Name: Naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj syntetyczne transducery chemiczne do komunikacji między białkami w inżynierii białkowej. Metoda umożliwia aktywację enzymu detoksykacyjnego przez czynnik wzrostu PDGF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Minerva, Organizację HFSP oraz Grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (Starting Grant 338265).

1. Synteza 'Przetwornika Chemicznego'
<ol>
	<li>Przygotowania wstępne
	<ol>
		<li>Przygotować 2 M bufor octanu trietyloamonu (TEAA), mieszając 278 ml trietyloaminy ze 114 ml kwasu octowego i 400 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7 i dodaj wodę do końcowej objętości 1 l. Przechowuj ją w ciemnej butelce. 
		Uwaga: To rozwiązanie jest stabilne przez lata.</li>
		<li>Przygotować 5 mM roztwór kwasu askorbinowego, rozpuszczając 18 mg kwasu askorbinowego w 20 ml ultraczystej wody. Użyj świeżego roztworu; Roztwór jest stabilny przez jeden dzień.</li>
		<li>Przygotować 10 mM roztwór Cu(II)/tris(benzylotriazolylometylo)aminy (TBTA), rozpuszczając 25 mg pięciowodnego siarczanu miedzi(II) w 10 ml ultraczystej wody i 58 mg TBTA w 11 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Wymieszaj oba roztwory. Przechowuj go w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura koniugacji
	<ol>
		<li>Rozpuścić 100 nmol zmodyfikowanego oligonukleotydu (ODN-1) w 80 μl świeżej ultraczystej wody. Dodać 20 μl 2 M TEAA, pH = 7. Dodać 80 μl świeżo przygotowanego roztworu kwasu askorbinowego (5 mM w wodzie).</li>
		<li>Rozpuścić 1,5 μmol (574,5 μg) azydomodyfikowanego kwasu etakrynowego w 180 μl DMSO i dodać go do roztworu. Odgazuj roztwór za pomocą argonu przez 60 sekund i szybko dodaj 40 μl z roztworu Cu(II)/TBTA (10 mM w 55% (v/v) DMSO/woda).</li>
		<li>Ponownie oczyść argonem, szczelnie zamknij i mieszaj przez noc.</li>
		<li>Monitorować postęp reakcji i oczyszczać koniugat za pomocą RP-HPLC (faza ruchoma: A) 5% acetonitrylu, 5% TEAA, 90% ultraczystej wody; B) 65% acetonitryl, 5% TEAA, 30% woda ultraczysta). 24</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kontrolowanie aktywności GST przez PDGF
<ol>
	<li>Przygotowania wstępne
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml buforu do oznaczania, mieszając 33,9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBSx1) z 16,1 ml ultraczystej wody, aby uzyskać końcowe stężenie fosforanów 8 mM i dodać 23,8 mg MgCl2 w celu uzyskania końcowego stężenia 5 mM.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy GST M1-1 rozpuszczając białko w buforze zawierającym 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do końcowego stężenia 30 μM. Podzielić ten roztwór na małe porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć na świeżo, zgodnie z ppkt 2.1.5.1, w buforze do oznaczania i przechowywać na lodzie. 
		Uwaga: Roztwór będzie stabilny przez około 5 godzin lub do momentu zmniejszenia aktywności enzymu.</li>
		<li>Przygotuj podłoże zgodnie z poniższymi instrukcjami:
		<ol>
			<li>Rozpuścić 10 mg zredukowanego glutationu (GSH) w 325 μl ultraczystej wody do końcowego stężenia 100 mM roztworu podstawowego. Rozcieńczyć 21 μl z tego roztworu podstawowego w 979 μl buforu do oznaczania, aby uzyskać końcowe stężenie 2,1 mM roztworu roboczego.</li>
			<li>Rozpuścić 10 mg 2,4-dinitrochlorobenzenu (CDNB) w 492 μl etanolu do końcowego stężenia 100 mM roztworu podstawowego. Rozcieńczyć 43,2 μl z roztworu podstawowego w 956,8 μl buforu do oznaczania dla końcowego stężenia 4,32 mM roztworu roboczego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na 96-dołkowej płytce umieść każdy substrat w osobnej linii (12 dołków). Umieścić co najmniej 60 μl w każdym dołku, aby umożliwić szybkie i łatwe pobranie roztworu. Przykryj płytę blachą aluminiową, aby zapewnić ochronę przed światłem.</li>
		<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe w buforze do oznaczania:
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć GST M1-1 przez 50 do końcowego stężenia 0,6 μM dimera.</li>
			<li>Rozcieńczyć 'przetwornik chemiczny' do roztworu podstawowego o stężeniu 30 μM.</li>
			<li>Rozcieńczyć PDGF do końcowego stężenia 40 μM.</li>
			<li>Rozcieńczyć aptamer PDGF do końcowego stężenia 250 μM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć aktywność GST w obecności "przetwornika chemicznego" i PDGF.
