Name: Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj izolację i kwantyfikację małych RNA z lipoprotein o dużej gęstości. Ta metoda pozwala analizować czyste HDL pod kątem zmian RNA w chorobach, otwierając drogę do nowych biomarkerów i celów terapeutycznych w chorobach kardiometabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez nagrody od National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute dla K.C.V. HL128996, HL113039 i HL116263. Praca ta została również wsparta nagrodami American Heart Association dla K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 i R.M.A. POST25710170.

1. Oczyszczanie HDL (~ 5,5 dnia)
<ol>
	<li>Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (DGUC, ~ 5 dni)
	<ol>
		<li>Dodaj 90 μl 100x przeciwutleniaczy do 9 ml osocza wyizolowanego ze świeżej krwi żylnej.</li>
		<li>Dostosuj gęstość osocza za pomocą KBr z 1,006 g/ml do 1,025 g/ml, dodając 0,251 g KBr do 9 ml osocza z kroku 1.1.1 (0,0278 g/ml KBr osocza). Ubijaj plazmę, aż cała sól rozpuści się w temperaturze pokojowej i przenieś do probówek ultrawirówek i upewnij się, że wszystkie pęcherzyki unoszą się do góry.</li>
		<li>Zegnij końcówkę igły 18-G pod kątem 90° 1 cm od końcówki, skośną stroną do góry. Za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 18 ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #1 na osocza (Tabela 1). 
		UWAGA: Wygięta igła zapewnia, że wszystkie VLDL/IDL, LDL i HDL zostaną usunięte bez mieszania z nakładką.</li>
		<li>Usuń większość pęcherzyków u góry, pozostawiając 2 - 3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki i ostrożnie umieść rurki w wiaderkach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważ każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważ z przeciwległym wiadrem (wiadro + nakrętka): #1 do #4, #2 do #5 i #3 do #6. 
		UWAGA: Te wiadra muszą być zawsze wyważone i dopasowane.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja VLDL/IDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.</li>
		<li>Po usunięciu frakcji VLDL/IDL należy zebrać pozostałe 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki do 9 ml za pomocą roztworu nakładającego #2 (Tabela 1).</li>
		<li>Dostosuj gęstość próbki z 1,025 g/ml do 1,080 g/ml za pomocą KBr, używając około 0,746 g KBr w próbce 9 ml lub 0,0828 g/ml KBr próbki. Delikatnie kołysz próbką, aż cała KBr się rozpuści (około 20 min) i przenieś do probówki ultrawirówkowej, upewniając się, że pęcherzyki unoszą się do góry.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #3 na próbkę (Tabela 1). Pozostaw 2-3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki.</li>
		<li>Usuń większość pozostałych pęcherzyków z górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja LDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.</li>
		<li>Po usunięciu frakcji LDL należy zebrać pozostałe około 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki (osocza) do 9 ml za pomocą 1,080 g/ml roztworu #4 (Tabela 1).</li>
		<li>Dostosuj gęstość próbki z 1,080 g/ml do 1,30 g/ml za pomocą KBr, używając 3,33 g KBr w próbce 9 ml (osocze) lub 0,37 g KBr na każdy ml próbki. Rozdrabniaj lub lekko mieszaj próbkę, aż cała KBr (sól) zostanie rozpuszczona i przenieś do probówki ultrawirówkowej.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #5 na próbkę (Tabela 1).</li>
		<li>Usuń większość pozostałych pęcherzyków w górnej części probówki, pozostawiając 2-3 mm odstępu od menisku do górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z hamulcem #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć około 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Jest to frakcja HDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C. 
		UWAGA: Zgodnie z DGUC HDL można dializować w celu usunięcia roztworów o wysokiej zawartości soli.</li>
		<li>Aby przeprowadzić dializę, należy umieścić pobraną frakcję HDL w szczelnie zamkniętym rękawie dializacyjnym (odcięcie 10 000 m) i dializować przez noc w 1 l 1x PBS. Zmień bufor dializacyjny (1x PBS) 3 razy w ciągu 24 godzin. Delikatne zakłócenie PBS za pomocą mieszadła magnetycznego poprawi dializę.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka w DGUC-HDL przy użyciu metody BCA8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybka chromatografia cieczowa białkowa (FPLC) lub chromatografia wykluczania wielkości (~ 6 h)
	<ol>
		<li>Przefiltrować 1,2 mg DGUC-HDL (białko całkowite) w 500 μl przez mikrofiltr odśrodkowy 0,22 μm (patrz Wykaz materiałów), bezpośrednio przed wstrzyknięciem. 
