Naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału
29 września 2016
Przedstawiamy wytyczne dotyczące rozwoju syntetycznych 'chemicznych przetworników', które mogą indukować komunikację między naturalnie niepowiązanymi białkami. Ponadto przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy i testowania specyficznego "przetwornika", który umożliwia czynnikowi wzrostu aktywację enzymu detoksykacyjnego, a w konsekwencji regulację rozszczepienia proleku przeciwnowotworowego.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest spektroskopowe śledzenie nienaturalnej komunikacji między dwoma białkami indukowanej przez syntetyczny przetwornik chemiczny. Przedstawione zostaną możliwości opracowania syntetycznych analogów białek sygnałowych, które będą w stanie realizować szlaki transdukcji sygnału niespotykane w naturze. Możliwość śledzenia nienaturalnej komunikacji między białkami za pomocą wspólnego spektrofotometru może pomóc w rozwoju i poprawie funkcji sztucznych przetworników chemicznych oraz przybliżyć nas do osiągnięcia terapii sztucznej transdukcji sygnału.
Przetwornik chemiczny składa się z płytkowego czynnika wzrostu lub aptameru PDGF. Biwalentny inhibitor GST z amidu etakrylu, fluorofor i gaszący aktywność. Synteza przetwornika chemicznego nie zostanie zademonstrowana w tym filmie.
Ale jest to opisane w protokole tekstowym. Zasada działania przetwornika chemicznego jest zilustrowana tutaj. Przetwornik chemiczny hamuje aktywność enzymatyczną GST, gdy dwie grupy EA wiążą miejsca aktywne enzymów.
Dodatek PDGF prowadzi do powstania kompleksu przetwornika chemicznego PDGF. Co zakłóca interakcję przetwornik-GST, przywracając w ten sposób aktywność enzymatyczną GST. Następujące dodanie niezmodyfikowanego aptameru PDGF uwalnia przetwornik chemiczny i umożliwia mu ponowne zahamowanie enzymu.
Przed rozpoczęciem eksperymentów mających na celu zbadanie kontroli aktywności GST przez PDGF, należy skonfigurować procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego. Utwórz nowy eksperyment jako protokół standardowy. Wybierz opcję Procedura, aby otworzyć okno Ustawienia procedury.
Z listy rozwijanej w górnej części okna wybierz typ płyty 384 zgodnie z producentem płyty. Wybierz pozycję Czytaj w menu po lewej stronie. Wybierz absorbancję dla metody wykrywania.
i punkt końcowy dla typu odczytu. W oknie Wavelength (Długość fali) wpisz 340 nanometrów. Wybierz opcję Pełna płyta i wybierz dołki, które mają być mierzone.
Następnie kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Odczyt. W menu po lewej stronie wybierz pozycję Start Kinetic. Ustaw czas pracy na 10 minut.
Wybierz opcję Minimalne interwały. Następnie kliknij OK, aby zamknąć okno Kinetic. Przeciągnij linię odczytu do pomiaru kinetycznego.
Wybierz przycisk Weryfikuj, a następnie przycisk OK. Zapisz eksperyment. Wybierz przycisk Odtwórz.
Pojawi się okno dialogowe, ale nie wybieraj przycisku OK, dopóki nie będziesz gotowy do rozpoczęcia pomiaru kinetycznego. Po skonfigurowaniu czytnika płytek następnym krokiem jest przygotowanie próbek do pomiaru aktywności GST w obecności przetwornika chemicznego i PDGF. W celu zbadania czterech stężeń PDGF w trzech egzemplarzach, należy przygotować cztery próbki, z których każda zawiera 3,25 mikrolitra przetwornika chemicznego i 3,25 mikrolitra GST M-1.
Do każdej próbki dodać odpowiednio zero, 1,2, 2,4 lub 4,9 mikrolitra PDGF. Następnie dodaj odpowiednią objętość buforu testowego do każdej próbki, aby uzyskać całkowitą objętość do 130 mikrolitrów. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Po 10 minutach przenieść 40 mikrolitrów każdej próbki do studzienek przezroczystej płytki 384. Przenieść każdą z czterech próbek do studzienki parzystej lub nieparzystej tylko w tym samym rzędzie. Aby umożliwić użycie wielopipetera do dodawania substratu.
