Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie małych niekodujących RNA na oczyszczonych lipoproteinach. Protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lipoprotein, takie jak definiowanie sygnatur małych RNA lipoprotein w zdrowiu i chorobie, a także rozwijanie małych RNA lipoprotein jako biomarkerów choroby lub wiadomości między komórkami. Główną zaletą tej techniki jest to, że można analizować lipoproteiny o wysokiej czystości pod kątem niewielkich zmian RNA w chorobie lub warunkach eksperymentalnych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób kardiometabolicznych, ponieważ zewnątrzkomórkowe RNA są nową klasą biomarkerów choroby, a lipoproteiny małe RNA mają ekscytujący potencjał jako cele leków w przyszłych badaniach. Chociaż metoda ta jest przeznaczona dla małych RNA HDL, można ją również dostosować do małych RNA lipoprotein o bardzo niskiej gęstości i niskiej gęstości. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności z powodu braku odpowiedniego sprzętu i wiedzy specjalistycznej w przygotowywaniu próbek do ultrawirowania w gradiencie gęstości.

Protokół ten składa się z uznanych metod połączonych ze sobą w celu ilościowego oznaczania małych RNA na HDL o wysokiej czystości, przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub PCR w czasie rzeczywistym. Ten film dotyczy oczyszczania HDL. Ten protokół zostanie zademonstrowany przez mojego asystenta, Evana Shadari.

Na początek dodaj 90 mikrolitrów 100x przeciwutleniaczy do dziewięciu mililitrów osocza. Następnie dostosuj gęstość osocza do 1,025 grama na mililitr, dodając 0,251 grama bromku potasu na każde dziewięć mililitrów osocza. Kołysz plazmą w temperaturze pokojowej, aż cała sól się rozpuści.

Następnie przenieś osocze do ultra-probówek wirówkowych i upewnij się, że na górze znajduje się warstwa pęcherzyków. Pod plazmą nie powinno być uwięzione powietrze. Następnie przygotuj igłę o rozmiarze 18, dodając zgięcie pod kątem 90 stopni w odległości jednego centymetra od końcówki, ze skośną stroną skierowaną do góry.

Następnie, za pomocą strzykawki i wygiętej igły, ostrożnie umieść trzy mililitry roztworu nakładki numer jeden na osocze. Usuń większość pęcherzyków z powierzchni i pozostaw dwa do trzech milimetrów między łąkotką a krawędzią rurki. Następnie ostrożnie umieść rurki w wiaderkach SW 40 Ti.

Zważ każde wiadro z nakrętkami i dokładnie zrównoważ wiadra, które będą zajmować przeciwne pozycje w wirówce. Następnie umieść wirnik w ultrawirówce i uruchom go przy 274, 400 razy G przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z przerwą ustawioną pośrednio na wartość czterech. Następnego dnia ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i podnieś rurki z wiader.

Następnie powoli usuń dwa mililitry z wierzchniej warstwy nakładki, za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Jest to frakcja VLDL IDL. Następnie zbierz pozostałe siedem mililitrów osocza i przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Zwiększ objętość osocza do dziewięciu mililitrów, dodając roztwór nakładki numer dwa. Następnie dostosuj gęstość do 1,080 grama na mililitr, dodając 0,746 grama bromku potasu. Następnie delikatnie kołysz próbką, aby rozpuścić sól, co zajmie około 20 minut.

Następnie przenieś próbkę do ultra-wirówki bez zatrzymywania powietrza. Upewnij się, że na górze znajduje się warstwa bąbelków. Za pomocą wygiętej igły ostrożnie nałóż trzy mililitry roztworu nakładki numer trzy.

Następnie usuń większość pęcherzyków i ostrożnie załaduj rurki do wiadra SW 40 Ti. Zrównoważ je i obracaj, jak opisano wcześniej, przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie usuń dwa mililitry z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą wygiętej igły.

To jest frakcja LDL. Następnie przenieś pozostałą próbkę do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki i zwiększ objętość do dziewięciu mililitrów roztworem numer cztery. Teraz dostosuj gęstość do 1,30 grama na mililitr, dodając około 3,33 grama bromku potasu i kołysząc próbkę, aż sól się rozpuści.

Następnie przenieś próbkę do ultra-probówki wirówkowej i ostrożnie przelej trzy mililitry roztworu numer pięć. Teraz ultra-odwiruj próbkę jak poprzednio, ale przez 48 godzin. Dwa dni później zbierz dwa górne mililitry nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły.

