywana w kontrolowanym środowisku, nadal zawiera mieszankę różnych klas osobników w zależności od ich specyfiki starzenia się. Chociaż wszystkie zaczynają jako zdrowe osobniki dorosłe, niektóre szybko tracą sprawność fizyczną (tzw. „bad agers”, klasa C), podczas gdy inne zachowują witalność przez dłuższy czas (tzw. „graceful agers”, klasa A). Osobniki z grupy „bad agers” wykazują zatem znacznie krótszy okres zdrowia (healthspan) niż osobniki z grupy „graceful agers”.
Jak szczegółowo opisano w naszym badaniu8, osobniki starzejące się w sposób łagodny (graceful agers) zachowały młodzieńczą sprawność fizyczną, co zaobserwowano poprzez porównanie z profilem pływania znacznie młodszych dorosłych (Rysunki 3, 4 i 5). Ta utrzymująca się sprawność jest porównywalna z wydolnością fizyczną długowiecznych mutantów age-1(hx546) w wieku pozaprodukcyjnym (D 11) (Rysunki 1 i 2). Przeciwnie, osobniki starzejące się w sposób gwałtowny (bad agers) drastycznie utraciły znaczną część swoich możliwości fizycznych wkrótce po reprodukcji, osiągając poziomy zbliżone do ekstremalnie starych oraz progerycznych dorosłych daƒ-16(mgDƒ50) (Rysunki 1 - 4). Podobieństwa te można wywieść z ogólnego porównania, jednak przy dokładniejszej analizie łatwo dostrzec konkretne sygnatury. Na przykład, choć istnieje pewna korelacja między zakresem rozciągania i zwijania u ekstremalnie starych typów dzikich oraz mutantów starzejących się (Rysunek 2), zależność ta nie jest obserwowana u osobników starzejących się w sposób gwałtowny (Rysunki 4 i 5), które w badanych próbkach wykazują większą tendencję do zwijania się, ale nie do rozciągania. Prezentowane przez nas oprogramowanie dodaje zatem nowy wymiar do analizy sprawności fizycznej lub zdolności lokomotorycznych, dostarczając narzędzi do bardziej zaawansowanych badań, które wcześniej nie były wykonalne. Podsumowując, CeleST zapewnia kompleksowe odczyty w formie ośmiu nowych miar omówionych w niniejszej pracy, które definiują behawioralny odcisk palca specyficznych uwarunkowań genetycznych, epigenetycznych i środowiskowych, umożliwiając identyfikację unikalnych i wspólnych wzorców parametrów, które mogą być sygnaturami konkretnych warunków (środowiskowych, farmakologicznych, żywieniowych), procesów biologicznych lub stanów organizmu, takich jak okres zdrowia (healthspan).
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Raporty oprogramowania CeleST dotyczące szybkości inicjacji fal (A), indeksu aktywności (B), ruchu pędzla (C) i prędkości przemieszczania się (D) dla osobników WT, age-1(hx546), oraz daƒ-16(mgDƒ50)&#160;dorosłych w dniu 4 (wczesna dorosłość), 11 (po okresie reprodukcyjnym) i 20 (skrajna starość). Znak '#' na osi y oznacza 'liczbę'. WT zaznaczono kolorem szarym, age-1 zielonym, a daƒ-16 czerwonym. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM). W celu oceny istotności statystycznej porównano osobniki WT i mutanty starzejące się w tym samym wieku, stosując jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test wielokrotnych porównań Dunnetta. **, p = 0,001 - &#60;0,01; ***, p = 0,0001 - &#60;0,001. n = 62 dla każdego punktu danych z czterech niezależnych prób. Należy zauważyć, że tutaj oraz na Rysunku 2 każde pojedyncze 30 s&#160;nagranie wideo obejmuje 4 zwierzęta; dla każdej próby oceniamy łącznie 16 zwierząt z 4 filmów z pływania, co wykonuje się dla 4 powtórzeń biologicznych dla każdego przedstawionego punktu danych. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Raporty programistyczne dotyczące liczby fal ciała (A), asymetrii (B), rozciągnięcia (C) i zwinięcia (D) dla osobników dorosłych WT, age-1(hx546) oraz daƒ-16(mgDƒ50)&#160; w dniu 4 (wczesna dorosłość), 11 (po okresie rozrodczym) i 20 (skrajna starość). Znak '#' na osi y oznacza 'liczbę'. WT zaznaczono kolorem szarym, age-1 zielonym, a daf-16 czerwonym. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM). WT oraz mutanty starzejące się w tym samym wieku porównano pod kątem istotności statystycznej za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta. *, p = 0,01 - &#60;0,05; **, p = 0,001 - &#60;0,01; ***, p = 0,0001 - &#60;0,001. n = 62 dla każdego punktu danych z czterech niezależnych, 30 s&#160;prób pływania. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Raporty programowe dotyczące częstotliwości inicjacji fal (A), indeksu aktywności (B), ruchu szczecin (C) oraz prędkości pływania (D) dla młodych dorosłych WT (D 4) oraz osób w tym samym wieku z grupy „graceful agers” i „bad agers” (D10 i 11). Znak '#' na osi y oznacza 'liczbę'. Młode osobniki WT zaznaczono kolorem szarym, „graceful agers” klasy A kolorem zielonym, a „bad agers” klasy C kolorem czerwonym. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM). „Graceful agers” klasy A oraz „bad agers” klasy C porównywano z młodymi dorosłymi D 4 za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta. ****, p &#60;0,0001. n = 27 dla każdego punktu danych z dwóch niezależnych 30-sekundowych prób pływania. Wykres został lekko zmodyfikowany z publikacji Restif et al. (2014)8, która została opublikowana na licencji Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.&#160; <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Raporty oprogramowania dotyczące liczby fal ciała (A), asymetrii (B) oraz zwijania się (C) dla młodych osobników WT (D 4) oraz osobników w tym samym wieku z grupy „graceful agers” i „bad agers” (D 10 i 11). Znak '#' na osi y oznacza „liczbę”. Młode osobniki WT zaznaczono kolorem szarym, „graceful agers” klasy A kolorem zielonym, a „bad agers” klasy C kolorem czerwonym. Słupki błędów przedstawiają standardowy błąd średniej (SEM). Grupy „graceful agers” klasy A oraz „bad agers” klasy C porównano do młodych osobników D 4 za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta. **, p = 0,001 - &lt;0,01; ****, p &lt;0,0001; n/a, nie dotyczy, ponieważ tylko jedno zwierzę z całej próby zwijało się. n = 27 dla każdego punktu danych z dwóch niezależnych, 30 s&#160;prób pływania. Wykres został nieznacznie zmodyfikowany z pracy Restif et al. (2014)8, która została opublikowana na licencji Creative Commons Attribution (CC BY) http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/.&#160; <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Raport programistyczny dotyczący rozciągliwości dla młodych osób z grupy WT (D 4) oraz osób w tym samym wieku z grupy „graceful agers” (D 10) i „bad agers” (D 11). Młode osoby WT zaznaczono kolorem szarym, „graceful agers” klasy A kolorem zielonym, a „bad agers” klasy C kolorem czerwonym. Słupki błędów przedstawiają standardowy błąd średniej (SEM). Osoby „graceful agers” klasy A oraz „bad agers” klasy C porównano z młodymi dorosłymi z grupy D 4 przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta. n = 27 dla każdego punktu danych z dwóch niezależnych serii doświadczeń. Wykres został nieznacznie zmodyfikowany z pracy Restif et al. (2014)8, która została opublikowana na licencji Creative Commons Attribution (CC BY) http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wideo 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> 
Wideo 1: Pływanie reprezentatywnej grupy dorosłych osobników C. elegans&#160;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).*</a>
<img alt="Wideo 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> 
Wideo 2: Obliczenia indywidualnych map krzywizny wyników pływania badanych zwierząt za pomocą oprogramowania CeleST. Mapy krzywizny są obliczane w tle; nie są one widoczne w interfejsie użytkownika oprogramowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Wideo 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> 
Wideo 3: Obliczanie parametrów pływania przez oprogramowanie na podstawie indywidualnych map krzywizny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).*</a>
<img alt="Wideo 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> 
Wideo 4: Obliczenia programowe parametrów pływania niewymagające map krzywizny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">Kolej kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).*</a>