		UWAGA: W przypadku niektórych próbek może być wymagane dodatkowe filtrowanie próbki DGUC-HDL przez mikrofiltr odśrodkowy 0,45 μm przed filtrem 0,22 μm.</li>
		<li>Pobrać przefiltrowaną próbkę DGUC-HDL, załadować strzykawkę do wstrzykiwań FPLC (napełnić) i upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza przed wstrzyknięciem do FPLC.</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu FPLC na 0.3 ml/min z limitem ciśnienia 2.6 MPa. Zrównoważyć kolumny z objętością 0,2 kolumny (około 15 ml) buforu przed wstrzyknięciem próbki. Wstrzyknąć próbkę z 3 ml buforu do przyrządu FPLC (pętla iniekcyjna) i rozpocząć przebieg. Zbierz 1,5 ml frakcji, co daje w sumie 72 frakcje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie małego RNA (sRNAseq, ~ 9 dni)
<ol>
	<li>Izolacja RNA (~ 1 dzień)
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj frakcje FPLC odpowiadające DGUC-HDL, określając poziom cholesterolu całkowitego za pomocą zestawu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z tej konfiguracji FPLC, spodziewaj się, że znajdziesz 6 - 7 frakcji FPLC zawierających DGUC-HDL.</li>
		<li>Zebrać całą objętość (około 8 -1 0 ml puli 1,45 ml frakcji o objętości 1,45 ml) z frakcji DGUC-HDL FPLC i zagęścić za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 10 kDa m.w. przy 4 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy koncentrat HDL osiągnie około 100 μl.</li>
		<li>Zebrać koncentrat HDL i określić ilościowo całkowite stężenie białka HDL przy użyciu metody BCA8.</li>
		<li>Oznaczyć najwyższe stężenie białka całkowitego HDL, do 1 mg, które można podać z każdej próbki w zestawie. Na przykład wyizoluj RNA z tej samej ilości białka całkowitego HDL dla każdej próbki.</li>
		<li>Wykonaj izolację RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu (patrz Lista materiałów).
		<ol>
			<li>Dodać 10x objętość odczynnika do lizy fenoli (patrz wykaz materiałów) i wirować przez 1 min.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
			<li>Dodać chloroform (20% objętości odczynnika do lizy fenolu użytego w kroku 2.1.5.1) i energicznie wstrząsać przez 15 s.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 minuty.</li>
			<li>Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.</li>
			<li>Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki, unikając interfazy.</li>
			<li>Dodaj 1,5x objętość 100% etanolu do fazy wodnej i wiruj przez 1 min.</li>
			<li>Próbki należy przechowywać przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
			<li>Kontynuuj korzystanie z protokołu izolacji RNA, korzystając z dostarczonych mini kolumn.</li>
			<li>Eluować za pomocą 30 μl H2O wolnego od RNaz. Najpierw dodać 15 μLH2Obezpośrednio do fryty, wirować z małą prędkością (2 000 x g) przez 2 min, a następnie wirować z dużą prędkością (max) przez 1 min. Powtórzyć ten krok z dodatkowymi 15 μlH2O.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Natychmiast przystąp do generowania biblioteki sRNA lub przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie biblioteki (~ 6 h)
	<ol>
		<li>Przygotuj biblioteki cDNA sRNA przy użyciu protokołu zestawu do generowania biblioteki sRNA, zgodnie z instrukcjami producenta z jedną modyfikacją amplifikacji PCR, jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Przygotować mastermix do PCR na lodzie zawierającym 0,5 μl H2O bez DNaz/RNaz, 15 μl mieszanki PCR (PML) i 1 μL RNA PCR Primer (RP1) na próbkę (dodać dodatkowe 10% w przypadku błędu pipetowania).</li>
			<li>Dodać 16,5 μl mieszaniny PCR do każdej próbki (cDNA).</li>
			<li>Przypisz numer indeksu/kodu kreskowego do każdej próbki w celu multipleksowania i dodaj 1 μl wskaźnika startera PCR (do odpowiedniej liczby) do próbki.</li>
			<li>Wykonaj szybkie wirowanie za pomocą microfuge. 
