Name: Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową kriohistologię zmineralizowanych tkanek dla biologii układu mięśniowo-szkieletowego. Ta metoda umożliwia wielokrotne obrazowanie i barwienie tego samego preparatu w sposób cyfrowy i niezależny od obserwatora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować następującym źródłom finansowania: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 i T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj przedstawiliśmy szczegółowy protokół kriohistologiczny do kolokalizacji i ilościowego określenia kilku miar biologicznych poprzez wyrównanie obrazów z wielu rund barwienia/obrazowania na jednym odcinku. Opisana metoda z użyciem kriotaśmy jest szczególnie przydatna, ponieważ zachowuje morfologię trudnych do przekroju tkanek (np. zmineralizowanych kości i chrząstek). Ponadto wycięta tkanka jest mocno przylegająca do szkiełka podstawowego, co pozwala na wielokrotne rundy barwienia/obrazowania tego samego odci...

Badania biologiczne często wymagają efektywnego fenotypowania, co często wiąże się z pewnego rodzaju analizą histologiczną1-3. Potrzeba ta jest jeszcze bardziej widoczna w przypadku ambitnych projektów mających na celu zakłócenie każdego genu w genomie myszy4. Te analizy histologiczne mogą obejmować zarówno ocenę morfologii komórek i/lub cech anatomicznych, jak i mapowanie ekspresji określonych genów lub białek w poszczególnych komórkach. W rzeczywistości jednym z podstawowych wkładów histologii w dziedzinę genomiki jest zdolność do powiązania określonego sygnału molekularnego z określonym regionem lub typem komórki.
Tradycyjne metody histologii, szczególnie dla tkanek mięśniowo-szkieletowych, są często czasochłonne i pracochłonne, czasami wymagają tygodni na utrwalenie, odwapnienie, przecięcie, zabarwienie i zobrazowanie próbki, a następnie analizę obrazów poprzez ludzką interpretację. Analiza wielu sygnałów molekularnych, czy to za pomocą immunohistochemii, hybrydyzacji in situ, czy specjalnych barwień, wymaga wielu sekcji, a nawet wielu próbek, aby działały prawidłowo. Ponadto te wielokrotne odpowiedzi nie mogą być kolokowane w tej samej komórce, a czasami nie mogą być kolokalizowane w określonym regionie w danej próbce. W miarę jak dziedzina genomiki i epigenomiki wkracza w erę cyfrową, dziedzina histologiczna również musi podążać za nimi, aby zapewnić wydajną, wysokowydajną i zautomatyzowaną analizę różnych sygnałów molekularnych w ramach jednego odcinka histologicznego.
Rzeczywiście, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone techniki histologiczne, które mogą kojarzyć wiele sygnałów molekularnych z konkretnymi komórkami w danym próbce. Niedawno opublikowaliśmy nową, wysokoprzepustową metodę kriohistologiczną do oceny kilku miar odpowiedzi w danym odcinku ze zmineralizowanej tkanki5-14. Proces polega na ustabilizowaniu kriosekcji za pomocą zamrożonej kriotaśmy, sztywnym przyklejeniu zaklejonej taśmy do szkiełka mikroskopowego oraz przeprowadzeniu kilku rund barwienia i obrazowania na każdej sekcji. Te rundy obrazów są następnie wyrównywane ręcznie lub za pomocą automatyzacji komputerowej przed analizą obrazu (rysunek 1). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły tego procesu i podajemy przykłady, w których techniki te poprawiły nasze zrozumienie różnych procesów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców. Toksyczny. Może być zastąpiony 4% paraformaldehydem.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9378</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>W zależności od tkanki można stosować różne rozmiary</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Można zastąpić innymi kriomatrycami. Jednak w naszych rękach najlepiej sprawdziły się żywice na bazie PVA/PEG.</td></tr><tr><td>2-metylo-butan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Można zastąpić innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Dysk z próbkami</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Może być zastąpiony innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Ostrza kriostatu</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Można zastąpić innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Sekcja kriotaśmy</td><td>Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Rolkowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62800-46</td><td>Można zastąpić innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Plastikowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71890-01</td><td>Można zastąpić innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe szklane</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Można zastąpić innymi markami/modelami.