Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja małych cząsteczek, które są zdolne do zakłócania interakcji między kanałami TRIP8b i HCN. Metoda ta identyfikuje cząsteczki kandydujące, które mogą zostać opracowane w nowych metodach leczenia depresji. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać w sposób o wysokiej przepustowości.

Technika ta ma implikacje dla rozwoju nowej terapii dużych zaburzeń depresyjnych, ponieważ nasze laboratorium wykazało, że zakłócenie wiązania TRIP8b z HCN może przynieść korzyści terapeutyczne. Chociaż metoda ta została opracowana z myślą o depresji, zakłócenie interakcji między TRIP8b i HCN może przynieść korzyści terapeutyczne w innych zaburzeniach, takich jak przewlekły ból. Wizualna demonstracja tego protokołu jest ważna, ponieważ ilustruje korzyści płynące z używania zautomatyzowanych instrumentów o wysokiej przepustowości do rozwoju badań podstawowych i translacyjnych w otwartych obiektach, takich jak laboratorium analityczne o wysokiej przepustowości Uniwersytetu Northwestern.

Po oczyszczeniu fragmentu białka TRIP8b 241-602 i zbadaniu interakcji białek białkowych z kontrolą pozytywną zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić podwielokrotności TRIP8b i HCN1-FITC i przechowywać je na lodzie. Użyj buforu FP, aby przygotować 20 mililitrów 2 mikromolowych TRIP8b i 50 nanomolowych HCN1-FITC. Następnie dozować 25 mikrolitrów mieszaniny do każdego dołka czarnej płytki do mikromiareczkowania o niskim poziomie wiązania 384 dołków.

Do badań przesiewowych w bibliotece użyj urządzenia do obsługi cieczy akustycznej, aby dozować 100 nanolitrów związków do każdej studzienki kolumn od 3 do 22, aby uzyskać końcowe stężenie 40 mikromoli. Dozować 100 nanolitrów DMSO do każdej studzienki kolumn 1 i 23 jako kontrole ujemne. Dozować 100 nanolitrów nieznakowanego peptydu HCN1 do każdej studzienki kolumn 2 i 24 jako kontrole pozytywne o końcowym stężeniu 10 mikromoli.

Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Za pomocą czytnika płytek zmierz polaryzację fluorescencji. Alternatywnie płytki można przechowywać przez 16 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed odczytem.

Korzystając z poniższego równania, oblicz procentową inhibicję, gdzie XN jest znormalizowanym procentem zahamowania odpowiadającym sygnałowi, X.X dodatni jest średnim sygnałem z dołków kontroli dodatniej, a X ujemny jest średnim sygnałem z dołków kontroli ujemnej. Aby zwalidować trafienia z ponad 50% inhibicją, przygotuj główną mieszankę 20 mililitrów 2 mikromolowych TRIP8b i 50 nanomolowych HCN1 TAMRA w buforze FP. Dozować 25 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka czarnej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Następnie dodaj 100 nanolitrów związków z płytki zawierającej dwukrotne seryjne rozcieńczenia każdego związku aktywnego do odpowiednich studzienek. Do studzienek kontroli ujemnej dodaj 100 nanolitrów DMSO. W celu kontroli pozytywnej dodaj 100 nanolitrów seryjnie rozcieńczanego, nieznakowanego peptydu HCN1 o końcowych stężeniach w zakresie od 200 mikromoli do 0,1 mikromola.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny lub w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Za pomocą czytnika płytek zmierz polaryzację fluorescencji. Oblicz wartości IC50, dopasowując dane FP zależne od stężenia każdego związku przy użyciu 4-parametrowego modelu regresji nieliniowej.

Rozmrozić po jednej porcji każdego z oznaczonych HIS TRIP8b i GST białek fuzyjnych HCN1 i trzymaj je na lodzie. Przygotuj 1 mililitr 200 nanomolowych HIS TRIP8b i 20 nanomoli GST-HCN1C40 w buforze testowym dla każdego badanego związku. Użyj 16-kanałowej pipety, aby dodać 7 mikrolitrów mieszaniny HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 do trzech dołków w rzędzie rzędów od A do N, aby przetestować każdy związek w trzech powtórzeniach.