			UWAGA: Całkowita objętość powinna teraz wynosić 30 μl na próbkę.</li>
			<li>Wykonać warunki cykliczne dla amplifikacji PCR, jak wyszczególniono w tabelach 2 i 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmiar Wybierz bibliotekę sRNA, aby usunąć adapter:Adaptery (~ 1,5 h)
	<ol>
		<li>Dokonaj wyboru rozmiaru biblioteki za pomocą automatycznego selektora rozmiaru DNA zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi parametrami rozmiaru: Cel: 156 pz, Początek: 135 pz, Koniec: 177 pz, Flaga zakresu: Szeroki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie DNA (~0,5 h)
	<ol>
		<li>Oczyść cDNA sRNA o wybranej wielkości zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Elute czyste i skoncentrowane cDNA sRNA za pomocą 2 x 7 μLH2O-wolnychod DNaz/RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo i oceń wydajność i jakość biblioteki cDNA sRNA (~ 1 h)
	<ol>
		<li>Oceń jakość i rozmiar biblioteki cDNA sRNA za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze (Lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Określ ilościowo poszczególne stężenia w bibliotece cDNA sRNA za pomocą testu DNA o wysokiej czułości (lista materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie próbki o różnych indeksach były prowadzone na tym samym torze komory przepływowej, jeśli to możliwe. Jeżeli wymagany jest więcej niż jeden tor, należy odpowiednio wymieszać próbki skrzynkowe i kontrolne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie sRNA (~ 7 dni)
	<ol>
		<li>Puluj indywidualne indeksowane biblioteki sRNA na podstawie stężeń równomolowych.</li>
		<li>Przesiewaj połączone biblioteki sRNA pod kątem jakości za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze i określ stężenie DNA w bibliotece, jak w 2.5.1 - 2.5.2.</li>
		<li>Wykonaj ilościowy PCR (qPCR) zawartości adaptera, aby zapewnić odpowiednią głębokość sekwencjonowania, korzystając z zestawu do kwantyfikacji qPCR z biblioteki sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów).</li>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie przy użyciu pojedynczego odczytu protokołu 50 bp, aby osiągnąć głębokość około 20 - 25 mln odczytów na próbkę, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych (~ 1 dzień)
<ol>
	<li>Użyj bcl2fastq2, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika, aby wstępnie przetworzyć surowe pliki fastq z demultipleksowanymi próbkami (Lista materiałów).</li>
	<li>Użyj Cutadapt, aby przyciąć adaptery9 i usunąć odczyty < długości 16 nukleotydów (nts), zgodnie z instrukcjami instrukcji obsługi (Lista materiałów).</li>
	<li>Usuń sekwencje zanieczyszczeń obecne w bibliotekach sRNA, w tym sekwencję roztworu zatrzymującego (STP: CCACGTTCCCGTGG) i przeniesienie adaptera (CTACAGTCCGACGATC) za pomocą funkcji removeSequenceInFastq w ramach NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wykonuj wskaźniki kontroli jakości przez FastQC przy użyciu narzędzi Centrum Nauk Ilościowych (CQS), zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wygeneruj nienadmiarową listę "identycznych" odczytów (zwiń nadmiarowe odczyty) i zapisz numery kopii za pomocą CQSTools, zgodnie z instrukcjami przewodnika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Dopasuj odczyty do ludzkiego genomu za pomocą Bowtie1.1.2 pozwalającego na 1 niezgodność (opcje: -a -m 100 --best --strata -v 1), zgodnie z instrukcjami instrukcji użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wykonuj zadania wyrównywania, zliczania i podsumowywania wyników odczytu za pomocą NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika.</li>
	<li>Konwertuj wyeksportowaną tabelę zliczania na plik arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Normalizuj odczyty określonej klasy (np. miRNA) do całkowitej liczby odczytów dla tej klasy (np. całkowitej liczby odczytów miRNA) i zgłaszaj sygnały jako odczyty na zmapowane miRNA (RPMM). (np. RPMM =(miR-X/Całkowita liczba odczytów # miRNA)*1 000 000).</li>
	<li>Wprowadź znormalizowaną tabelę zliczania jako ogólną technologię jednokolorową do oprogramowania do analiz różnicowych niskiego i wysokiego poziomu zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów). 
	UWAGA: Obecnie nie ma dobrze scharakteryzowanych genów/sRNA dla HDL-sRNA. Można zastosować kontrolę skokową, ale może to być problematyczne. Zaleca się normalizację do całkowitego dopływu lub objętości białka HDL. Co najważniejsze, zaleca się walidację wyników sekwencjonowania za pomocą jednej z różnych strategii ilościowego oznaczania miRNA i sRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowego PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)"> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs%2C+snoRNAs%2C+snRNAs%2C+and+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li>
<li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8(2014).</li>
<li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li>
<li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization%3A+evaluation+of+ultracentrifugation%2C+density-gradient+separation%2C+and+immunoaffinity+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li>
<li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164(2015).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li>
<li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li>
<li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li>
<li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145(2011).</li>
<li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten ma na celu ilościowe określanie miRNA i innych sRNA poprzez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości lub PCR w czasie rzeczywistym na HDL o wysokiej czystości. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia, należy zwrócić szczególną uwagę na każdy etap procesu oczyszczania HDL i RNA, a następnie ilościowego określania sRNA. Protokół ten jest przeznaczony dla projektów rozpoczynających się od ≥ 2 ml osocza. Niemniej jednak, wysokiej jakości analizy RNA można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą HDL oczyszczon...

