Name: Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj izolację i kwantyfikację małych RNA z lipoprotein o dużej gęstości. Ta metoda pozwala analizować czyste HDL pod kątem zmian RNA w chorobach, otwierając drogę do nowych biomarkerów i celów terapeutycznych w chorobach kardiometabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez nagrody od National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute dla K.C.V. HL128996, HL113039 i HL116263. Praca ta została również wsparta nagrodami American Heart Association dla K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 i R.M.A. POST25710170.

1. Oczyszczanie HDL (~ 5,5 dnia)
<ol>
	<li>Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (DGUC, ~ 5 dni)
	<ol>
		<li>Dodaj 90 μl 100x przeciwutleniaczy do 9 ml osocza wyizolowanego ze świeżej krwi żylnej.</li>
		<li>Dostosuj gęstość osocza za pomocą KBr z 1,006 g/ml do 1,025 g/ml, dodając 0,251 g KBr do 9 ml osocza z kroku 1.1.1 (0,0278 g/ml KBr osocza). Ubijaj plazmę, aż cała sól rozpuści się w temperaturze pokojowej i przenieś do probówek ultrawirówek i upewnij się, że wszystkie pęcherzyki unoszą się do góry.</li>
		<li>Zegnij końcówkę igły 18-G pod kątem 90° 1 cm od końcówki, skośną stroną do góry. Za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 18 ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #1 na osocza (Tabela 1). 
		UWAGA: Wygięta igła zapewnia, że wszystkie VLDL/IDL, LDL i HDL zostaną usunięte bez mieszania z nakładką.</li>
		<li>Usuń większość pęcherzyków u góry, pozostawiając 2 - 3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki i ostrożnie umieść rurki w wiaderkach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważ każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważ z przeciwległym wiadrem (wiadro + nakrętka): #1 do #4, #2 do #5 i #3 do #6. 
		UWAGA: Te wiadra muszą być zawsze wyważone i dopasowane.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja VLDL/IDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.</li>
		<li>Po usunięciu frakcji VLDL/IDL należy zebrać pozostałe 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki do 9 ml za pomocą roztworu nakładającego #2 (Tabela 1).</li>
		<li>Dostosuj gęstość próbki z 1,025 g/ml do 1,080 g/ml za pomocą KBr, używając około 0,746 g KBr w próbce 9 ml lub 0,0828 g/ml KBr próbki. Delikatnie kołysz próbką, aż cała KBr się rozpuści (około 20 min) i przenieś do probówki ultrawirówkowej, upewniając się, że pęcherzyki unoszą się do góry.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #3 na próbkę (Tabela 1). Pozostaw 2-3 mm odstępu od łąkotki do górnej części rurki.</li>
		<li>Usuń większość pozostałych pęcherzyków z górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z hamulcem pośrednim #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Będzie to frakcja LDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C.</li>
		<li>Po usunięciu frakcji LDL należy zebrać pozostałe około 7 ml próbki (osocza) i umieścić ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość próbki (osocza) do 9 ml za pomocą 1,080 g/ml roztworu #4 (Tabela 1).</li>
		<li>Dostosuj gęstość próbki z 1,080 g/ml do 1,30 g/ml za pomocą KBr, używając 3,33 g KBr w próbce 9 ml (osocze) lub 0,37 g KBr na każdy ml próbki. Rozdrabniaj lub lekko mieszaj próbkę, aż cała KBr (sól) zostanie rozpuszczona i przenieś do probówki ultrawirówkowej.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki i igły ostrożnie umieścić 3 ml roztworu nakładki #5 na próbkę (Tabela 1).</li>
		<li>Usuń większość pozostałych pęcherzyków w górnej części probówki, pozostawiając 2-3 mm odstępu od menisku do górnej części probówki i ostrożnie umieść napełnione probówki ultrawirówki w wiadrach SW-40Ti.</li>
		<li>Zważyć każde wiadro (z nakrętkami) na wadze i dokładnie zrównoważyć przeciwległym wiadrem + nakrętką, jak w ppkt 1.1.5.</li>
		<li>Umieść wirnik w ultrawirówce (patrz lista materiałów). Wirować przy 274 400 x g przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z hamulcem #4.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wiadra z wirnika i rurki z wiader.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć około 2 ml z wierzchniej warstwy nakładki za pomocą strzykawki i wygiętej igły. Jest to frakcja HDL, która może być przechowywana w temperaturze 4 °C lub -80 °C. 
