Name: Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj nową technikę obrazowania chemiluminescencyjnego z użyciem kompleksu ruteniu, która zapewnia wyższy stosunek sygnału do szumu niż tradycyjne metody optyczne. Ta metoda umożliwia precyzyjne obrazowanie chorób, w tym nowotworów, podczas zabiegów chirurgicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Janowi Grimmowi i panu Travisowi Shafferowi za ich pomocne dyskusje oraz panu Davidowi Gregory'emu za redakcję rękopisu. Usługi techniczne świadczone przez MSK Animal Imaging Core Facility, wspierane częściowo przez NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, są z wdzięcznością. Autorzy dziękują NIH (K25 EB016673 i R21 CA191679, T.R. i 4R00CA178205-02, B.M.Z.), MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), Tow Foundation (B.C.) oraz National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) za ich hojne wsparcie. Badania opisane w tej publikacji były finansowane przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie opisane eksperymenty in vivo na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem i zgodnie z etycznymi wytycznymi Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Budowa urządzenia nebulizującego
<ol>
	<li>Przymocuj drewnianą część A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm3) pionowo na środku części B (12.7 x 10.7 x 1.8 cm3) za pomocą dwóch (4 x 25 mm2). Przymocuj drewnianą część C (11 × 2.5 × 1.8 cm3) do środka części A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm3) za pomocą jednej, tak aby część C (11 x 2.5 x 1.8 cm3) można było nadal przesuwać. Zobacz rysunek 1.</li>
	<li>Wywierć dwa otwory w dolnej końcówce spustu butelki z rozpylaczem plastikowego mini opryskiwacza o pojemności 3 uncji (D) i przepchnij pręt ze stali nierdzewnej (10 cm ze stali 1/16") (E), aby utworzyć dwie pętle, po jednej z każdej strony spustu.</li>
	<li>Owiń dolną część butelki z rozpylaczem taśmą klejącą (F), aby zapobiec zsuwaniu się opasek kablowych. Przymocuj butelkę z rozpylaczem do drewnianej części C (11 x 2.5 x 1.8 cm3) za pomocą dwóch plastikowych opasek kablowych (28 cm) (G).</li>
	<li>Odetnij serwomotor 011 (I) i podłącz go ponownie luźnymi serwosterowania (H). Następnie przymocuj serwomotor do górnej części drewnianej części A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm3) za pomocą taśmy klejącej.</li>
	<li>Przymocuj ołówek (J) do dźwigni serwomotoru za pomocą spinacza do papieru (K). Szczelnie połącz skrajne części ołówka z pętlami pręta stalowego za pomocą drutów skręcanych pokrytych plastikiem (L) i zabezpiecz końce ołówka taśmą klejącą.</li>
	<li>Odetnij złącze magnetycznego jednostki sterującej serwomotorem (M) i podłącz je ponownie do głośnikowego (N). Następnie przyklej jednostkę sterującą serwomotorem do drewnianej części B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm3). Przetnij w1 ze złączami magnetycznymi na pół i przymocuj jedną część do luźnego końca miedzianego głośnikowego (1 m). Podłącz (magnetyczny) przełącznik dwustabilny i2 i zasilanie p1 do dostępnego w1 i baterii 9V.</li>
</ol>
2. Określanie czułości metody
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml przygotować roztwory [Ru(bpy)3]Cl2 w wodzie z odwróconej osmozy (100 μL) w ilości 260 μg (347 nmol), 52 μg (69 nmol), 26 μg (34 nmol), 5 μg (6,9 nmol), 3 μg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol) i 3 ng (3,5 pmol).</li>
	<li>Zmieszać 100 μl każdego roztworu [Ru(bpy)3]Cl2 ze 100 μl wodnego roztworu amonowo-cerowego azotanu ((NH4)2Ce(NO3)6) w wodzie (25 mM) na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Skonfiguruj akwizycję w czytniku bioluminescencji, inicjując oprogramowanie do obrazowania.