</td></tr><tr><td>Klej optyczny Norland, 61</td><td>Klej optyczny</td><td>Norland Optical</td>, 61 <td></td></tr><tr><td>UV Czarne światło</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Czerwone mikroskopy</td><td>InSpeck ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Zielone mikrosfery InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Alizarin complexone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Demeklocyklina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>ELF 97 żółty fluorescencyjny substrat fosfatazy kwasowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców. Może być zastąpiony Hoechst 33342 lub innymi barwnikami jądrowymi.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 jądrowe przeciwbarwienie)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Octan sodu bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Winian sodu dwuzasadowy dwuwodny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>MgCl2 sześciowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców. Może być również zastąpiony innymi zestawami substratów, takimi jak Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>N,N dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Można również stosować inne skanery liniowe lub kafelkowe.</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów CFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy żółty (ELF 97) zestaw filtrów</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>zwyczaj; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów TRITC</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów Cy5</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>System transferu taśm CryoJane</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>62800-10</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62800-72</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>CryoJane Szkiełka samoprzylepne</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62800-4X</td><td>Dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Istnieje rosnące zapotrzebowanie na efektywne fenotypowanie i histopatologię różnych tkanek. Ta potrzeba fenotypowania jest widoczna w ambitnych projektach mających na celu zakłócenie każdego genu w genomie myszy. Społeczność naukowa potrzebuje szybkich i niedrogich środków do fenotypowania tkanek za pomocą histologii. Analizy histologiczne tkanek szkieletowych są często czasochłonne i w najlepszym razie półilościowe, regularnie wymagają subiektywnej interpretacji preparatów od przeszkolonych osób. W tym miejscu przedstawiamy kriohistologiczny paradygmat skutecznego i niedrogiego fenotypowania zmineralizowanych tkanek. W pierwszej kolejności przedstawiamy nowatorską metodę kriosekcji stabilizowanej taśmą, która zachowuje morfologię zmineralizowanych tkanek. Sekcje te są następnie sztywno przylegane do szkiełek szklanych i wielokrotnie obrazowane w kilku rundach barwienia. Powstałe obrazy są następnie wyrównywane ręcznie lub za pomocą oprogramowania komputerowego w celu uzyskania kompozytowych stosów kilku warstwowych obrazów. Protokół pozwala na kolokalizację wielu sygnałów molekularnych do określonych komórek w obrębie danego odcinka. Ponadto te sygnały fluorescencyjne można obiektywnie określić ilościowo za pomocą oprogramowania komputerowego. Protokół ten przezwycięża wiele niedociągnięć związanych z histologią zmineralizowanych tkanek i może służyć jako platforma do wysokoprzepustowego, wysokowartościowego fenotypowania tkanek mięśniowo-szkieletowych.

Ogólny schemat postępowania dla wysokoprzepustowej krio-histologii z obrazowaniem wielokrotnym
Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat pracy stosowany w tej technice. Obejmuje on kilka etapów, od utrwalania, poprzez kilka rund obrazowania, aż po końcowe wyrównanie i analizę obrazów. Proces przejścia od utrwalenia próbki do przeprowadzenia 4 rund obrazowania może zająć zaledwie tydzień, co jest czas...