		UWAGA: Zgodnie z DGUC HDL można dializować w celu usunięcia roztworów o wysokiej zawartości soli.</li>
		<li>Aby przeprowadzić dializę, należy umieścić pobraną frakcję HDL w szczelnie zamkniętym rękawie dializacyjnym (odcięcie 10 000 m) i dializować przez noc w 1 l 1x PBS. Zmień bufor dializacyjny (1x PBS) 3 razy w ciągu 24 godzin. Delikatne zakłócenie PBS za pomocą mieszadła magnetycznego poprawi dializę.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka w DGUC-HDL przy użyciu metody BCA8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybka chromatografia cieczowa białkowa (FPLC) lub chromatografia wykluczania wielkości (~ 6 h)
	<ol>
		<li>Przefiltrować 1,2 mg DGUC-HDL (białko całkowite) w 500 μl przez mikrofiltr odśrodkowy 0,22 μm (patrz Wykaz materiałów), bezpośrednio przed wstrzyknięciem. 
		UWAGA: W przypadku niektórych próbek może być wymagane dodatkowe filtrowanie próbki DGUC-HDL przez mikrofiltr odśrodkowy 0,45 μm przed filtrem 0,22 μm.</li>
		<li>Pobrać przefiltrowaną próbkę DGUC-HDL, załadować strzykawkę do wstrzykiwań FPLC (napełnić) i upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza przed wstrzyknięciem do FPLC.</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu FPLC na 0.3 ml/min z limitem ciśnienia 2.6 MPa. Zrównoważyć kolumny z objętością 0,2 kolumny (około 15 ml) buforu przed wstrzyknięciem próbki. Wstrzyknąć próbkę z 3 ml buforu do przyrządu FPLC (pętla iniekcyjna) i rozpocząć przebieg. Zbierz 1,5 ml frakcji, co daje w sumie 72 frakcje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie małego RNA (sRNAseq, ~ 9 dni)
<ol>
	<li>Izolacja RNA (~ 1 dzień)
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj frakcje FPLC odpowiadające DGUC-HDL, określając poziom cholesterolu całkowitego za pomocą zestawu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z tej konfiguracji FPLC, spodziewaj się, że znajdziesz 6 - 7 frakcji FPLC zawierających DGUC-HDL.</li>
		<li>Zebrać całą objętość (około 8 -1 0 ml puli 1,45 ml frakcji o objętości 1,45 ml) z frakcji DGUC-HDL FPLC i zagęścić za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 10 kDa m.w. przy 4 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C lub do momentu, gdy koncentrat HDL osiągnie około 100 μl.</li>
		<li>Zebrać koncentrat HDL i określić ilościowo całkowite stężenie białka HDL przy użyciu metody BCA8.</li>
		<li>Oznaczyć najwyższe stężenie białka całkowitego HDL, do 1 mg, które można podać z każdej próbki w zestawie. Na przykład wyizoluj RNA z tej samej ilości białka całkowitego HDL dla każdej próbki.</li>
		<li>Wykonaj izolację RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu (patrz Lista materiałów).