	<ol>
		<li>Zaloguj się do profilu użytkownika i poszukaj panelu sterowania pozyskiwaniem. Kliknij "Zainicjuj" i poczekaj, aż instrument będzie gotowy.</li>
		<li>Poszukaj opcji "Tryb obrazowania" i upewnij się, że "Luminescencyjny" i "Zdjęcie" są zaznaczone, a opcja "Fluorescencyjna" nie jest zaznaczona.</li>
		<li>Zmień ustawienie "Czas ekspozycji" dla "Oprawy luminescencyjnej" na 20 s. Ustaw pozostałe ustawienia dla "Oprawy luminescencyjnej" w następujący sposób: "Binning": średni; "F/stop": 1; i "Filtr emisyjny": Open. 
		UWAGA: Może być konieczne dostosowanie czasów naświetlania zgodnie z zastosowanym oprzyrządowaniem i ustawieniami eksperymentalnymi, jeśli różnią się od przedstawionej konfiguracji.</li>
		<li>W polu "Zdjęcie" użyj następujących ustawień: "Czas ekspozycji": automatyczny; "Binning": średni; i "F/stop": 8. Dostosuj "Wysokość obiektu" zgodnie z celem obrazowania. Poszukaj menu rozwijanego "Pole widzenia". Początkowe ustawienie to "C." Zmień na "B" (odległość 14 cm między kamerą a stolikiem na próbki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw nebulizator, umieszczając mikroskopijne szkiełko na arkuszu czarnego papieru budowlanego na podłodze komory obrazowania, aby chronić go przed czynnikiem utleniającym. Zmieszać 100 μl kropli [Ru(bpy)3]Cl2-roztworu ze 100 μl wodnego roztworu (NH4)2Ce(NO3)6. Zwróć uwagę na celownik w zielonym polu.
	<ol>
		<li>Umieść obiekt obrazowania na czarnym papierze konstrukcyjnym w taki sposób, aby obszar zainteresowania znajdował się w środku krzyżyka z zielonym światłem wyświetlanym na stoliku z próbką. Przygotuj nebulizator, odłączając plastikową butelkę z rozpylaczem od drewnianego wspornika. Wlej roztwór trietyloaminy (1:3 w wodzie/etanolu) do plastikowego zbiornika i ponownie przymocuj go do drewnianego wspornika.</li>
		<li>Umieść nebulizator w czytniku bioluminescencji i upewnij się, że przewód zasilający jest odłączony od przewodu nebulizatora. Upewnij się, że wyłącznik zasilania jest włączony, przełącznik dwustabilny jest wyłączony, a czerwona dioda LED świeci. Umieść nebulizator w taki sposób, aby strumień aerozolu był skierowany w stronę obszaru zainteresowania na obrazowanym obiekcie, jednocześnie minimalizując przeszkody w view z aparatu w kierunku obrazowanego obiektu przez głowicę dyszy rozpylającej.</li>
		<li>Umieść małe, czarne kawałki papieru budowlanego na wszelkich potencjalnych gorących punktach (np. białych śladach na mikroskopijnych szkiełkach lub miejscach wstrzyknięć), aby chronić je przed rozpryskami. Umieść co najmniej 40 cm przewodu zdalnego sterowania nebulizatorem wewnątrz komory obrazowania, tak aby nie kolidował z obiektem obrazowania, nebulizatorem ani magnetycznym zatrzaskiem drzwi. Zamknij drzwiczki systemu obrazowania. 
		UWAGA: Celownik zmieni rozmiar w oparciu o ustawienie "Pole widzenia" w "Żywym obrazie; " upewnij się, że jest to ustawione na "B".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obraz, inicjując sekwencję obrazowania. Kliknij "Pobierz" w "Panelu sterowania akwizycją". W pierwszej sekwencji obrazowania włącz automatyczne zapisywanie, jeśli jest to pożądane (zalecane) i wybierz folder danych. Zignoruj okno dialogowe "Edytuj etykiety obrazowania" do końca sekwencji. 