Opisana jest skuteczna i prosta metodologia komputerowej analizy zachowania nicieni podczas pływania w cieczy. Metoda ta wymaga niewielkich lub żadnych inwestycji dla laboratoriów C. elegans. Używany sprzęt jest standardowy, a oprogramowanie komputerowe do analizy behawioralnej (CeleST) jest oprogramowaniem typu open source.

Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest ilościowa ocena zachowania pływackiego *C. elegans* przy użyciu oprogramowania do wizji komputerowej o nazwie CeleST (C. elegans Swim Test). Ta metoda analizy może pomóc w określeniu wpływu mutacji genetycznych lub interwencji farmakologicznych na zachowanie pływackie *C. elegans*. Może ona również służyć do łatwej oceny związanego z wiekiem spadku sprawności lokomocyjnej. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość jednoczesnego śledzenia wielu osobników, analiza różnych aspektów postawy podczas pływania w celu oceny ośmiu parametrów zachowania pływackiego oraz zautomatyzowana ewaluacja danych.Zacznij od przygotowania stereomikroskopu i cyfrowej kamery CCD, a także komputera z oprogramowaniem do cyfrowej rejestracji wideo oraz oprogramowaniem do analizy obrazu w celu analizy zachowania pływackiego C. elegans. W oprogramowaniu do rejestracji wideo ustaw następujące parametry: Przykryj mikroskop ciemną tkaniną, aby zapobiec odblaskom w obszarze kropli do pływania na szkiełku przedmiotowym oraz poprawić jakość obrazu. Dostosuj odległość roboczą i powiększenie mikroskopu tak, aby cały obszar pływania był widoczny, a następnie wyreguluj lusterko podstawy, aby uzyskać ostry kontrast zwierząt na tle.Następnie ustaw oświetlenie w trybie ciemnego pola, aby ciała osobników dorosłych były widoczne jako białe na czarnym tle. W następnym kroku nanieś pipetą 60 µL buforu 1 x M9 do pierścienia o średnicy 10 mm, naniesionego fabrycznie na szkiełko przedmiotowe, upewniając się, że kropla całkowicie pokrywa obszar wewnątrz pierścienia. Przenieś cztery dorosłe nicienie do kropli buforu 1 x M9, minimalizując transport bakterii, które mogłyby zmącić ciecz.Zminimalizuj ilość bakterii w dołku pływalnym, pozwalając nematodom na krótkie przemieszczanie się po obszarze płytki poza dołkiem przed ich przeniesieniem lub lekko wymieszaj zawartość dołka, aby rozproszyć niewielkie ślady bakterii przed rejestracją. Następnie umieść szkiełko z dorosłymi nematodami na stoliku mikroskopu, aby zarejestrować ich zachowanie pływace w cieczy w formie 30-sekundowych filmów. Aby rozpocząć rejestrację, wybierz opcję New Sequence in RAM w sekcji Home, a następnie naciśnij czerwony przycisk nagrywania.Na koniec, po zakończeniu nagrywania, kliknij nagłówek Home i wybierz Export Full Sequence, aby podzielić wideo na sekwencję klatek obrazu. Rozpocznij od uruchomienia oprogramowania Computer Vision do analizy zachowania pływackiego C.elegans z programu Mat Lab, klikając przycisk Run. Na ekranie głównym programu do analizy pływania użyj przycisków „Add one video” lub „Add multiple videos”, aby przesyłać sekwencje klatek obrazu pojedynczo lub w grupach, przypisując im odpowiednie etykiety, takie jak genotyp, data, próba i czas trwania.Następnie kliknij „Process videos”, aby włączyć jednoczesne śledzenie wielu zwierząt w przesłanych sekwencjach. Na nowym ekranie, który się pojawi, zaznacz wybrane filmy w lewym polu i kliknij „Add to the list”. Następnie wyznacz strefę pływania, zaznaczając trzy punkty wewnątrz pierścienia, i rozpocznij przetwarzanie, klikając „Process all the videos listed above”. Monitoruj postępy przetwarzania filmów na dole, w centralnej części ekranu.Po zakończeniu procesu zamknij ekran przetwarzania wideo. Rozpocznij od kliknięcia „Compute measures”, aby otworzyć nowy ekran, na który można przesyłać przetworzone filmy pojedynczo w celu zatwierdzenia lub odrzucenia śledzenia poszczególnych zwierząt. Wykorzystaj ten etap manualny, aby skupić się na obszarach utraconego śledzenia, zaznaczonych czerwonymi blokami, i zestawić je z poprawnym śledzeniem, oznaczonym zielonymi blokami.Sprawdź Poprawność segmentacji ciała w pierwszym pasku kolorów na ekranie w dolnej połowie. Zauważ, że