		<ol>
			<li>Dodać 10x objętość odczynnika do lizy fenoli (patrz wykaz materiałów) i wirować przez 1 min.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
			<li>Dodać chloroform (20% objętości odczynnika do lizy fenolu użytego w kroku 2.1.5.1) i energicznie wstrząsać przez 15 s.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 minuty.</li>
			<li>Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.</li>
			<li>Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki, unikając interfazy.</li>
			<li>Dodaj 1,5x objętość 100% etanolu do fazy wodnej i wiruj przez 1 min.</li>
			<li>Próbki należy przechowywać przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
			<li>Kontynuuj korzystanie z protokołu izolacji RNA, korzystając z dostarczonych mini kolumn.</li>
			<li>Eluować za pomocą 30 μl H2O wolnego od RNaz. Najpierw dodać 15 μLH2Obezpośrednio do fryty, wirować z małą prędkością (2 000 x g) przez 2 min, a następnie wirować z dużą prędkością (max) przez 1 min. Powtórzyć ten krok z dodatkowymi 15 μlH2O.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Natychmiast przystąp do generowania biblioteki sRNA lub przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie biblioteki (~ 6 h)
	<ol>
		<li>Przygotuj biblioteki cDNA sRNA przy użyciu protokołu zestawu do generowania biblioteki sRNA, zgodnie z instrukcjami producenta z jedną modyfikacją amplifikacji PCR, jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Przygotować mastermix do PCR na lodzie zawierającym 0,5 μl H2O bez DNaz/RNaz, 15 μl mieszanki PCR (PML) i 1 μL RNA PCR Primer (RP1) na próbkę (dodać dodatkowe 10% w przypadku błędu pipetowania).</li>
			<li>Dodać 16,5 μl mieszaniny PCR do każdej próbki (cDNA).</li>
			<li>Przypisz numer indeksu/kodu kreskowego do każdej próbki w celu multipleksowania i dodaj 1 μl wskaźnika startera PCR (do odpowiedniej liczby) do próbki.</li>
			<li>Wykonaj szybkie wirowanie za pomocą microfuge. 
			UWAGA: Całkowita objętość powinna teraz wynosić 30 μl na próbkę.</li>
			<li>Wykonać warunki cykliczne dla amplifikacji PCR, jak wyszczególniono w tabelach 2 i 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmiar Wybierz bibliotekę sRNA, aby usunąć adapter:Adaptery (~ 1,5 h)
	<ol>
		<li>Dokonaj wyboru rozmiaru biblioteki za pomocą automatycznego selektora rozmiaru DNA zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi parametrami rozmiaru: Cel: 156 pz, Początek: 135 pz, Koniec: 177 pz, Flaga zakresu: Szeroki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie DNA (~0,5 h)
	<ol>
		<li>Oczyść cDNA sRNA o wybranej wielkości zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Elute czyste i skoncentrowane cDNA sRNA za pomocą 2 x 7 μLH2O-wolnychod DNaz/RNaz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo i oceń wydajność i jakość biblioteki cDNA sRNA (~ 1 h)
	<ol>
		<li>Oceń jakość i rozmiar biblioteki cDNA sRNA za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze (Lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Określ ilościowo poszczególne stężenia w bibliotece cDNA sRNA za pomocą testu DNA o wysokiej czułości (lista materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie próbki o różnych indeksach były prowadzone na tym samym torze komory przepływowej, jeśli to możliwe. Jeżeli wymagany jest więcej niż jeden tor, należy odpowiednio wymieszać próbki skrzynkowe i kontrolne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie sRNA (~ 7 dni)
	<ol>
		<li>Puluj indywidualne indeksowane biblioteki sRNA na podstawie stężeń równomolowych.</li>
		<li>Przesiewaj połączone biblioteki sRNA pod kątem jakości za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze i określ stężenie DNA w bibliotece, jak w 2.5.1 - 2.5.2.</li>
		<li>Wykonaj ilościowy PCR (qPCR) zawartości adaptera, aby zapewnić odpowiednią głębokość sekwencjonowania, korzystając z zestawu do kwantyfikacji qPCR z biblioteki sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów).</li>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie przy użyciu pojedynczego odczytu protokołu 50 bp, aby osiągnąć głębokość około 20 - 25 mln odczytów na próbkę, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych (~ 1 dzień)
<ol>
	<li>Użyj bcl2fastq2, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika, aby wstępnie przetworzyć surowe pliki fastq z demultipleksowanymi próbkami (Lista materiałów).</li>
	<li>Użyj Cutadapt, aby przyciąć adaptery9 i usunąć odczyty < długości 16 nukleotydów (nts), zgodnie z instrukcjami instrukcji obsługi (Lista materiałów).</li>