	<ol>
		<li>Ustaw procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego.
		<ol>
			<li>Utwórz nowy eksperyment jako "protokół standardowy".</li>
			<li>Naciśnij "procedura", aby otworzyć okno ustawień procedury.</li>
			<li>Z listy rozwijanej w górnej części okna wybierz typ "Tabliczka 384" zgodnie z producentem tablicy.</li>
			<li>Naciśnij "Czytaj" w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Jeśli chodzi o metodę wykrywania, wybierz "Absorbancja".</li>
			<li>Jeśli chodzi o typ odczytu, wybierz "Punkt końcowy".</li>
			<li>Zapis 340 nm w oknie długości fali.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "Pełna płytka" na dole w prawym górnym rogu i wybierz studnię, która ma być mierzona.</li>
			<li>Naciśnij "ok", aby zamknąć okno "Odczyt".</li>
			<li>Wybierz opcję "uruchom kinetykę" w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Czas pracy wynosi 10 minut.</li>
			<li>Wybierz opcję minimalnych interwałów.</li>
			<li>Naciśnij "ok", aby zamknąć okno kinetyki.</li>
			<li>Przeciągnij linię "Odczyt" do pomiaru kinetycznego</li>.
			<li>Naciśnij przycisk "zatwierdź", a następnie przycisk "ok".</li>
			<li>Zapisz eksperyment.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "odtwarzaj". Pojawi się okno dialogowe — naciśnij przycisk "ok" tylko wtedy, gdy pomiar powinien zostać rozpoczęty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W celu przeprowadzenia doświadczenia z potrójnymi powtórzeniami należy przygotować cztery próbki, z których każda zawiera 3,25 μl "przetwornika chemicznego" i 3,25 μl GST M1-1. Do każdej próbki dodać odpowiednio 0, 1,2, 2,4 lub 4,9 μl PDGF i 123,5, 122,3, 121,1 lub 118,6 μl buforu do oznaczania.</li>
		<li>Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Do przezroczystej płytki z 384 dołkiem umieścić 40 μl próbki do każdego dołka. Próbki należy umieszczać tylko w dołkach nieparzystych lub tylko w studzienkach parzystych w tej samej linii, aby umożliwić użycie wielopipetora do dodawania substratu.</li>
		<li>Używając 12-kanałowego pipetora wielopunktowego, szybko dodać 10 μl z każdego z substratów, które zostały wstępnie przygotowane na płytce 96-dołkowej (sekcja 2.1.4). Wymieszaj delikatnie i szybko, aby uniknąć bąbelków. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny. Ponieważ kinetyka GST jest dość szybka, staraj się zminimalizować czas między dodaniem substratu a rozpoczęciem pomiaru kinetycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykle aktywacji/hamowania GST Za pośrednictwem "przetwornika chemicznego".
	<ol>
		<li>W celu przeprowadzenia doświadczenia z potrójnymi próbkami należy przygotować 5 próbek, z których każda zawiera 84,5 μl buforu do oznaczania, 3,25 μl "przetwornika chemicznego" i 3,25 μl GST M1-1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 3,65 μl buforu do oznaczania do próbki 1 i 3,65 μl PDGF do próbek 2-5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 3,12 μl buforu do oznaczania próbek 1-2 i 3,12 μl aptameru PDGF do próbek 3-5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 24,4 μl buforu do oznaczania próbek 1-3 i 24,4 μl PDGF do próbek 4-5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 7,8 μl buforu do oznaczania próbek 1-4 i 7,8 μl aptameru PDGF do próbki 5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Do płytki z 384 otworami przezroczystymi umieścić 40 μl próbki do każdego dołka. Próbki należy wkładać tylko do dołków nieparzystych lub tylko do parzystych w tej samej linii.</li>
		<li>Za pomocą 12-kanałowego pipetatora wielokanałowego szybko dodaj 10 μl z każdego substratu (wstępnie przygotowanego na płytce 96-dołkowej). Wymieszaj delikatnie i szybko, aby uniknąć bąbelków. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.</li>
		<li>Obliczyć V0 [mOD/min] w każdych warunkach, odejmując OD zmierzoną przy 340 nm przy t = 0,5 min od OD zmierzonej przy 340 nm przy t = 1,5 min, aby ocenić zdolność do recyklingu aktywacji/inhibicji. 25</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń reakcję "przetwornika chemicznego" w czasie rzeczywistym na zmiany w środowisku.