Następnie za pomocą 12-kanałowego pipetera wielokanałowego szybko dodaj do każdej próbki 10 mikrolitrów każdego substratu przygotowanego wcześniej na płytce 96-dołkowej. Wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby uniknąć bąbelków. Natychmiast włóż tabliczkę do czytnika płytek i rozpocznij pomiar kinetyczny, wybierając przycisk OK w oknie dialogowym.
Aby zbadać cykle hamowania aktywacji GST, w których pośredniczy przetwornik chemiczny, przygotuj pięć próbek, z których każda zawiera 84,5 mikrolitra buforu testowego. 3,25 mikrolitra przetwornika chemicznego i 3,25 mikrolitra GST M1-1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.
Dodać 3,65 mikrolitra buforu testowego do pierwszej próbki i 3,65 mikrolitra PDGF do próbki drugiej, trzeciej, czwartej i piątej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodać 3,12 mikrolitra buforu testowego do próbki pierwszej i drugiej oraz 3,12 mikrolitra aptameru PDGF do próbki trzeciej, czwartej i piątej.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodać 24,4 mikrolitra buforu testowego do próbek pierwszej, drugiej i trzeciej. I 24,4 mikrolitrów PDGF do próbek czwartej i piątej.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodaj 7,8 mikrolitra buforu testowego do próbek od pierwszej do czterech i 7,8 mikrolitra aptameru PDGF do piątej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Przenieść próbki na przezroczystą płytkę dołka 384. Aby przeprowadzić eksperyment w trzech egzemplarzach i szybko dodać substrat do próbek. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.
Aby rozpocząć ten test, należy ustawić procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Przygotować dwie próbki w dwóch studzienkach na przezroczystej płytce studzienkowej 384. Dla każdej studzienki wymieszaj jeden mikrolitr GST M1-1 i jeden mikrolitr przetwornika chemicznego w 38 mikrolitrach buforu do oznaczania.
Pozostaw pustą studzienkę między dwoma studzienkami. Korzystając z 12-kanałowego pipetera wielokanałowego, szybko dodaj 10 mikrolitrów substratu do każdej studzienki. I mieszaj delikatnie i szybko, aby uniknąć bąbelków.
Natychmiast włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny. Gdy czytnik płytek otworzy się po 3,5 minuty, szybko dodaj 1,125 mikrolitra PDGF do jednego z dołków, delikatnie wymieszaj i pozwól płytce ponownie wprowadzić się do czytnika w celu przeprowadzenia pozostałych pomiarów kinetycznych. Przed przygotowaniem próbek do tego eksperymentu należy skonfigurować procedurę eksperymentalną w czytniku płytek do pomiaru kinetycznego, zgodnie z opisem w tekście protokołu.
Do pomiaru produkcji tlenku azotu zostanie użyty zestaw kolorymetryczny azotyny/azotanów. Na płytce 96-dołkowej dozować 50 mikrolitrów buforu testowego na studzienkę do pierwszego rzędu. 70 mikrolitrów Griess, jeden odczynnik na studzienkę w drugim rzędzie.
I 70 mikrolitrów odczynnika Griess Two na studzienkę w trzecim rzędzie. Przygotuj cztery próbki, z których każda zawiera 4,8 mikrolitra przetwornika chemicznego. Aby pobrać próbkę jedną, dodaj 155,2 mikrolitra buforu do testu.
Aby pobrać drugą próbkę, dodaj 3,2 mikrolitra GST M1-1 i 152 mikrolitry buforu testowego. Aby pobrać trzecią próbkę, dodaj 9,6 mikrolitra PDGF i 145,6 mikrolitra buforu testowego. Do czwartej próbki dodaj 3,2 mikrolitra GST M1-1, 9,6 mikrolitra PDGF i 142,4 mikrolitra buforu testowego.
Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dozować 50 mikrolitrów próbki na studzienkę do przezroczystej płytki dołka 384, aby przeprowadzić eksperyment w trzech egzemplarzach. Dozowanie próbek należy kierować tylko do parzystych lub nieparzystych studzienek w tej samej linii, aby umożliwić użycie wielopipetera do dodawania substratu.