	<li>Usuń sekwencje zanieczyszczeń obecne w bibliotekach sRNA, w tym sekwencję roztworu zatrzymującego (STP: CCACGTTCCCGTGG) i przeniesienie adaptera (CTACAGTCCGACGATC) za pomocą funkcji removeSequenceInFastq w ramach NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wykonuj wskaźniki kontroli jakości przez FastQC przy użyciu narzędzi Centrum Nauk Ilościowych (CQS), zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wygeneruj nienadmiarową listę "identycznych" odczytów (zwiń nadmiarowe odczyty) i zapisz numery kopii za pomocą CQSTools, zgodnie z instrukcjami przewodnika użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Dopasuj odczyty do ludzkiego genomu za pomocą Bowtie1.1.2 pozwalającego na 1 niezgodność (opcje: -a -m 100 --best --strata -v 1), zgodnie z instrukcjami instrukcji użytkownika (Lista materiałów).</li>
	<li>Wykonuj zadania wyrównywania, zliczania i podsumowywania wyników odczytu za pomocą NGSPERL, zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika.</li>
	<li>Konwertuj wyeksportowaną tabelę zliczania na plik arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Normalizuj odczyty określonej klasy (np. miRNA) do całkowitej liczby odczytów dla tej klasy (np. całkowitej liczby odczytów miRNA) i zgłaszaj sygnały jako odczyty na zmapowane miRNA (RPMM). (np. RPMM =(miR-X/Całkowita liczba odczytów # miRNA)*1 000 000).</li>
	<li>Wprowadź znormalizowaną tabelę zliczania jako ogólną technologię jednokolorową do oprogramowania do analiz różnicowych niskiego i wysokiego poziomu zgodnie z instrukcjami podręcznika użytkownika (Lista materiałów). 
	UWAGA: Obecnie nie ma dobrze scharakteryzowanych genów/sRNA dla HDL-sRNA. Można zastosować kontrolę skokową, ale może to być problematyczne. Zaleca się normalizację do całkowitego dopływu lub objętości białka HDL. Co najważniejsze, zaleca się walidację wyników sekwencjonowania za pomocą jednej z różnych strategii ilościowego oznaczania miRNA i sRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowego PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)"> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs%2C+snoRNAs%2C+snRNAs%2C+and+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li>
<li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8(2014).</li>
<li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li>
<li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization%3A+evaluation+of+ultracentrifugation%2C+density-gradient+separation%2C+and+immunoaffinity+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li>
<li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164(2015).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li>
<li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li>
<li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li>
<li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145(2011).</li>
<li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten ma na celu ilościowe określanie miRNA i innych sRNA poprzez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości lub PCR w czasie rzeczywistym na HDL o wysokiej czystości. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia, należy zwrócić szczególną uwagę na każdy etap procesu oczyszczania HDL i RNA, a następnie ilościowego określania sRNA. Protokół ten jest przeznaczony dla projektów rozpoczynających się od ≥ 2 ml osocza. Niemniej jednak, wysokiej jakości analizy RNA można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą HDL oczyszczon...

Zewnątrzkomórkowe, niekodujące małe RNA (sRNA) reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i potencjalnych celów terapeutycznych i prawdopodobnie ułatwiają komunikację między komórkami1. Najszerzej badanym typem sRNA są mikroRNA (miRNA), które mają około 22 nt długości i są przetwarzane z dłuższych form prekursorowych i pierwotnych transkryptów2. Wykazano, że miRNA regulują ekspresję genów po transkrypcji poprzez supresję translacji białek i indukcję degradacji mRNA2. Niemniej jednak miRNA to tylko jeden z wielu rodzajów sRNA; ponieważ sRNA mogą być rozszczepiane od macierzystych tRNA (sRNA pochodzących z tRNA, tDR), małych jądrowych RNA (sRNA pochodzących z sRNA, sndRNA), małych jąderkowych RNA (sRNA pochodzących z snoRNA, snRNA), rybosomalnych RNA (sRNA pochodzących z rRNA, rDR), Y RNA (yDR) i innych różnych RNA1. Doniesiono, że kilka przykładów tych nowych sRNA działa podobnie do miRNA; jednak funkcje biologiczne wielu z tych sRNA pozostają do ustalenia, chociaż role w regulacji genów są prawdopodobnie3-6. Co najciekawsze, miRNA i inne sRNA są stabilnie obecne w płynach zewnątrzkomórkowych, w tym w ślinie, osoczu, moczu i żółci. Zewnątrzkomórkowe sRNA są prawdopodobnie chronione przed RNazami poprzez ich powiązanie z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV), lipoproteinami i / lub zewnątrzkomórkowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi.