	<ol>
		<li>Efekt dodawania PDGF w czasie rzeczywistym
		<ol>
			<li>Ustaw procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego.</li>
			<li>Powtórz kroki 2.2.1.1-2.2.1.10.</li>
			<li>Czas pracy wynosi 3,5 minuty.</li>
			<li>Wybierz opcję minimalnych interwałów.</li>
			<li>Naciśnij "ok", aby zamknąć okno kinetyki.</li>
			<li>Przeciągnij linię "Odczyt" do pomiaru kinetycznego</li>.
			<li>Wybierz opcję Plate Out/In (Wyjście płyty) w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Wybierz opcję 'płyta wysunięta (bez okna dialogowego)'.</li>
			<li>Wybierz opcję "Opóźnienie" w menu po lewej stronie i wprowadź 30 sekund.</li>
			<li>Wybierz opcję Plate Out/In (Wyjście płyty) w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Wybierz opcję 'płyta w (bez okna dialogowego)'.</li>
			<li>Utwórz drugi pomiar kinetyczny, powtarzając kroki 2.2.1.4 - 2.2.1.14, ale w sekcji 2.2.1.11 ustaw kinetykę na 25 minut zamiast 10 minut.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "zatwierdź", a następnie przycisk "ok".</li>
			<li>Zapisz eksperyment.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "odtwarzaj". Pojawi się okno dialogowe – przycisk "ok" należy wciskać tylko wtedy, gdy pomiar powinien zostać rozpoczęty.</li>
			<li>Przygotować dwie próbki, mieszając 1 μl GST M1-1 i 1 μl "przetwornika chemicznego" w 38 μl buforu do oznaczania. Umieścić próbki w dwóch dołkach na przezroczystej płytce studzienkowej o średnicy 384, pozostawiając pustą studzienkę między tymi dwoma studzienkami.</li>
			<li>Za pomocą 12-kanałowego pipetatora wielokanałowego szybko dodaj 10 μl z każdego podłoża, delikatnie i szybko wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków, włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.</li>
			<li>Gdy płytka się otworzy (po 3,5 minuty), szybko dodaj 1,125 μl PDGF do jednego z dołków, delikatnie wymieszaj i pozwól płytce zamknąć się do pozostałych pomiarów kinetycznych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Efekt dodania aptameru PDGF w czasie rzeczywistym
		<ol>
			<li>Powtórz kroki 2.4.1.1-2.4.1.15.</li>
			<li>Przygotować dwie próbki, mieszając 1 μl GST M1-1, 1 μl "przetwornika chemicznego" i 1,125 μl PDGF w 36,9 μl buforu do oznaczania. Umieścić próbki w dwóch dołkach na przezroczystej płytce studzienkowej o średnicy 384, pozostawiając pustą studzienkę między tymi dwoma studzienkami.</li>
			<li>Za pomocą 12-kanałowego pipetatora wielokanałowego szybko dodaj 10 μl z każdego substratu, delikatnie i szybko wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków, włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.</li>
			<li>Gdy płytka się otworzy (po 1,5 min), szybko dodaj 1,2 μl aptameru PDGF do jednego z dołków, delikatnie wymieszaj i pozwól płytce zamknąć się do pozostałych pomiarów kinetycznych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz aktywację proleku JS-K za pomocą GST w obecności "przetwornika chemicznego" i PDGF.
	<ol>
		<li>Ustaw procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego.
		<ol>
			<li>Utwórz nowy eksperyment jako "protokół standardowy".</li>
			<li>Naciśnij "procedura", aby otworzyć okno ustawień procedury.</li>
			<li>Z listy rozwijanej w górnej części okna wybierz typ "384 plate" w zależności od producenta tablicy.</li>
			<li>Naciśnij "Czytaj" w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Jeśli chodzi o metodę wykrywania, wybierz "Absorbancję".</li>
			<li>Jeśli chodzi o typ odczytu, wybierz "Punkt końcowy".</li>
			<li>Zapis 305 nm w oknie długości fali.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "Pełna płytka" w prawym górnym rogu i wybierz studzienkę, która ma być mierzona.</li>
			<li>Naciśnij "ok", aby zamknąć okno "Odczyt".</li>
			<li>Wybierz opcję "uruchom kinetykę" w menu po lewej stronie.</li>
			<li>Czas pracy wynosi 10 minut.</li>
			<li>Wybierz opcję minimalnych interwałów.</li>
			<li>Naciśnij "ok", aby zamknąć okno kinetyki.</li>
			<li>Przeciągnij linię "Odczyt" do pomiaru kinetycznego</li>.