	UWAGA: Oprogramowanie sterujące wyświetla działania przyrządu krok po kroku w czasie rzeczywistym. Po przygotowaniu pomiaru i przesunięciu stolika na próbkę do właściwej pozycji, otwiera migawkę kamery i odlicza czas pomiaru. Otwarcie migawki może być również słyszalne przez dźwięk kliknięcia generowany przez maszynę.</li>
	<li>Gdy migawka się otwiera, rozpyl trzy serie roztworu trietyloaminy (1:3 w wodzie/etanolu, 0,24 ± 0,04 ml na serię rozpylania), przełączając trzykrotnie przełącznik, aby wytworzyć chemiluminescencję. 
	UWAGA: Sample stage będzie się przesuwał podczas pomiaru. Pozostaw wystarczającą ilość (minimum 40 cm) wewnątrz instrumentu, aby to umożliwić. Upewnij się, że roztwór, który ma być rozpylany przez nebulizator, może być zasysany przez rurę wstępującą i że w rurze nie ma pęcherzyków powietrza. Na wypadek potrzeby przygotuj kilka zapasowych baterii do nebulizatora.</li>
</ol>
3. Obrazowanie in vivo po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu dożylnym
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przygotować 100 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającego od 8 do 33 nmol [Ru(bpy)3]Cl2. W tym samym czasie przygotować wodny roztwór (NH4)2Ce(NO3)6 w wodzie (25 mM).</li>
	<li>Wstrzyknąć dożylnie 100 μl [Ru(bpy)3]Cl2 do żyły ogonowej zdrowych myszy (n = 5).</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji 10 minut po wstrzyknięciu przez uduszenie CO2 .
	<ol>
		<li>Usuń skórę z wycięciem w kształcie litery Y z tułowia, a następnie usuń łuk żebrowy w kształcie litery U, aby odsłonić serce i płuca. Przeprowadź fuzję myszy, wycinając ujście w prawym przedsionku i wstrzykując 20 ml PBS przez igłę o rozmiarze 24 do lewej komory18. Ostrożnie przeciąć skórę brzucha i odsłonić nerkę i wątrobę. Przeciąć wzdłużnie przez narządy, aby uzyskać widoczne cięcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj pobieranie zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.6 z następującymi zmianami.
	<ol>
		<li>Po dokładnym umyciu plastikowego zbiornika nebulizatora napełnij go roztworem (NH4)2Ce(NO3)6 w wodzie (25 mM) zamiast trietyloaminy. 
		UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie wypłukać dyszę nebulizatora po każdym użyciu, ponieważ krystalizacja (NH4)2Ce(NO3)6 może zniszczyć dyszę rozpylającą po kilku użyciach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do obrazowania należy wykorzystać próbki całego zwierzęcia lub narządów.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazowania całego brzucha należy ustawić tuszę myszy tak, aby otwarty brzuch był skierowany w stronę aparatu, a głowa była skierowana do tyłu instrumentu. Wyśrodkuj narząd, który ma być zobrazowany (np. wątrobę lub nerkę) w zielonym polu świetlnym na celowniku.</li>
		<li>W celu obrazowania i oceny ilościowej poszczególnych narządów wyjmij mysz z instrumentu do obrazowania i przypnij ją. Zaczynając od już otwartej jamy ciała, wytnij narządy wewnętrzne (np. nerki, wątrobę, płuca, mięśnie, śledzionę, mózg i serce). Przeciąć skórę tylnej nogi, aby wyciąć tkankę mięśniową. Ostrożnie otwórz czaszkę skalpelem, aby wyciąć mózg.