Poprzednio informowaliśmy, że lipoproteiny, czyli lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL), transportują miRNA w osoczu7. W tym badaniu HDL wyizolowano przy użyciu sekwencyjnej metody ultrawirowania w gradiencie gęstości (DGUC), szybkiej chromatografii cieczowej białek (filtracja żelowa chromatografia z wykluczeniem wielkości, FPLC) i chromatografii powinowactwa (immunoprecypitacja anty-apolipoproteiny A-I (apoA-I)7. Korzystając zarówno z macierzy o niskiej gęstości opartych na PCR w czasie rzeczywistym, jak i indywidualnych testów miRNA, określono ilościowo poziomy miRNA na HDL wyizolowanym od osób zdrowych i z hipercholesterolemią7. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie profilować miRNA i określić ilościowo określone miRNA w wysoce czystych preparatach HDL. Od 2011 roku ustaliliśmy, że chociaż chromatografia powinowactwa zwiększa czystość HDL, nasycenie przeciwciałami znacznie ogranicza wydajność i może być zbyt kosztowne. Obecnie nasz protokół zaleca dwuetapową sekwencyjną metodę tandemową DGUC, po której następuje FPLC, która wytwarza również wysokiej jakości próbki HDL do dalszej izolacji RNA i kwantyfikacji sRNA. Ze względu na ostatnie postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu sRNA (sRNAseq), np. miRNA, oraz zwiększoną świadomość innych klas sRNA innych niż miRNA, sRNAseq jest aktualnym stanem wiedzy w profilowaniu miRNA i sRNA. W związku z tym nasz protokół zaleca ilościowe oznaczanie miRNA i innych sRNA na próbkach HDL przy użyciu sRNAseq. Niemniej jednak całkowite RNA wyizolowane z HDL można również wykorzystać do ilościowego oznaczania pojedynczych miRNA i innych sRNA lub walidacji wyników sRNAseq przy użyciu metod PCR w czasie rzeczywistym. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół zbierania, oczyszczania, kwantyfikacji, analizy danych i walidacji HDL-sRNA o wysokiej czystości.
Ogólnym celem tego artykułu jest pokazanie wykonalności i procesu kwantyfikacji sRNA w wysoce czystym HDL wyizolowanym z ludzkiego osocza.