			<li>Naciśnij przycisk "zatwierdź", a następnie przycisk "ok".</li>
			<li>Zapisz eksperyment.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "odtwarzaj". Pojawi się okno dialogowe - naciśnij przycisk "ok" tylko wtedy, gdy pomiar powinien zostać rozpoczęty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do pomiarów produkcji NO należy użyć zestawu kalorymetrycznego azotyny/azotany. Do 96-dołkowej płytki włożyć 50 μl buforu do oznaczania w jednym rzędzie, 70 μl odczynnika Griess I do drugiego rzędu i 70 μl odczynnika Griess II do trzeciego rzędu.</li>
		<li>W celu przeprowadzenia doświadczenia z potrójnymi powtórzeniami należy przygotować cztery próbki, z których każda zawiera 4,8 μl "przetwornika chemicznego". Do próbki 1 dodać 155,2 μl buforu do oznaczania; do próbki 2 dodać 3,2 μl GST-M1-1 i 152 μl buforu do oznaczania; do próbki 3 dodać 9,6 μl PDGF i 145,6 μl buforu do oznaczania; a do próbki 4 dodać 3,2 μl GST-M1-1, 9,6 μl PDGF i 142,4 μl buforu do oznaczania.</li>
		<li>Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Do przezroczystej płytki studzienkowej o pojemności 384 ml umieścić 50 μl próbki w każdym dołku. Próbki należy umieszczać tylko w dołkach nieparzystych lub tylko w parzystych w tej samej linii, aby umożliwić użycie wielopipetora do dodawania substratu.</li>
		<li>Dodaj 0,54 μl JS-K (5 mM w DMSO) do każdego dołka.</li>
		<li>Za pomocą 12-kanałowego pipetora wielokanałowego szybko dodaj 10 μl z roztworu GSH (wstępnie przygotowanego na płytce 96-dołkowej), delikatnie i szybko wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.</li>
		<li>Bezpośrednio po pomiarze kinetycznym, za pomocą 12-kanałowego pipettora wielopunktowego, należy pobrać 50 μl z każdej próbki do rzędu bufora testowego na wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytce i szybko dodać do niej 50 μl odczynnika Griess I i 50 μl odczynnika Griess II. Inkubować, chroniąc przed światłem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 550 nm. 
		Uwaga: Objętość buforu testowego i odczynników zależy od protokołu zestawów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy metodę projektowania i testowania "przetwornika chemicznego", który może indukować sztuczną komunikację między dwoma naturalnie niepowiązanymi białkami, GST i PDGF, bez modyfikowania białek natywnych. Nienaturalna komunikacja GST-PDGF może być wykrywana w czasie rzeczywistym za pomocą testów enzymatycznych, które śledzą zmiany w aktywności GST w obecności "przetwornika chemicznego" i zwiększają stężenia PDGF. Oprócz wykrywania aktywacji GST przez PDGF, testy te wykorzystano do śledzenia dezaktywacji GST p...

Szlaki transdukcji sygnału odgrywają istotną rolę w niemal każdym procesie komórkowym i pozwalają komórce na szybką reakcję na sygnały środowiskowe.1 Szlaki te są często inicjowane przez wiązanie cząsteczki sygnałowej z receptorem zewnątrzkomórkowym, co prowadzi do aktywacji enzymów wewnątrzkomórkowych. Amplifikacja i propagacja tego sygnału wewnątrz komórki jest pośredniczona przez działanie białek sygnałowych, które tworzą sieć oddziaływań białko-białko, w której enzymy są aktywowane odwracalnie z wysoką specyficznością. Ponieważ dysregulacja tych sieci często prowadzi do rozwoju nowotworów, pojawiło się duże zainteresowanie ustanowieniem „terapii transdukcji sygnału w nowotworach”,2 w ramach której projektuje się leki mające na celu przerwanie złośliwych szlaków sygnalizacyjnych. Zaproponowaliśmy niedawno alternatywne podejście do terapii transdukcji sygnału, opierające się na zdolności leków do generowania nienaturalnych szlaków transdukcji sygnału.3 W szczególności uważamy, że poprzez projektowanie syntetycznych czynników naśladujących funkcję białek sygnałowych, możliwe byłoby pośrednie modulowanie funkcji komórki. Na przykład takie sztuczne sieci mogą umożliwić biomarkerom białkowym aktywację enzymów rozszczepiających proleki. Alternatywnie, te mimetyki białek sygnałowych mogłyby aktywować nienaturalne szlaki sygnalizacji komórkowej, wywołując efekty terapeutyczne.