Zewnątrzkomórkowe, niekodujące małe RNA (sRNA) reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i potencjalnych celów terapeutycznych i prawdopodobnie ułatwiają komunikację między komórkami1. Najszerzej badanym typem sRNA są mikroRNA (miRNA), które mają około 22 nt długości i są przetwarzane z dłuższych form prekursorowych i pierwotnych transkryptów2. Wykazano, że miRNA regulują ekspresję genów po transkrypcji poprzez supresję translacji białek i indukcję degradacji mRNA2. Niemniej jednak miRNA to tylko jeden z wielu rodzajów sRNA; ponieważ sRNA mogą być rozszczepiane od macierzystych tRNA (sRNA pochodzących z tRNA, tDR), małych jądrowych RNA (sRNA pochodzących z sRNA, sndRNA), małych jąderkowych RNA (sRNA pochodzących z snoRNA, snRNA), rybosomalnych RNA (sRNA pochodzących z rRNA, rDR), Y RNA (yDR) i innych różnych RNA1. Doniesiono, że kilka przykładów tych nowych sRNA działa podobnie do miRNA; jednak funkcje biologiczne wielu z tych sRNA pozostają do ustalenia, chociaż role w regulacji genów są prawdopodobnie3-6. Co najciekawsze, miRNA i inne sRNA są stabilnie obecne w płynach zewnątrzkomórkowych, w tym w ślinie, osoczu, moczu i żółci. Zewnątrzkomórkowe sRNA są prawdopodobnie chronione przed RNazami poprzez ich powiązanie z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV), lipoproteinami i / lub zewnątrzkomórkowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi.
Poprzednio informowaliśmy, że lipoproteiny, czyli lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL), transportują miRNA w osoczu7. W tym badaniu HDL wyizolowano przy użyciu sekwencyjnej metody ultrawirowania w gradiencie gęstości (DGUC), szybkiej chromatografii cieczowej białek (filtracja żelowa chromatografia z wykluczeniem wielkości, FPLC) i chromatografii powinowactwa (immunoprecypitacja anty-apolipoproteiny A-I (apoA-I)7. Korzystając zarówno z macierzy o niskiej gęstości opartych na PCR w czasie rzeczywistym, jak i indywidualnych testów miRNA, określono ilościowo poziomy miRNA na HDL wyizolowanym od osób zdrowych i z hipercholesterolemią7. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie profilować miRNA i określić ilościowo określone miRNA w wysoce czystych preparatach HDL. Od 2011 roku ustaliliśmy, że chociaż chromatografia powinowactwa zwiększa czystość HDL, nasycenie przeciwciałami znacznie ogranicza wydajność i może być zbyt kosztowne. Obecnie nasz protokół zaleca dwuetapową sekwencyjną metodę tandemową DGUC, po której następuje FPLC, która wytwarza również wysokiej jakości próbki HDL do dalszej izolacji RNA i kwantyfikacji sRNA. Ze względu na ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu sRNA (sRNAseq), np. miRNA, oraz zwiększoną świadomość innych klas sRNA innych niż miRNA, sRNAseq jest aktualnym stanem wiedzy w profilowaniu miRNA i sRNA. W związku z tym nasz protokół zaleca ilościowe oznaczanie miRNA i innych sRNA na próbkach HDL przy użyciu sRNAseq. Niemniej jednak całkowite RNA wyizolowane z HDL można również wykorzystać do ilościowego oznaczania pojedynczych miRNA i innych sRNA lub walidacji wyników sRNAseq przy użyciu metod PCR w czasie rzeczywistym. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół zbierania, oczyszczania, kwantyfikacji, analizy danych i walidacji HDL-sRNA o wysokiej czystości.
Ogólnym celem tego artykułu jest pokazanie wykonalności i procesu kwantyfikacji sRNA w wysoce czystym HDL wyizolowanym z ludzkiego osocza.