Dodaj 0,54 mikrolitra proleku JS-K do każdej próbki. Szybko dodaj do każdej próbki 10 mikrolitrów roztworu glutationu i delikatnie i szybko wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków. Włóż płytkę do czytnika i rozpocznij pomiar kinetyczny.
Natychmiast po pomiarze kinetycznym przenieść 50 mikrolitrów każdej próbki do każdego dołka w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej z buforem do oznaczania. Następnie przenieś 50 mikrolitrów z każdej studzienki drugiego rzędu płytki do dołków pierwszego rzędu płytki. I 50 mikrolitrów na studzienkę z trzeciego rzędu płytki do studzienek pierwszego rzędu płytki.
Inkubować, chroniąc przed światłem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przed pomiarem absorbancji przy 550 nanometrach. Pomiar aktywności GST bez przetwornika chemicznego i z przetwornikiem chemicznym wykazał, że przetwornik chemiczny hamuje aktywność GST.
GST jest reaktywowany przez dodanie rosnących stężeń PDGF do kompleksu GST-przetwornik chemiczny. Sekwencyjne dodawanie PDGF i niezmodyfikowanego aptameru PDGF do kompleksu GST-przetwornik chemiczny ujawniło, że komunikacja między PDGF i GST była odwracalna. Dodanie PDGF do kompleksu przetwornika GST spowodowało szybki wzrost aktywności GST po 3,5 minuty od dodania substratów.
Podczas gdy dodanie aptameru PDGF do mieszaniny GST, PDGF i przetwornika chemicznego spowodowało spadek aktywności GST. Wyniki te wskazują, że system reaguje w czasie rzeczywistym na zmiany w swoim otoczeniu. Następnie zbadano zdolność tego systemu do kontrolowania aktywacji proleków przy użyciu JS-K, proleku przeciwnowotworowego, który jest aktywowany przez GST w celu uwolnienia toksycznego tlenku azotu.
Pomiary ilości tlenku azotu uwalnianego po dodaniu JS-K do przetwornika chemicznego oraz różnych kombinacji GST i PDGF potwierdziły, że tylko obecność zarówno GST, jak i PDGF aktywuje JS-K. To wszystko pokazuje, w jaki sposób czynnik syntetyczny może umożliwić czynnikowi wzrostu wyzwolenie aktywności katalitycznej S-transferazy glutationowej, która nie jest jego naturalnym partnerem enzymatycznym. Przyszłe biomimetyki tej klasy mogą być zatem wykorzystywane do zmiany odpowiedzi komórek na sygnały środowiskowe lub nadania im nowych właściwości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wytyczne dotyczące opracowywania syntetycznych „przetworników chemicznych”, które ułatwiają komunikację między niespokrewnionymi białkami. Szczegółowo opisano protokoły syntezy i testowania konkretnego przetwornika, który aktywuje enzym detoksykujący za pośrednictwem czynnika wzrostu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Inżynieria białek
- Przekaźnictwo sygnałów
Wstęp
- Nienaturalna komunikacja między białkami może być indukowana za pomocą syntetycznych przetworników.
- Opracowanie syntetycznych analogów białek sygnałowych jest kluczowe dla nowych strategii terapeutycznych.
- Dzięki temu podejściu można badać szlaki transdukcji sygnału niewystępujące w naturze.
- Do monitorowania tych oddziaływań można wykorzystać powszechnie dostępne spektrofotometry.
Cel badania
- Wykazanie wykonalności zastosowania syntetycznych przetworników chemicznych w komunikacji białkowej.
- Poprawa funkcji sztucznych przetworników chemicznych.
- Rozwój terapii opartej na sztucznej transdukcji sygnału.
Zastosowane metody
- Synteza przetwornika chemicznego składającego się z aptameru PDGF.
- Wykorzystanie bivalentnego inhibitora GST w postaci amidu etakrynowego.
- Wprowadzenie fluoroforu i wygaszacza do analizy spektroskopowej.
- Układ eksperymentalny do spektroskopowego monitorowania oddziaływań białkowych.
Główne wyniki
- Skuteczna demonstracja nienaturalnej komunikacji białkowej.
- Potencjał opracowania nowych strategii terapeutycznych z wykorzystaniem syntetycznych transduktorów.