Aby wykazać wykonalność tego podejścia, stworzyliśmy niedawno syntetyczny „przetwornik chemiczny”4, który umożliwia czynnikowi wzrostu płytkopochodnemu (PDGF) wywołanie rozszczepienia proleku przeciwnowotworowego poprzez aktywację transferazy S-glutationowej (GST), która nie jest jego naturalnym partnerem wiążącym. Struktura tego „przetwornika” składa się z aptameru DNA przeciwko PDGF, który został zmodyfikowany bivalentnym inhibitorem GST. Zatem ten syntetyczny czynnik należy do rodziny cząsteczek posiadających miejsca wiązania dla różnych białek,5-7 takich jak chemiczne induktory dimeryzacji (CIDs),8-10 a także do grupy białko-wiążących koniugatów oligonukleotydowo-syntetycznych.11-21
W niniejszym opracowaniu opisano ogólne zasady leżące u podstaw projektowania takich systemów oraz przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy i testowania funkcji tego „przetwornika” za pomocą konwencjonalnych testów enzymatycznych. Praca ta ma na celu ułatwienie opracowania dodatkowych „przetworników” z tej klasy, które mogą być wykorzystywane do mediowania wewnątrzkomórkowej komunikacji białko-białko, a w konsekwencji do indukowania sztucznych szlaków sygnalizacji komórkowej.
Rycina 1 schematycznie przedstawia zasady działania syntetycznych „przetworników chemicznych”, które mogą pośredniczyć w nienaturalnych komunikacjach białko-białko. Na tej ilustracji „przetwornik chemiczny”, integrujący syntetyczne ligandy dla białek I i II (ligandy I i II), umożliwia białku II wywołanie aktywności katalitycznej białka I, które nie jest jego naturalnym partnerem wiążącym. Wobec braku białka II przetwornik wiąże się z centrum katalitycznym enzymu (białka I) i hamuje jego aktywność (Rycina 1, stan ii). Jednakże związanie „przetwornika” z białkiem II sprzyja oddziaływaniom między ligandem I a powierzchnią białka II (Rycina 1, stan iii), co zmniejsza jego powinowactwo do białka I. W rezultacie zmniejsza się efektywne stężenie „wolnego” przetwornika w roztworze, co prowadzi do dysocjacji kompleksu przetwornik-białko I i do reaktywacji białka I (Rycina 1, stan iv). Podsumowując, etapy te podkreślają trzy fundamentalne zasady leżące u podstaw projektowania wydajnych „przetworników”: (1) „przetwornik” powinien posiadać specyficzny ligand dla każdego z białek docelowych, (2) oddziaływanie między ligandem II a białkiem II powinno być silniejsze niż oddziaływanie między ligandem I a białkiem I oraz (3) ligand I musi być zdolny do oddziaływania z powierzchnią białka II. Ta ostatnia zasada nie wymaga koniecznie, aby sam ligand I wykazywał wysokie powinowactwo i selektywność wobec białka II. Opiera się ona raczej na naszych niedawnych badaniach, które wykazały, że zbliżenie syntetycznej cząsteczki do białka prawdopodobnie sprzyja oddziaływaniom między tą cząsteczką a powierzchnią białka.19,22,23
<img alt="Schemat mechanizmu oddziaływań białkowych z wiążącymi, substratem i produktem." src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1: Zasady działania „przetworników chemicznych”. Kiedy „przetwornik chemiczny” zostanie dodany do aktywnego białka I (stan i), wiąże się on z jego centrum aktywnym poprzez ligand I i hamuje jego aktywność (stan ii). Jednak w obecności białka II, niezwiązany „przetwornik chemiczny” oddziałuje z białkiem II poprzez ligand II, co sprzyja oddziaływaniom między ligandem I a powierzchnią białka II. To indukowane oddziaływanie ligand I-białko II zmniejsza efektywne stężenie ligandu I, co prowadzi do dysocjacji kompleksu „przetwornik”-białko I i do reaktywacji białka I (stan iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>1-chloro-2,4-dinitrobenzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetnitryl</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II) pentahydrat</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Sulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etakrylowy</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>S-transferaza glutationu M1-1</td><td>Izraelskie Centrum Proteomiki Strukturalnej (Instytut Naukowy Weizmanna, Rehovot, Izrael)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr>Chlorek magnezu G4251 <td>o redukcji L-glutationu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td></td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do oznaczania kolorymetrycznego