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Celem tej technologii jest dostarczenie narzędzi histologicznych, które interują złożone systemy modelowe w sposób wysokoprzepustowy, niezależny od obserwatora i w pełni cyfrowy, co jest zarówno kosztowo efektywne, jak i istotne dla biologów zajmujących się układem mięśniowo-szkieletowym. Histologia, choć kluczowa dla większości badaczy biologicznych, często wiąże się z dużym nakładem pracy i nie jest ilościowa. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania technik histologicznych zapewniających wydajną, wysokoprzepustową i zautomatyzowaną analizę.Dzięki naszej platformie krio-histologicznej badacz może przypisać wiele sygnałów molekularnych do konkretnych komórek w danej próbce, obrazując i barwiąc ten sam preparat wielokrotnie w sposób wysokoprzepustowy. Procedurę zaprezentują dr Xi Jiang oraz Li Chen, asystenci naukowi w moim laboratorium, którzy byli pionierami w opracowaniu i wdrażaniu tych technik. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć próbkę z formaliny, wyciąć nadmiar tkanki i przenieść ją do 30% sacharozy przygotowanej w 1x PBS.Inkubować preparaty w sacharozie przez 12 do 24 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wypełnić formę do mrożenia medium do zatapiania w kriostatach i umieścić w niej preparaty. Potem ustawić próbki w formie w taki sposób, aby płaszczyzna cięcia dla obszaru zainteresowania była równoległa do dna formy.Następnie należy położyć formę kriologiczną na kawałku suchego lodu, aż zamarznie cienka warstwa medium do mrożenia, unieruchamiając próbki w miejscu. Potem należy wypełnić pozostałą objętość formy kriologicznej medium do mrożenia, utrzymując formę na granulacie suchego lodu. Po tym kroku formę kriologiczną umieszcza się w naczyniu zawierającym 2-metylobutan schłodzony uprzednio suchym lodem.Gdy próbki zostaną całkowicie zamrożone, należy wyjąć formę kriogeniczną i strząsnąć nadmiar 2-metylobutanu. Formę kriogeniczną należy zawinąć w celofan i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C. W tej procedurze blok z próbką przenosi się z zamrażarki do kriosztatu ustawionego na temperaturę od -20 do -25 °C.Następnie wyjmij blok z formy do mrożenia i odetnij nadmiar medium do mrożenia za pomocą żyletki. Potem nanieś niewielką ilość medium do mrożenia na dysk podkładki i ustaw blok tak, aby powierzchnia dysku była równoległa do dolnej powierzchni bloku. Odczekaj, aż medium do mrożenia zamarznie.Następnie umieść dysk z preparatem na głowicy do preparatów i ustaw głowicę tak, aby nóż ciął równolegle do powierzchni bloku preparatu. Następnie odetnij kawałki taśmy kriogenicznej, aby pokryć obszar zainteresowania, i schłodź je wstępnie w kriostacie. Po tym przytnij blok do poziomu znajdującego się w obrębie obszaru zainteresowania, wprowadzając w razie potrzeby dalsze korekty.Po dotarciu do obszaru zainteresowania i uzyskaniu możliwości wykonania przekroju, należy oczyścić powierzchnię bloku z wiórów. Następnie usuń nieprzylegającą podkładkę z taśmy kriogenicznej, chwytając taśmę za nielepkie srebrno-złote zakładki. Następnie przyłóż taśmę do bloku stroną klejącą do dołu.Docisnąć taśmę kriogeniczną za pomocą rolki i wykonać przekrój, używając automatycznego silnika lub ręcznego koła tnącego kriostatu. Następnie umieścić przekrój stroną tkankową do góry na plastikowym szkiełku mikroskopowym wewnątrz kriostatu. Wyjąć plastikowe szkiełko z kriostatu i pozwolić na roztopienie medium do kriozatopienia, tak aby przekrój przyległ do powierzchni szkiełka.Powtórz kroki sekcjonowania dla kolejnych seryjnych przekrojów lub innych obszarów zainteresowania. Po zakończeniu umieść skrawki w kasecie na preparaty i przechowuj je w temperaturze 4, -20 lub -80°C, w zależności od wymaganego czasu przechowywania oraz planowanych dalszych pomiarów odpowiedzi. Aby przeprowadzić metodę z użyciem kleju utwardzanego promieniami UV, najpierw opisz szkiełko mikroskopowe.Nanieś kroplę optycznego kleju utwardzanego promieniami UV na dwa szkiełka przedmiotowe i za pomocą krawędzi szkiełka rozprowadź cienką warstwę kleju na powierzchni szkiełek. Następnie odetnij srebrno-złotą zakładkę i połóż fragment z