procent poprawnych klatek jest zaznaczony na zielono, a procent odrzuconych klatek na czerwono. Następnie nawiguj i modyfikuj bloki poprawnych lub odrzuconych klatek, korzystając z opcji „Następny blok” (Next block), „Zmień poprawność” (Switch validity), „Podziel blok” (Split block) i „Izoluj klatkę” (Isolate frame).W rzadkich przypadkach, gdy dwa zwierzęta przetną swoje ścieżki w niezatłoczonej strefie pływania, należy zamienić ich numery identyfikacyjne w określonym zakresie klatek za pomocą przycisku „Switch”. Następnie należy kliknąć „Save and compute measures”, aby zapisać wprowadzone dane dotyczące poprawności przed przesłaniem kolejnego przetworzonego filmu. Na koniec wybierz „Close”, aby zamknąć ekran obliczania parametrów (Compute Measures).Należy zwrócić uwagę, że oprogramowanie w tle oblicza mapy krzywizny wydajności pływania poszczególnych zwierząt, a także osiem parametrów wskazanych w dalszej części. Na ekranie głównym programu Computer Vision kliknij „Display results”, aby uzyskać wyniki analizy. Następnie utwórz grupy próbek do analizy statystycznej, wybierając pożądane analizowane sekwencje klatek w lewym polu i przenosząc je do nowej lub istniejącej grupy próbek, klikając przyciski „Add to the selected sample” lub „Add to a new sample”.Kliknij „Pokaż wykresy dla tych próbek”, aby przejść do drugiego ekranu, który wyświetla wykresy i kluczowe statystyki próbek dla każdego z ośmiu parametrów, wybieranych z menu na górze ekranu. Następnie wybierz „Histogramy 2D”, aby wykreślić kombinacje dowolnych dwóch parametrów za pomocą rozwijanych menu „pomiar na osi X” oraz „pomiar na osi Y” znajdujących się po lewej stronie ekranu. Kliknij „Zamknij”, aby wyjść i powrócić do ekranu „Wyświetl wyniki”.Następnie wybierz przycisk eksportu w lewym górnym rogu ekranu, aby zapisać szczegółowe dane numeryczne w pliku csv, który można otworzyć i dalej przetwarzać w programie do arkuszy kalkulacyjnych. Na koniec wybierz opcję „Close”, aby wyjść z ekranu „Display Results” i powrócić do ekranu głównego. Kliknij „Quit”, aby zapewnić zapisanie bazy danych zawierającej analizowane sekwencje wideo.Niektóre parametry pływania, takie jak szybkość inicjacji fal, indeks aktywności, ruchy szczeczek i prędkość przemieszczania się, stopniowo spadały wraz z wiekiem, nawet przy korzystnym tle genetycznym. Z kolei liczba fal ciała, asymetria, rozciąganie i parametry zwijania wykazywały tendencję wzrostową wraz z wiekiem u osobników dorosłych typu dzikiego oraz mutantów starzejących się. Choć wszystkie nicienie zaczynają życie jako zdrowe osobniki dorosłe, niektóre z nich szybko tracą sprawność fizyczną, podczas gdy inne zachowują wigor przez dłuższy czas, co wskazuje na to, że osobniki starzejące się gorzej mają znacznie krótszy okres zdrowia niż osobniki starzejące się łagodnie.Po opanowaniu metody, analiza czterech pływających nicieni może zostać przeprowadzona w ciągu kilku minut. Obliczenia trwają około sześciu minut na jedno wideo i mogą być wykonywane zdalnie. Możliwe jest przetwarzanie 250 zwierząt dziennie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób rejestracji filmów z prób pływania oraz przetwarzania danych w celu oceny lokomocji w cieczy.

automated-analysis-of-c-elegans-swim-behavior-using-celest-software

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Tutaj wprowadzamy test do pomiaru SWIP, behawioralnego fenotypu C. elegans, który występuje podczas energicznych ruchów, takich jak pływanie. Przykładowy protokół omawia zarówno ręczne, jak i automatyczne podejścia do analizy.

Test paraliżu wywołanego pływaniem (SWIP): metoda ilościowego określania lokomocji za pośrednictwem dopaminy u C. elegans

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali.  C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów.  Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj metodę analizy zachowania pływackiego C. elegans przy użyciu oprogramowania CeleST. Technika umożliwia jednoczesne śledzenie wielu osobników i automatyczną ocenę ośmiu parametrów pływania.

Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST

Przeglądaj więcej filmów