azotanów/azotynów</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Fundacja WM Keck na Uniwersytecie</td><td></td> Yale <td>na zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Izraelskie Centrum Proteomiki Strukturalnej (Instytut Naukowy Weizmanna, Rehovot, Izrael)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>ilustruje kolumny MicroSpin G-25</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td>Moduł <td></td><td>separacji 2695</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5 &mu; M, 4,6 mm i razy; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 kolumna (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm i razy; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Szlaki transdukcji sygnału, które kontrolują reakcję komórek na różne sygnały środowiskowe, są pośredniczone przez funkcję białek sygnałowych, które oddziałują ze sobą i aktywują się nawzajem z dużą specyficznością. Syntetyczne środki, które naśladują funkcję tych białek, mogą być zatem wykorzystywane do generowania nienaturalnych etapów transdukcji sygnału, a w konsekwencji do zmiany funkcji komórki. Przedstawiamy wytyczne dotyczące projektowania "przetworników chemicznych", które mogą indukować sztuczną komunikację między białkami natywnymi. Ponadto przedstawiamy szczegółowe protokoły syntezy i testowania specyficznego "przetwornika", który może indukować komunikację między dwoma niepowiązanymi białkami: płytkowym czynnikiem wzrostu (PDGF) i s-transferazą glutationu (GST). Przedstawiono również sposób, w jaki ta nienaturalna komunikacja PDGF-GST może być wykorzystana do kontrolowania rozszczepienia proleku przeciwnowotworowego, co wskazuje na potencjał wykorzystania takich systemów w "terapii sztucznej transdukcji sygnału". Prace te mają na celu ułatwienie opracowania dodatkowych "przetworników" tej klasy, które mogą być wykorzystywane do pośredniczenia w wewnątrzkomórkowej komunikacji białko-białko, a w konsekwencji do indukowania sztucznych szlaków sygnalizacji komórkowej.

Projekt, synteza oraz mechanizm działania „przetwornika chemicznego”, który może indukować sztuczną komunikację między PDGF a GST, przedstawiono na Rysunku 2. Struktura „przetwornika” integruje aptamer DNA do PDGF oraz bis-etakrynamid (bEA), który jest znanym inhibitorem GST (Rysunek 2a).19 Ligandy te umożliwiają „przetwornikowi” wiązanie zarówno PDGF, jak i GST z różnym powinowactwem, a mianowicie ze stałymi dysocjacji (kd) wynosząc...

Przedstawiamy wytyczne dotyczące rozwoju syntetycznych 'chemicznych przetworników', które mogą indukować komunikację między naturalnie niepowiązanymi białkami. Ponadto przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy i testowania specyficznego "przetwornika", który umożliwia czynnikowi wzrostu aktywację enzymu detoksykacyjnego, a w konsekwencji regulację rozszczepienia proleku przeciwnowotworowego.

Naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest spektroskopowe śledzenie nienaturalnej komunikacji między dwoma białkami indukowanej przez syntetyczny transduktor chemiczny. Praca ta wykaże możliwość opracowania syntetycznych analogów białek sygnałowych, które będą w stanie realizować szlaki transdukcji sygnału niewystępujące w naturze. Możliwość śledzenia nienaturalnej komunikacji białko-białko za pomocą zwykłego spektrofotometru mogłaby pomóc w opracowaniu i udoskonaleniu funkcji sztucznych transduktorów chemicznych i przybliżyć nas do realizacji terapii opartej na sztucznej transdukcji sygnału.Przetwornik chemiczny składa się z aptameru czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF), bivalentnego inhibitora GST w postaci amidu etakrynowego, fluoroforu oraz wygaszacza. Synteza przetwornika chemicznego nie zostanie przedstawiona w tym filmie.Szczegóły opisano w protokole tekstowym. Tutaj zilustrowano zasady działania przetwornika chemicznego. Przetwornik chemiczny hamuje aktywność enzymatyczną GST, gdy dwie grupy EA wiążą centra aktywne enzymów.Dodanie PDGF prowadzi do powstania kompleksu chemicznego transduktora PDGF, co zakłóca oddziaływanie między transduktorem a GST, przywracając tym samym aktywność enzymatyczną GST. Następujące po tym dodanie niemodyfikowanego aptameru PDGF uwalnia transduktor chemiczny i pozwala mu ponownie zahamować aktywność enzymu.Przed rozpoczęciem eksperymentów mających na celu zbadanie