taśmą stroną tkankową do góry na warstwie kleju na pierwszym szkiełku. Przymocuj przekrój ruchem toczącym od jednej krawędzi do drugiej, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza pod taśmą.Następnie przenieś przyklejoną sekcję z pierwszego szkiełka na warstwę adhezyjną drugiego szkiełka, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Po umieszczeniu na każdym szkiełku odpowiedniej liczby sekcji dla danego eksperymentu, usuń nadmiar substancji adhezyjnej z okolicznych obszarów. Następnie dokładnie obejrzyj sekcje pod kątem obecności pęcherzyków lub włókien pod taśmą.Następnie umieść preparaty na szkiełkach przedmiotowych pod lampą UV przez pięć do dziesięciu minut, aby utrwalić warstwę adhezyjną. Na tym etapie przygotuj roztwór markerów referencyjnych, rozpuszczając 50 µL zielonych i 50 µL czerwonych mikrosfer w 100 µL wody. Przechowuj roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.Następnie zanurz końcówkę pipety w roztworze mikrosfer i nanieś go punktowo na każdą sekcję, w bezpośrednim sąsiedztwie obszaru zainteresowania. Następnie wysusz szkiełka w temperaturze pokojowej i zabezpiecz je przed światłem, przykrywając folią na 30 minut, jeśli analiza szkiełek odbywa się w tym samym dniu. W przeciwnym razie umieść szkiełka w kasecie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zabarwieniu przekrojów, przymocuj szkiełka cover slips do szkiełek przedmiotowych, używając medium montażowego acquiesce. Aby przeprowadzić obrazowanie, umieść szkiełka w tackach mikroskopowych, a następnie wsuń tacki do stosu tacek w mikroskopie skanującym. Następnie kliknij listę profili w oprogramowaniu mikroskopu, aby załadować profil dla każdego szkiełka z odpowiednim czasem ekspozycji dla każdego fluoroforu.Kliknij przycisk Start Preview Scan, aby wykonać obraz podglądu każdego preparatu. Oprogramowanie automatycznie przypisze nazwę pliku, odczytując kody kreskowe umieszczone na etykietach preparatów. Alternatywnie, każdemu preparatowi można ręcznie przypisać nazwę pliku.Wyznacz obszary zainteresowania, uruchamiając kreator detekcji tkanek, obrysowując każdy obszar za pomocą narzędzia do rysowania, wprowadzając niezbędne korekty i zapisując je dla kolejnych rund obrazowania. Po przygotowaniu każdego preparatu rozpocznij proces skanowania, klikając przycisk Start Scan. Po każdej rundzie obrazowania, przed kolejnym etapem barwienia, zanurz preparaty w naczyniu Coplina wypełnionym 1x PBS aż do momentu, gdy szkiełka nakrywowe same odkleją się od preparatów.Po zakończeniu wszystkich rund obrazowania należy wyeksportować obrazy z każdego poszczególnego kanału jako pliki TIF lub JPG w celu zestawienia i analizy obrazów. Na tej rycinie przedstawiono przekrój kości udowej trzymiesięcznej myszy, zabarwiony kalceiną niebieską; w pierwszej rundzie obrazowania zobrazowano nagromadzony minerał (widoczny na biało) oraz markery mineralizacji (widoczne na zielono i czerwono). Następnie preparaty zobrazowano pod kątem aktywności osteoklastów (widoczna na żółto w drugiej rundzie) oraz aktywności fosfatazy alkalicznej (widoczna na czerwono w trzeciej rundzie obrazowania).W ostatniej, czwartej rundzie preparaty barwiono błękitem toluidyny. Markery referencyjne obrazowano podczas każdej rundy, w tym podczas rundy chromogennej, a następnie wyrównywano je za pomocą specjalistycznego oprogramowania. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w krótszym czasie, niż zajmuje dekalcyfikacja typowego preparatu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak uzyskać wysokiej jakości obrazy wysokotreściowe zmineralizowanych tkanek, które, jak mamy nadzieję, znajdą szersze zastosowanie w środowisku badaczy układu mięśniowo-szkieletowego.

high-throughput-multi-image-cryohistology-of-mineralized-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.

Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj wysokoprzepustową kriohistologię zmineralizowanych tkanek dla biologii układu mięśniowo-szkieletowego. Ta metoda umożliwia wielokrotne obrazowanie i barwienie tego samego preparatu w sposób cyfrowy i niezależny od obserwatora.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Przeglądaj więcej filmów