		<ol>
			<li>Jeśli narządem będącym przedmiotem zainteresowania jest wątroba, nerka lub śledziona, przetnij wszystkie narządy na pół wzdłużnie, umieść każdy narząd na szalce Petriego lub kawałku czarnego papieru budowlanego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Postępować zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.3-2.6 w celu ustalenia względnej emisji znacznika chemiluminescencyjnego dla pojedynczych narządów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Przygotować 10 μl roztworu PBS zawierającego 80 nmol [Ru(bpy)3]Cl2. W tym samym czasie przygotować wodny roztwór (NH4)2Ce(NO3)6 w wodzie (25 mM).</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl roztworu podskórnie w tylną łapę zdrowych myszy (n = 5). Jako kontrolę ujemną wstrzyknąć do przeciwległej łapy 10 μl czystego PBS. Uśmierc myszy przez uduszenie CO2 15 minut po wstrzyknięciu. Usuń skórę z obu tylnych nóg, aby odsłonić kanały limfatyczne aż do węzłów chłonnych podkolanowych.</li>
	<li>Skonfiguruj pobieranie zgodnie z opisem w kroku 3.4.</li>
	<li>Usunąć węzły chłonne podkolanowe z obu tylnych nóg, przeciąć je na pół i spryskać utleniaczem na szalce Petriego, jak opisano wcześniej (krok 3.5.3), w celu oceny ilościowej.</li>
</ol>

<ol><li>Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFong%2C+Y+%22Imaging+and+Visualization+in+The+Modern+Operating+Room%3A+A+Comprehensive+Guide+for+Physicians%22">Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-guided+surgery+with+live+molecular+navigation+-+a+new+cutting+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (9), 653-662 (2013).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li>
<li>Heller, S., Zanzonico, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+probes+and+intraoperative+gamma+cameras%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Nuclear probes and intraoperative gamma cameras.</a> Semin. Nucl. Med. 41 (3), 166-181 (2011).</li>
<li>van Dam, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+tumor-specific+fluorescence+imaging+in+ovarian+cancer+by+folate+receptor-%CE%B1+targeting%3A+first+in-human+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results.</a> Nat. Med. 17 (10), 1315-1319 (2011).</li>
<li>Zavaleta, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Raman-based+endoscopic+strategy+for+multiplexed+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (25), E2288-E2297 (2013).</li>
<li>Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+chalcogenopyrylium-based+surface-enhanced+resonance+Raman+scattering+nanoprobe+with+attomolar+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity.</a> Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).</li>
<li>Thorek, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positron+Lymphography%3A+Multimodal%2C+High-Resolution%2C+Dynamic+Mapping+and+Resection+of+Lymph+Nodes+After+Intradermal+Injection+of+18F-FDG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG.</a> Nucl. Med. 53 (9), 1438-1445 (2012).</li>
<li>Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24078721">Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG.</a> Nucl. Med. 55 (1), 95-98 (2014).</li>
<li>Gross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+myeloperoxidase+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo.</a> Nat. Med. 15 (4), 455-461 (2009).</li>
<li>Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+using+polymeric+nanoparticles+stained+with+near-infrared+chemiluminescent+and+fluorescent+squaraine+catenane+endoperoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide.</a> Chem. Commun. 49 (29), 3016-3018 (2013).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+with+chemiluminescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles.</a> Nat. Mater. 6 (10), 765-769 (2007).</li>
<li>Baumes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((thermally+activated%2C+near-infrared+chemiluminescent+dyes+and+dye-stained+microparticles+for+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging.</a> Nat. Chem. 2 (12), 1025-1030 (2010).</li>
<li>Siraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2C+Phosphorescence%2C+and+Chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence.</a> Anal. Chem. 88 (1), 170-202 (2016).</li>
<li>Hercules, D. M., Lytle, F. E. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00972a052">Chemiluminescence from Reduction Reactions.</a> Am. Chem. Soc. 88 (20), 4745-4746 (1966).</li>
<li>Kerr, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/266918014_Annihilation_Electrogenerated_Chemiluminescence_of_Mixed_Metal_Chelates_in_Solution_Modulating_Emission_Colour_by_Manipulating_the_Energetics">Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics.</a> Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).</li>
<li>Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontalti%2C+M+%22Handbook+of+Photochemistry+3rd+Ed%22">Handbook of Photochemistry 3rd Ed</a>. , CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rhodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Büchel, G. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Near-infrared+intraoperative+chemiluminescent+imaging">Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging.</a> ChemMedChem. , (2016).</li>
<li>Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+Listening+to+Light%3A+the+Evolution+of+Whole-Body+Photonic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/bi/BI9560371">Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase.</a> Austral. J. Biol. Sci. 9 (3), 371-381 (1956).</li>