- Wnioski dotyczące mechanizmów szlaków transdukcji sygnału.
- Ustanowienie protokołów dla przyszłych badań w tej dziedzinie.
Wnioski
- Syntetyczne przetworniki chemiczne mogą skutecznie pośredniczyć w oddziaływaniach białkowych.
- Niniejsze badania torują drogę do innowacyjnych podejść w terapii transdukcji sygnałowej.
- Konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji tych systemów syntetycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza praca kładzie podwaliny pod terapię opartą na sztucznej transdukcji sygnału, demonstrując, w jaki sposób syntetyczne przetworniki chemiczne mogą pośredniczyć w nienaturalnej komunikacji białko-białko. Podejście to umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celu poprzez tworzenie ortogonalnych szlaków sygnalizacyjnych, które omijają rodzime mechanizmy regulacyjne. Takie systemy mają wartość prognostyczną w modelach przedklinicznych, pozwalając na precyzyjną kontrolę czasową aktywności enzymów, co może zostać wykorzystane w strategiach aktywacji proleków w onkologii oraz innych obszarach terapeutycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez indukowalną i odwracalną komunikację białkową między partnerami nienatywnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia regulowalny system do oceny stopnia zaangażowania celu i modulacji szlaku bez konieczności manipulacji genetycznej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określenie zależnego od dawki przywrócenia aktywności enzymatycznej w odpowiedzi na ligandy terapeutyczne.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów dynamiki oddziaływań białkowych w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem standardowej detekcji spektrofotometrycznej.
- Wartość operacyjna: Ustanawia odtwarzalny format testu kompatybilny z czytnikami płytek o wysokiej gęstości do analiz kinetycznych.
- Skalowalność: Umożliwia testowanie wielu warunków jednocześnie dzięki określonym protokołom miareczkowania odczynników i ich sekwencyjnego dodawania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazuje bezpośrednią zastosowalność w aktywacji proleków, gdzie zależna od transduktora aktywność GST kontroluje uwalnianie cytotoksycznego ładunku.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Potwierdza, że wyjściowy sygnał zależy zarówno od transduktora, jak i od kognatywnego liganda, co zmniejsza ryzyko fałszywie dodatniej aktywacji.
- Znaczenie dla modeli przedklinicznych: Wspiera ocenę sztucznych obwodów sygnalizacyjnych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej przed walidacją in vivo.
Integracja potoków i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając chemicznie indukowalny przełącznik, który łączy wiązanie celu z odczytami funkcjonalnymi, co umożliwia przejście z etapu walidacji trafień do optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie zewnętrznej kontroli aktywności enzymu za pomocą indukowanej ligandem zmiany konformacyjnej przetwornika.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki ustandaryzowanym pomiarom kinetycznym, które odzwierciedlają zdarzenia komunikacji białek w czasie rzeczywistym.
- Analityka: Generuje dane o aktywności rozdzielone w czasie, co umożliwia porównanie dynamiki sygnalizacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy angażowanie celu z efektami funkcjonalnymi poprzez aktywację proleku, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wierność sygnału.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia niezależny od platformy model projektowania przetworników, który można zastosować do różnych par białek poza PDGF-GST.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez oddzielenie sygnalizacji od szumu endogennych szlaków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji proporcji odczynników, czasów inkubacji i parametrów detekcji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną ocenę wykonalności mechanistycznej przed zainwestowaniem w złożone formaty terapeutyczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez kwantyfikację specyficzności i odwracalności indukowanych zdarzeń sygnalizacyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu inżynierii białek, projektowania aptamerów oraz kinetyki enzymatycznej w celu optymalizacji komponentów przetwornika.
- Zależy od dostępu do czytników płytek zdolnych do pomiarów kinetycznych absorbancji przy 340 nm i 550 nm.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji przygotowania odczynników oraz protokołów inkubacji w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas stosowania projektu przetwornika do nowych par białek o innej kinetyce wiązania lub ograniczeniach sterycznych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak stabilność przetwornika, potencjalne oddziaływania poza celem oraz konieczność dokładnego miareczkowania w celu uniknięcia nasycenia sygnału.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