Krótko odwirować płytkę, aby upewnić się, że płyny znajdują się na dnie każdej studzienki i usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie dozuj związki Hit, które mają być testowane, do płytki, aby osiągnąć końcowe stężenie 200 mikromoli w rzędzie A i kończąc na 0,1 mikromola w rzędzie L. Dodaj taką samą objętość DMSO do rzędu M. Następnie dozuj nieznakowany peptyd HCN1 do końcowego stężenia 10 mikromoli do rzędu N. Potrząsaj płytką przez dwie minuty i inkubuj przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Używając buforu testowego, rozcieńczyć kulki akceptora anty-GST od 1 do 50.

Za pomocą pipety 16-kanałowej dodaj 3,5 mikrolitra rozcieńczonych kulek akceptorowych do każdego dołka płytki i wymieszaj, delikatnie pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę. Rozcieńczyć kulki donorowe chelatu niklu od 1 do 50 buforem do oznaczania, nie wystawiając mieszaniny na działanie światła.

Dodaj 3,5 mikrolitra rozcieńczonych kulek donorowych do każdego dołka płytki i delikatnie wymieszaj, unikając pęcherzyków powietrza. Zamknij płytkę i inkubuj ją w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Następnie za pomocą czytnika płytek odczytaj tabliczkę z podanymi tutaj parametrami pomiarowymi.

Na koniec oblicz wartości IC50, dopasowując dane dla każdego związku przy użyciu 4-parametrowego modelu regresji nieliniowej. Aby ocenić interakcję z HCN1, TAMRA TRIP8b miareczkowano do stałego stężenia HCN1 TAMRA. Ten wykres pokazuje, że wraz ze wzrostem stężenia TRIP8b więcej cząsteczek HCN1 TAMRA zostaje związanych i zwiększa się polaryzacja.

W tym eksperymencie, gdy nieznakowany HCN1 został miareczkowany do stałego stężenia TRIP8b i HCN1 TAMRA, znakowany peptyd został przemieszczony, a sygnał zmniejszył się. Badanie przesiewowe o wysokiej przepustowości pokazuje procentową inhibicję każdego związku reprezentowaną przez pojedyncze punkty na wykresie. Wyniki tego badania przesiewowego są wykreślane z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi oraz średnim procentowym hamowaniem każdego związku w dwóch seriach testu.

Związki wykazujące więcej niż 50% inhibicję zostały następnie zwalidowane w tym eksperymencie. Współrzędne X i Y zostały określone przez procentową inhibicję w dwóch przebiegach testu. W tym eksperymencie HCN1C40 zawiera końcowy znacznik GST, który wiąże koraliki akceptora.

Interakcja domen TPR TRIP8b i końcowego tripeptydu C HCN1 wzbudza koralik donorowy światłem o długości fali 680 nanometrów w celu wytworzenia tlenu singletowego. Wreszcie, jak pokazano na tym wykresie, miareczkowanie rosnących stężeń związku trafienia NUCC-5953 do stałego stężenia TRIP8b i HCN1C40 zwiększyło hamowanie oddziaływania TRIP8b HCN1. Przed rozpoczęciem wysokoprzepustowych badań przesiewowych należy zwalidować preparat białkowy i polaryzację fluorescencji w testach zbliżeniowych opartych na kulkach.

Upewnij się, że białko jest wysokiej czystości. Podwielokrotność białka w celu uniknięcia wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Ważne jest, aby używać wysokiej jakości odczynników, w tym świeżych DMSO i Triton.

Nie zapominaj, że praca z DMSO może być niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektrofizjologia i cytometria przepływowa, w celu określenia, czy trafione związki mają aktywność w komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ekran o wysokiej przepustowości z testem opartym na polaryzacji fluorescencyjnej.