kontroli aktywności GST przez PDGF, należy skonfigurować procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiarów kinetycznych. Utwórz nowy eksperyment zgodnie ze standardowym protokołem. Wybierz Procedurę (Procedure), aby otworzyć okno ustawień procedury (Procedure Settings).Z listy rozwijanej w górnej części okna wybierz typ płytki 384 (384 Plate Type) zgodnie z producentem płytki. Wybierz opcję Odczyt (Read) w menu po lewej stronie. Jako metoda detekcji (Detection Method) wybierz Absorbancję (Absorbance).Następnie wybierz Punkt końcowy (Endpoint) dla rodzaju odczytu. W oknie Długość fali wpisz 340 nanometrów. Wybierz całą płytkę (Full Plate), a następnie wskaż studzienki do pomiaru.Następnie kliknij OK, aby zamknąć okno Read. W menu po lewej stronie wybierz Start Kinetic. Ustaw czas trwania pomiaru (Run Time) na 10 minut.Wybierz opcję Minimum Intervals. Następnie kliknij OK, aby zamknąć okno Kinetic. Przeciągnij Read Line do sekcji Kinetic Measurement.Wybierz przycisk Validate, a następnie przycisk OK. Zapisz eksperyment. Wybierz przycisk Play.Pojawi się okno dialogowe, ale nie należy klikać przycisku OK, dopóki nie będą Państwo gotowi do rozpoczęcia pomiaru kinetycznego. Po skonfigurowaniu czytnika płytek następnym krokiem jest przygotowanie próbek do pomiaru aktywności GST w obecności przetwornika chemicznego i PDGF. Aby przetestować cztery stężenia PDGF w trzech powtórzeniach, należy przygotować cztery próbki, z których każda zawiera 3,25 µL przetwornika chemicznego oraz 3,25 µL GST M-1.Do każdej próbki dodać odpowiednio 0, 1,2, 2,4 lub 4,9 µL PDGF. Następnie dodać do każdej próbki odpowiednią objętość buforu do analizy, aby uzyskać całkowitą objętość 130 µL. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Po 10 minutach przenieś 40 µL każdej próbki do dołków przezroczystej płytki 384-dołkowej. Przenieś każdą z czterech próbek wyłącznie do dołków nieparzystych lub parzystych w tym samym rzędzie. Pozwoli to na użycie wielokanałowej pipety podczas dodawania podłoża.Następnie, używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej, szybko dodaj do każdej próbki 10 µL każdego z wcześniej przygotowanych substratów w płytce 96-dołkowej. Wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Bezzwłocznie włóż płytkę do czytnika płytek i rozpocznij pomiar kinetyczny, wybierając przycisk OK w oknie dialogowym.Aby zbadać cykle hamowania aktywacji GST pośredniczone przez przetwornik chemiczny, należy przygotować pięć próbek, z których każda zawiera 84,5 µL buforu do testu, 3,25 µL przetwornika chemicznego oraz 3,25 µL GST M1-1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.Dodaj 3,65 µL buforu do testu do pierwszej próbki oraz 3,65 µL PDGF do próbek drugiej, trzeciej, czwartej i piątej. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodaj 3,12 µL buforu do testu do próbek pierwszej i drugiej oraz 3,12 µL aptameru PDGF do próbek trzeciej, czwartej i piątej.Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Do próbek jeden, dwa i trzy dodać 24,4 µL buforu do analizy, a do próbek cztery i pięć dodać 24,4 µL PDGF.Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodać 7,8 µL buforu do analizy do próbek od jednej do czterej oraz 7,8 µL aptameru PDGF do próbki piątej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Przenieś próbki do przezroczystej płytki 384-dołkowej. Aby przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach, szybko dodaj substrat do próbek. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.Aby rozpocząć ten test, skonfiguruj procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego zgodnie z opisem w tekście protokołu. Przygotuj dwie próbki w dwóch studzienkach przezroczystej płytki 384-dołkowej. W każdej studzience wymieszaj 1 µL GST M1-1 i 1 µL przetwornika chemicznego w 38 µL buforu do testu.Pozostaw jedno puste wgłębienie pomiędzy dwoma wgłębieniami. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej, szybko dodaj 10 µL substratu do każdego wgłębienia. Następnie wymieszaj delikatnie i szybko, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.Bezzwłocznie wstaw płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny. Gdy czytnik płytek otworzy się po 3,5 minutach, szybko dodaj 1,125 µL PDGF do jednej z studni, wymieszaj delikatnie i pozwól płytce ponownie trafić do czytnika w celu wykonania pozostałych pomiarów kinetycznych. Przed przygotowaniem próbek do tego doświadczenia, skonfiguruj w czytniku płytek procedurę eksperymentalną dla pomiaru kinetycznego, zgodnie z opisem w tekście protokołu.Do pomiaru produkcji tlenku azotu zostanie użyty kolorystyczny zestaw do oznaczania azotynów/azotanów. Na płytkę 96-dołkową należy nanieść 50 µL buforu do analizy na każdy dołek w pierwszym rzędzie oraz 70 µL odczynnika Griess One na każdy dołek w drugim rzędzie.Następnie do trzeciego rzędu należy dodać 70 µL odczynnika Griess Two do każdej studzienki. Przygotuj cztery próbki, z których każda zawiera 4,8 µL przetwornika chemicznego. Do pierwszej próbki dodaj 155,2 µL buforu do analizy.Do drugiej próbki dodaj 3,2 µl GST M1-1 oraz 152 µl buforu do analizy. Do trzeciej próbki dodaj 9,6 µl PDGF oraz 145,6 µl buforu do analizy. Natomiast do czwartej próbki dodaj 3,2 µl GST M1-1, 9,6 µl PDGF oraz 142,4 µl buforu do analizy.Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Do każdego dołka przezroczystej płytki 384-dołkowej nanieść 50 µL próbki, aby przeprowadzić eksperyment w trzech powtórzeniach. Próbki nanosić wyłącznie do dołków nieparzystych lub parzystych w tej samej linii, aby umożliwić użycie wielokanałowej pipety do dodawania substratu.Do każdej próbki należy dodać 0,54 µL proleku JS-K. Następnie do każdej próbki szybko dodać 10 µL roztworu glutationu, a następnie delikatnie i szybko wymieszać, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Płytkę należy włożyć do czytnika i rozpocząć pomiar kinetyczny.Bezpośrednio po pomiarze kinetycznym przenieś 50 µL każdej próbki do poszczególnych studzienek pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej zawierającej bufor do analizy. Następnie przenieś 50 µL z każdej studzienki drugiego rzędu płytki do studzienek pierwszego rzędu. Następnie przenieś po 50 µL ze studzienek trzeciego rzędu płytki do studzienek pierwszego rzędu.Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przed pomiarem absorbancji przy 550 nanometrach. Pomiar aktywności GST bez przetwornika chemicznego oraz z przetwornikiem chemicznym wykazał, że przetwornik chemiczny hamuje aktywność GST.Aktywność GST zostaje przywrócona poprzez dodanie zwiększających się stężeń PDGF do kompleksu GST-przetwornik chemiczny. Sekwencyjne dodawanie PDGF oraz niemodyfikowanego aptameru PDGF do kompleksu GST-przetwornik chemiczny wykazało, że komunikacja między PDGF a GST była odwracalna. Dodanie PDGF do kompleksu GST-przetwornik spowodowało szybki wzrost aktywności GST, 3,5 minuty po dodaniu substratów.Podczas gdy dodanie aptameru PDGF do mieszaniny GST, PDGF i przetwornika chemicznego spowodowało spadek aktywności GST. Wyniki te wskazują, że system reaguje w czasie rzeczywistym na zmiany w jego otoczeniu. Następnie zbadano zdolność tego systemu do kontrolowania aktywacji proleku przy użyciu JS-K, przeciwnowotworowego proleku, który jest aktywowany przez GST w celu uwolnienia toksycznego tlenku azotu.Pomiary ilości tlenku azotu uwalnianego po dodaniu JS-K do przetwornika chemicznego oraz różnych kombinacji GST i PDGF potwierdziły, że tylko obecność zarówno GST, jak i PDGF aktywuje JS-K. Wszystko to pokazuje, w jaki sposób syntetyczny związek może umożliwić czynnikowi wzrostu wywołanie aktywności katalitycznej transferazy S glutationowej, która nie jest jego naturalnym enzymem partnerem. Przyszłe biomimetyki tej klasy mogą zatem być wykorzystywane do modyfikowania odpowiedzi komórek na sygnały środowiskowe lub nadawania im nowych właściwości.

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Metodologia wirowania o zmodyfikowanej gęstości oparta na gradimencie została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

Skład białkowy ludzkiej zastawki mitralnej jest nadal częściowo nieznany, ponieważ jego analiza jest skomplikowana przez niską komórkowość, a tym samym niską biosyntezę białek. Praca ta zapewnia protokół do efektywnej ekstrakcji białka do analizy proteomu zastawki mitralnej.

Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Poznaj syntetyczne transducery chemiczne do komunikacji między białkami w inżynierii białkowej. Metoda umożliwia aktywację enzymu detoksykacyjnego przez czynnik wzrostu PDGF.

Naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału

Przeglądaj więcej filmów