Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Ogólnym celem tej podskórnej procedury ksenoprzeszczepu guza pochodzącego od pacjenta jest zbadanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i szlaków oporności na leki w nowotworach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii dotyczące tego, czy dany lek wykazuje aktywność przeciwko określonemu typowi nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ksenografy nowotworów pochodzących od pacjenta utrzymują heterogeniczność molekularną, genetyczną i histologiczną typową dla nowotworów pochodzenia, dzięki czemu model jest bardziej istotny klinicznie.

Procedurę zademonstruje Stacey Bagby, profesjonalny asystent naukowy i certyfikowany technik weterynarii z naszego laboratorium. Po zebraniu od jednego do dwóch mililitrów krwi w probówce do separacji komórek krwi zawierającej cytrynian sodu, odwiruj próbki i przenieś warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Napełnij probówkę do góry sterylnym PBS.

Następnie ponownie obróć komórki. Następnie należy szybko umyć jednym mililitrem PBS, uważając, aby nie naruszyć granulatu PMBC. Następnie za pomocą pipety przenieś osocze z probówki do pobierania komórek krwi do sterylnej fiolki kriogenicznej o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj osocze i osad PBMC w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Przenieś ludzką tkankę nowotworową do obiektu dla zwierząt w sterylnym kubku zawierającym kompletną pożywkę i umieść kubek w okapie z przepływem laminarnym. Tak szybko, jak to możliwe, po pobraniu, przenieś tkankę do sterylnego plastikowego naczynia do krojenia w niewielkiej ilości pożywki. Następnie, używając wysterylizowanych w autoklawie małych nożyczek i kleszczy, pokrój tkankę na około trzy na trzy na trzy mililitry i umieść 10 do 12 kawałków w autoklawie wysterylizowanej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówki zawierającej 300 mikrolitrów galaretowatego roztworu mieszaniny białek na lodzie do implantacji.

W przypadku błyskawicznego zamrażania należy przenieść odpowiednią liczbę kawałków guza do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i umieścić fiolkę w roztworze ciekłego azotu. Następnie umieść w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu formalnego utrwalenia i zatopienia parafiny umieść trzy małe kawałki guza w 10-mililitrowym kubku z 10% formaliną na 24 godziny.

Po przetworzeniu tkanek na bloki zatopione w parafinie, przenieś pozostałe fragmenty tkanek do probówki kriogenicznej. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki uzupełnionej 10% DMSO do tkanki i przechowuj probówki na lodzie, aż będzie można je przenieść do pojemnika do zamrażania alkoholu izopropylowego. I umieść ten pojemnik w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wstrzyknąć tkankę nowotworową, załaduj kawałki guza przechowywane w galaretowatym roztworze mieszaniny białek do autoklawowanych trokarów o rozmiarze 12, uważając, aby każdy kawałek guza został całkowicie włożony do trokaru. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u sześcio- lub ośmiotygodniowej nagiej myszy i przenieś mysz na czyste pole w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Dostarczyć guz F0 podskórnie do okolicy grzbietowej szyi i po każdej stronie boku myszy, a następnie podskórnie podać środek przeciwbólowy dystalnie do jednego z bocznych miejsc wstrzyknięcia guza.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem, aż w pełni wyzdrowieje. Monitoruj wzrost i stan zdrowia myszy z implantem ksenografu co najmniej raz w tygodniu, rejestrując rozmiary guza, wytwarzanie guza, datę wstrzyknięcia guza i stan zdrowia myszy w odpowiednim systemie śledzenia. Kiedy guz osiągnie wielkość około 1,500 do 2,000 milimetrów sześciennych, użyj autoklawowanych nożyczek i kleszczy, aby wyciąć guz i przejść guz F1 do następnego pokolenia pięciu zwierząt, jak właśnie pokazano, zwracając uwagę na pobranie błyskawicznie zamrożonej formaliny i żywych próbek guza, jak wykazano dla każdego guza

Gdy pozostałe myszy z grupy guzów F0 wykazują guzy o wielkości około 1 500 do 2 000 milimetrów sześciennych, zbierz te guzy, jak właśnie pokazano do pobrania. Po osiągnięciu etapu F15 generacji guza należy użyć najwcześniejszej generacji żywotnych fragmentów guza dostępnych w magazynie ciekłego azotu do następnej serii wstrzyknięć guza. Gdy pożądany guz jest bardzo duży, od 1 500 do 2 000 milimetrów sześciennych, postępuj zgodnie z powyższymi procedurami, aby zebrać guz i rozszerzyć go do pożądanej ilości myszy.

Dozuj myszom lek i waż je i mierz dwa razy w tygodniu. Losowo podziel myszy na grupy leczone z 10 guzami na grupę i średnią objętością guza w grupie od 100 do 300 milimetrów sześciennych w granicach kilku odchyleń standardowych od siebie. Następnie posortuj myszy do odpowiednich grup do leczenia.

Dwukolorowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ dla człowieka i myszy złapanego w jednym DNA pokazuje, że ludzkie komórki zrębu w guzie F0 są zastępowane komórkami zrębu myszy w guzie F1. Podczas gdy cały czynnik wzrostu hepatocytów pochodzenia ludzkiego w pokoleniu F0 jest zastępowany mysim czynnikiem wzrostu hepatocytów w pokoleniu F1, ligand czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego składa się zarówno z białka ludzkiego, jak i mysiego w pokoleniu F1. Leczenie różnych generacji tego samego guza nie zmienia odpowiedzi na leczenie.

Z opornością lub wrażliwością guza, która wydaje się być szczepem guza, a nie specyficznym dla generacji guza. Co więcej, częstotliwość mutacji w tych powszechnie zmutowanych genach jest bardzo podobna między atlasem genomu raka a bankiem ksenografów nowotworów jelita grubego pochodzącym od pacjentów. Sugeruje to, że powszechne mutacje obserwowane w populacji pacjentów z jelitem grubym są dobrze reprezentowane w modelu ksenotransplantacji pochodzącym od pacjentów z jelita grubego.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby mieć spójny zespół kliniczny do identyfikacji i uzyskania zgody od pacjentów z rakiem oraz do usunięcia i ubruttowienia tkanki nowotworowej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak badanie związków przeciwnowotworowych jako pojedynczych lub skojarzonych środków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące żywotności tych strategii u pacjentów z określonym typem nowotworu.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie onkologii do zbadania nowych metod leczenia raka, heterogeniczności guza, mechanizmów oporności na leczenie, biologii nowotworowych komórek macierzystych i interakcji zrębu guza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować i utrzymać model ksenografu guza pochodzącego od pacjenta do oceny nowych terapii przeciwnowotworowych.