Stanowi to frakcję HDL. Aby usunąć roztwory o wysokiej zawartości soli, należy przenieść frakcję HDL do mokrego rękawa dializacyjnego z odcięciem masy cząsteczkowej 10 000. Następnie dializuj go przez 24 godziny w litrze jednego XPBS, delikatnie mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Roztwór PBS należy wymienić trzy razy w ciągu 24 godzin. Następnie należy określić stężenie białka we frakcji HDL za pomocą metody BCA. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub egzosomy mają podobną gęstość do małego HDL, a zatem mogą występować w tej samej frakcji gęstości co HDL.

W związku z tym frakcja HDL wymaga dalszego oczyszczania przez FPLC. Bezpośrednio przed użyciem FPLC należy przepuścić 1,2 miligrama frakcji DGUC HDL w 500 mikrolitrach roztworu przez filtr odśrodkowy o wielkości 0,22 mikrona. Pobrać przefiltrowaną próbkę do strzykawki iniekcyjnej FDLC, upewniając się, że nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki powietrza.

Następnie ustaw natężenie przepływu FPLC na 0,3 mililitra na minutę z limitem ciśnienia na poziomie 2,6 megapaskala. Następnie zrównoważ kolumny z 0,2 objętości kolumny bufora. Teraz wstrzyknij próbkę z trzema mililitrami buforu do instrumentu FPLC i rozpocznij bieg.

Zbierz frakcje o pojemności 1,5 mililitra, co daje w sumie 72 frakcje. Zidentyfikuj frakcje FPLC odpowiadające DGUC HDL, określając poziom cholesterolu całkowitego za pomocą zestawu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Spodziewaj się znaleźć od sześciu do siedmiu frakcji FPLC zawierających DGUC HDL.

Zebrać wszystkie frakcje zawierające HDL i zagęścić je za pomocą filtra odśrodkowego o mocy 10 kilodaltonów o temperaturze 4 000 G przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub do momentu, gdy koncentrat HDL osiągnie około 100 mikrolitrów. Następnie zbierz koncentrat HDL i oznacz ilościowo białko metodą BCA. Później użyj tej samej ilości całkowitego białka HDL do wyizolowania RNA.

Osocze ludzkie frakcjonowano metodą FPLC bez stosowania separacji w gradinie gęstości. Sześć frakcji odpowiadało HDL, a sześć lipoproteinie o bardzo niskiej gęstości. Lipidy w kolorze czarnym, cholesterol w kolorze czerwonym i białko w kolorze niebieskim mierzono za pomocą zestawów kolorymetrycznych.

Dla porównania, zastosowanie ultrawirowania w gradiencie gęstości przed FPLC doprowadziło do znalezienia białka lipidowego i cholesterolu prawie wyłącznie we frakcjach HDL. Z HDL pobranego od czterech zdrowych dawców osocza, całkowite RNA wyizolowano i zsekwencjonowano przy użyciu protokołu pojedynczego odczytu 50 par zasad. Rozkład znormalizowanych odczytów ilustruje i wzbogacanie małych RNA wokół 21 i 34 nukleotydów.

Analiza biblioteki wykazała, że 38 procent odczytów pochodziło z mikro RNA, a 37 procent pochodziło z TRNA. Obecne były również różne RNA, rybosomalne RNA, małe RNA, małe jąderkowe RNA i długie niekodujące RNA. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dziesięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując tej procedury, należy pamiętać o walidacji zmian w małym RNA HDL obserwowanych przy sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości inną metodą, taką jak PCR lub northern blot. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak zdolność akceptacji e-strumienia cholesterolu HDL i przeciwzapalne SA HDL, podczas etapów izolacji RNA i etapów przygotowania sekwencjonowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie korelacji między małymi zmianami RNA HDL a funkcją HDL. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się lipidami i lipoproteinami do badania ładunków niezwiązanych z cholesterolem, w szczególności kwasów nukleinowych i chorób metabolicznych, takich jak hipercholesterolemia czy cukrzyca.

I nie zapominaj, że praca z ludzkim osoczem może być niezwykle niebezpieczna i należy przejść odpowiednie szkolenie w zakresie patogenów przenoszonych przez krew, a podczas wykonywania tej techniki należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.