<table><tbody><tr><td>Ultrawirówka&nbsp;</td><td>Redlica Beckman</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Rotor</td><td>Redlica Beckman</td><td>331362</td><td>SW-41Ti AKTA</td></tr><tr><td>Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Kolumny zwiększające Liniowe</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Blat wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (zakupiona przez USA Scientific)</td></tr><tr><td>Mikrofuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Test DNA o wysokiej czułości</td> Biblioteka sekwencjonowania <td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler ProFlex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Bromek potasu</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtry mikroodśrodkowe 0,45 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Filtry mikroodśrodkowe 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation</td> Kit <td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol zestaw kolorymetryczny</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10 000 mW filtr wirujący z odcięciem</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>zakupiony za pośrednictwem</td></tr><tr><td>probówek paskowych</td> Millipore PCR <td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>zakupiony za pośrednictwem firmy Fisher</td></tr><tr><td>Zestaw microRNA RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Na 1000 reakcji</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>butelka 50 ml</td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Clean and Concentrator Rurki do dializy</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum</td><td>Labs</td><td>132118</td><td>zakupione za pośrednictwem firmy Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego rna

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Różnorodność małych niekodujących RNA (sRNA) szybko się powiększa i wyłania się ich rola w procesach biologicznych, w tym w regulacji genów. Co najciekawsze, sRNA znajdują się również na zewnątrz komórek i są stabilnie obecne we wszystkich płynach biologicznych. W związku z tym zewnątrzkomórkowe sRNA reprezentują nową klasę biomarkerów choroby i prawdopodobnie biorą udział w sygnalizacji komórkowej i sieciach komunikacji międzykomórkowej. Aby ocenić ich potencjał jako biomarkerów, sRNA można określić ilościowo w osoczu, moczu i innych płynach. Niemniej jednak, aby w pełni zrozumieć wpływ zewnątrzkomórkowych sRNA jako sygnałów endokrynologicznych, ważne jest określenie, którzy nośniki transportują je i chronią w płynach biologicznych (np. Osoczu), które komórki i tkanki przyczyniają się do zewnątrzkomórkowych pul sRNA oraz komórki i tkanki zdolne do przyjmowania i wykorzystywania zewnątrzkomórkowego sRNA. Aby osiągnąć te cele, konieczne jest wyizolowanie wysoce czystych populacji nośników zewnątrzkomórkowych w celu profilowania i kwantyfikacji sRNA. Wcześniej wykazaliśmy, że lipoproteiny, szczególnie lipoproteiny o dużej gęstości (HDL), transportują funkcjonalne mikroRNA (miRNA) między komórkami, a HDL-miRNA są znacząco zmienione w chorobie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowy protokół, który wykorzystuje tandemową izolację HDL z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości (DGUC) i szybką chromatografią białkowo-cieczową (FPLC) w celu uzyskania wysoce czystego HDL do dalszego profilowania i kwantyfikacji wszystkich sRNA, w tym miRNA, przy użyciu zarówno sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, jak i podejść PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten będzie cennym źródłem do badania sRNA na HDL.

Niniejszy protokół stanowi serię uznanych metod połączonych w celu umożliwienia ilościowego oznaczenia sRNA w wysokiej czystości HDL za pomocą sekwencjonowania wysokoprzepustowego lub PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 1). Aby wykazać wykonalność i wpływ tego protokołu, HDL oczyszczono z ludzkiej plazmy za pomocą tandemowej metody DGUC i FPLC. Zebrane frakcje FPLC odpowiadające HDL (na podstawie rozkładu cholesterolu) zostały skoncentrowane, a całkowite RNA wyizolowano z ...