<table><tbody><tr><td>Ultrawirówka&nbsp;</td><td>Redlica Beckman</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Rotor</td><td>Redlica Beckman</td><td>331362</td><td>SW-41Ti AKTA</td></tr><tr><td>Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Kolumny zwiększające Liniowe</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Blat wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (zakupiona przez USA Scientific)</td></tr><tr><td>Mikrofuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Test DNA o wysokiej czułości</td> Biblioteka sekwencjonowania <td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler ProFlex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Bromek potasu</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtry mikroodśrodkowe 0,45 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Filtry mikroodśrodkowe 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation</td> Kit <td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol zestaw kolorymetryczny</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10 000 mW filtr wirujący z odcięciem</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>zakupiony za pośrednictwem</td></tr><tr><td>probówek paskowych</td> Millipore PCR <td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>zakupiony za pośrednictwem firmy Fisher</td></tr><tr><td>Zestaw microRNA RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Na 1000 reakcji</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>butelka 50 ml</td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Clean and Concentrator Rurki do dializy</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum</td><td>Labs</td><td>132118</td><td>zakupione za pośrednictwem firmy Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego rna

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Różnorodność małych niekodujących RNA (sRNA) szybko się powiększa i wyłania się ich rola w procesach biologicznych, w tym w regulacji genów. Co najciekawsze, sRNA znajdują się również na zewnątrz komórek i są stabilnie obecne we wszystkich płynach biologicznych. W związku z tym zewnątrzkomórkowe sRNA reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i prawdopodobnie biorą udział w sygnalizacji komórkowej i sieciach komunikacji międzykomórkowej. Aby ocenić ich potencjał jako biomarkerów, sRNA można określić ilościowo w osoczu, moczu i innych płynach. Niemniej jednak, aby w pełni zrozumieć wpływ zewnątrzkomórkowych sRNA jako sygnałów endokrynologicznych, ważne jest określenie, którzy nośniki transportują je i chronią w płynach biologicznych (np. Osoczu), które komórki i tkanki przyczyniają się do zewnątrzkomórkowych pul sRNA oraz komórki i tkanki zdolne do przyjmowania i wykorzystywania zewnątrzkomórkowego sRNA. Aby osiągnąć te cele, konieczne jest wyizolowanie wysoce czystych populacji nośników zewnątrzkomórkowych w celu profilowania i kwantyfikacji sRNA. Wcześniej wykazaliśmy, że lipoproteiny, szczególnie lipoproteiny o dużej gęstości (HDL), transportują funkcjonalne mikroRNA (miRNA) między komórkami, a HDL-miRNA są znacząco zmienione w chorobie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje tandemową izolację HDL z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości (DGUC) i szybką chromatografią białkowo-cieczową (FPLC) w celu uzyskania wysoce czystego HDL do dalszego profilowania i kwantyfikacji wszystkich sRNA, w tym miRNA, przy użyciu zarówno sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, jak i podejść PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten będzie cennym źródłem do badania sRNA na HDL.

Niniejszy protokół stanowi serię uznanych metod powiązanych ze sobą w celu umożliwienia ilościowego oznaczenia sRNA w wysokiej czystości HDL za pomocą sekwencjonowania wysokoprzepływowego lub real-time PCR (Rysunek 1). Aby zademonstrować wykonalność i znaczenie tego protokołu, HDL oczyszczono z ludzkiej plazmy za pomocą tandemowej metody DGUC i FPLC. Zebrane frakcje FPLC odpowiadające HDL (na podstawie rozkładu cholesterolu) zostały skoncentrowane, a całkowite RNA wyizolo...

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowe oznaczenie małych niekodujących RNA w oczyszczonych lipoproteinach. Protokół ten może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie lipoprotein, takie jak określenie sygnatur małych RNA lipoprotein w stanie zdrowia i choroby, a także w rozwoju roli małych RNA lipoprotein jako biomarkerów chorób lub sygnałów międzykomórkowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy wysoko oczyszczonych lipoprotein w celu wykrycia zmian w zawartości małych RNA w warunkach chorobowych lub eksperymentalnych.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię chorób kardiometabolicznych, ponieważ zewnątrzkomórkowe RNA stanowią nową klasę biomarkerów chorób, a małe RNA lipoprotein wykazują obiecujący potencjał jako cele terapeutyczne w przyszłych badaniach. Chociaż metoda ta została zaprojektowana dla małych RNA lipoprotein HDL, może zostać ona również dostosowana do małych RNA lipoprotein o bardzo niskiej i niskiej gęstości. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak odpowiedniego sprzętu oraz doświadczenia w przygotowywaniu próbek do ultrawirowania w gradiencie gęstości.Niniejszy protokó

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Poznaj izolację i kwantyfikację małych RNA z lipoprotein o dużej gęstości. Ta metoda pozwala analizować czyste HDL pod kątem zmian RNA w chorobach, otwierając drogę do nowych biomarkerów i celów terapeutycznych w chorobach kardiometabolicznych.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Przeglądaj więcej filmów