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowe oznaczenie małych niekodujących RNA w oczyszczonych lipoproteinach. Protokół ten może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie lipoprotein, takie jak określenie sygnatur małych RNA lipoprotein w stanie zdrowia i choroby, a także w rozwoju roli małych RNA lipoprotein jako biomarkerów chorób lub sygnałów międzykomórkowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy wysoko oczyszczonych lipoprotein w celu wykrycia zmian w zawartości małych RNA w warunkach chorobowych lub eksperymentalnych.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię chorób kardiometabolicznych, ponieważ zewnątrzkomórkowe RNA stanowią nową klasę biomarkerów chorób, a małe RNA lipoprotein wykazują obiecujący potencjał jako cele terapeutyczne w przyszłych badaniach. Chociaż metoda ta została zaprojektowana dla małych RNA lipoprotein HDL, może zostać ona również dostosowana do małych RNA lipoprotein o bardzo niskiej i niskiej gęstości. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak odpowiedniego sprzętu oraz doświadczenia w przygotowywaniu próbek do ultrawirowania w gradiencie gęstości.Niniejszy protokół składa się z zestawu uznanych metod służących do ilościowego oznaczenia małych RNA w wysokiej czystości HDL, z wykorzystaniem sekwencjonowania wysokoprzepustowego lub techniki real-time PCR. Niniejszy film dotyczy oczyszczania HDL. Protokół zostanie zaprezentowany przez mojego asystenta, Evana Shadariego.W celu rozpoczęcia należy dodać 90 µL przeciwutleniaczy 100x do dziewięciu mililitrów osocza. Następnie należy dostosować gęstość osocza do 1,025 g/mL, dodając 0,251 g bromku potasu do każdych dziewięciu mililitrów osocza. Osocze należy mieszać na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia soli.Następnie przenieś osocze do probówek do ultrawirówki i upewnij się, że na górze znajduje się warstwa pęcherzyków. Pod osoczem nie powinno być uwięzionego powietrza. Następnie przygotuj igłę o rozmiarze 18 G, wykonując zagięcie pod kątem 90 stopni w odległości jednego centymetra od końcówki, tak aby strona ścięta była skierowana do góry.Następnie, używając strzykawki z zagiętą igłą, ostrożnie nanieś trzy mililitry roztworu nakładki numer jeden na plazmę. Usuń większość pęcherzyków powietrza z powierzchni, pozostawiając dwa do trzech milimetrów odstępu między meniskiem a krawędzią probówki. Następnie ostrożnie umieść probówki w koszykach SW 40 Ti.Zważ każdy koszyk wraz z nakrętkami i precyzyjnie zrównoważ koszyki, które będą umieszczone w przeciwstawnych pozycjach w wirówce. Następnie umieść rotor w ultrawirówce i prowadź wirowanie przy 274 400 ×g przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ustawiając hamowanie na wartość pośrednią równą cztery. Następnego dnia ostrożnie wyjmij koszyki z rotora i wyjmij probówki z koszyków.Następnie, powoli pobierz dwa mililitry z górnej warstwy nadlewki, używając strzykawki i zgiętej igły. Jest to frakcja VLDL IDL. Następnie zbierz pozostałe siedem mililitrów osocza i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Uzupełnij objętość plazmy do dziewięciu mililitrów, dodając roztwór nakładkowy nr 2. Następnie dostosuj gęstość do 1,080 g/ml, dodając 0,746 g bromku potasu. Następnie delikatnie kołysz próbkę, aby rozpuścić sól, co zajmie około 20 minut.Następnie przenieś próbkę do probówki do ultrawirówki, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że na górze utworzyła się warstwa pęcherzyków. Za pomocą zagiętej igły ostrożnie nanieś trzy mililitry roztworu nakładkowego numer trzy.Następnie usuń większość pęcherzyków powietrza i ostrożnie umieść probówki w koszyku SW 40 Ti. Zrównoważ je i wiruj zgodnie z wcześniejszym opisem przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie pobierz dwa mililitry z górnej warstwy naddatku za pomocą zgiętej igły.Jest to frakcja LDL. Następnie przenieś pozostałą próbkę do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i uzupełnij objętość do 9 ml za pomocą roztworu nr 4. Teraz dostosuj gęstość do 1,30 g/ml, dodając około 3,33 g bromku potasu i delikatnie mieszając próbkę aż do rozpuszczenia soli.Następnie przenieś próbkę do probówki do ultrawirówki i ostrożnie dodaj trzy mililitry roztworu numer pięć. Teraz poddaj próbkę ultrawirówce w taki sam sposób jak poprzednio, ale przez 48 godzin. Po dwóch dniach pobierz górne dwa mililitry naddatku za pomocą strzykawki i zagiętej igły.Stanowi to frakcję HDL. Aby usunąć roztwory o wysokim zasoleniu, należy przenieść frakcję HDL do zwilżonego rękawa dializacyjnego o progu odcięcia 10 000 Da. Następnie dializować ją przez 24 godziny w jednym litrze 1x PBS przy łagodnym mieszaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Trzykrotnie wymień roztwór PBS w ciągu 24 godzin. Następnie wyznacz stężenie białka w frakcji HDL metodą BCA. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, lub egzosomy, mają gęstość zbliżoną do małych HDL, a zatem mogą występować w tej samej frakcji gęstości co HDL.W związku z tym frakcja HDL wymaga dalszego oczyszczania za pomocą FPLC. Bezpośrednio przed użyciem FPLC należy przepuścić 1,2 mg frakcji HDL z DGUC w 500 µL roztworu przez filtr wirówkowy o rozmiarze oczek 0,22 µm. Przefiltrowaną próbkę należy zebrać do strzykawki wstrzykiwanej do FPLC, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Następnie ustaw prędkość przepływu FPLC na 0,3 milliliters per minute przy limicie ciśnienia wynoszącym 2,6 megapascals. Potem przeprowadź równoważenie kolumn za pomocą 0,2 objętości kolumny buforu. Teraz wstrzyknij próbkę wraz z trzema milliliters buforu do urządzenia FPLC i rozpocznij pomiar.Zbierz frakcje o objętości 1,5 ml, aż do uzyskania łącznie 72 frakcji. Zidentyfikuj frakcje FPLC odpowiadające DGUC HDL, określając całkowity poziom cholesterolu za pomocą zestawu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcją producenta. Przewiduje się znalezienie od sześciu do siedmiu frakcji FPLC zawierających DGUC HDL.Połącz wszystkie frakcje zawierające HDL i zagęstnij je, używając wirówki z filtrem o progu odcięcia 10 kilodalton przy 4 000 ×g przez godzinę w temperaturze 4 °C lub do momentu, aż objętość koncentratu HDL wyniesie około 100 µL. Następnie pobierz koncentrat HDL i określ ilość białka metodą BCA. Później wykorzystaj tę samą ilość całkowitego białka HDL do izolacji RNA.Osocze ludzkie zostało poddane frakcjonowaniu za pomocą FPLC bez zastosowania separacji w gradiencie gęstości. Sześć frakcji odpowiadało HDL, a sześć lipoproteinom o bardzo niskiej gęstości. Poziom lipidów (kolor czarny), cholesterolu (kolor czerwony) oraz białek (kolor niebieski) zmierzono przy użyciu zestawów kolorymetrycznych.W ramach porównania, zastosowanie ultrawirówkowania w gradiencie gęstości przed FPLC doprowadziło do wykrycia białek lipidowych i cholesterolu niemal wyłącznie w frakcjach HDL. Z HDL pobranych od czterech zdrowych dawców osocza wyizolowano całkowite RNA i zsekwencjonowano je przy użyciu protokołu pojedynczego odczytu o długości 50 par zasad. Rozkład znormalizowanych odczytów ilustruje wzbogacenie w małe RNA o długości około 21 i 34 nukleotydów.Analiza biblioteki wykazała, że 38 procent odczytów stanowiły mikroRNA, a 37 procent pochodziło z tRNA. Obecne były również różnorodne RNA, rybosomalne RNA, małe RNA, małe jądrowe RNA oraz długie niekodujące RNA. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dziesięciu dni.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o walidacji zmian w małych RNA HDL zaobserwowanych w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym za pomocą innej metody, takiej jak PCR lub blotting północny. Po zastosowaniu tej procedury, podczas etapów izolacji RNA i przygotowania do sekwencjonowania, można przeprowadzić inne analizy, takie jak pomiar pojemności akceptacji e-flux cholesterolu HDL oraz przeciwzapalne SAs HDL, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w celu ustalenia korelacji między zmianami w małych RNA HDL a funkcją HDL. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny lipidów i lipoprotein do badania ładunku innego niż cholesterol, w szczególności kwasów nukleinowych i chorób metabolicznych, takich jak np. hipercholesterolemia czy cukrzyca.I nie zapomnijcie, że praca z ludzką plazmą może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy przejść odpowiednie szkolenie w zakresie patogenów przenoszonych przez krew oraz stosować właściwe środki ochrony indywidualnej podczas wykonywania tej techniki.

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Poznaj izolację i kwantyfikację małych RNA z lipoprotein o dużej gęstości. Ta metoda pozwala analizować czyste HDL pod kątem zmian RNA w chorobach, otwierając drogę do nowych biomarkerów i celów terapeutycznych w chorobach kardiometabolicznych.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Przeglądaj więcej filmów