<li>Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. <a target="_blank" href="https://yoon.chem.wisc.edu/sites/yoon.chem.wisc.edu/files/Rubpy2.pdf">Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence.</a> Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).</li>
<li>Knoll, J. D., Turro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+utilization+of+ruthenium+and+rhodium+metal+complex+excited+states+for+photoactivated+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy.</a> Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).</li>
<li>Haley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+and+toxicology+of+the+rare+earth+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pharmacology and toxicology of the rare earth elements.</a> J. Pharm. Sci. 54 (5), 663-670 (1965).</li>
<li>Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. <a target="_blank" href="https://srdata.nist.gov/solubility/IUPAC/SDS-13/SDS-13.pdf">IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates</a>. , Pergamon Press. (1983).</li>
<li>Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-Conjugated+Affinity+Labels%3A+A+New+Concept+to+Create+Enantioselective+Artificial+Metalloenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes.</a> ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).</li>
<li>Zanarini, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231643557_Synthesis_and_Electrochemiluminescence_of_a_Rubpy3-Labeled_Coupling_Adduct_Produced_on_a_Self-Assembled_Monolayer">Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer.</a> J. Phys. Chem. C. 112 (8), 2949-2957 (2008).</li>
<li>Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Quantitation+Using+Ru-NHS+Ester+Tagging+and+Isotope+Dilution+High-Pressure+Liquid+Chromatography-Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2769-2775 (2012).</li>
<li>Jantke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022328X13004142">Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers.</a> J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J Neurooncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenerated+Chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrogenerated Chemiluminescence.</a> Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).</li>
<li>Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Labelling+with+Versatile+Phosphorescent+Metal+Complexes+for+Live+Cell+Luminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging.</a> Chem. Eur. J. 21 (40), 14146-14155 (2015).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+labeling+and+bioanalytical+applications+of+a+tris%282%2C2%E2%80%B2-bipyridyl%29ruthenium%28II%29-based+electrochemiluminescence+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Bœuf, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/262418715_Encapsulated_RutheniumII_Complexes_in_Biocompatible_PolyDL-lactide-co-glycolide_Nanoparticles_for_Application_in_Photodynamic_Therapy">Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy.</a> ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).</li>
<li>Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+its+applications+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and its applications in surgery.</a> Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).</li>
<li>Barry, N. P. E., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+Metals+in+Medicine%3A+How+Nanotechnology+May+Help+To+Shape+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future.</a> ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).</li>
<li>Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Emission+of+Cationic+Iridium+%28III%29+Complexes+Towards+the+Red+Through+Methoxy+Substitution+of+the+Cyclometalating+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand.</a> Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).</li>
<li>Truong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescence+detection+with+water-soluble+iridium%28III%29+complexes+containing+a+sulfonate-functionalised+ancillary+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand.</a> Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiliśmy technologię, która jest w stanie optycznie nakreślić tkankę poprzez emisję fotonów wytwarzanych przez reporter chemiluminescencyjny. W przeciwieństwie do innych, bardziej uznanych technologii 4,5,6,7,8,9, ten chemiluminescencyjny system reporterowy wykorzystuje sondę obrazującą, która jest nieradioaktywna i ułatwia wykrywanie przy bardzo wysokich poziomach czułości.</...

W ostatnich dziesięcioleciach technologie obrazowania zrewolucjonizowały sposób, w jaki lekarze diagnozują i monitorują choroby. Te technologie obrazowania są jednak w dużej mierze ograniczone do systemów obrazowania całego ciała, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI). Szczególną uwagę zwrócono na nowotwory, a przełomowe odkrycia technologiczne w zakresie obrazowania znacznie poprawiły sposób diagnozowania i leczenia tej choroby. Pomimo tych postępów jest jedno miejsce, w którym te technologie obrazowania po prostu nie pasują: sala operacyjna. Chociaż techniki obrazowania całego ciała mogą pomóc w planowaniu chirurgicznym, zazwyczaj brakuje im rozdzielczości przestrzennych wystarczająco wysokich, aby pomóc lekarzom określić w czasie rzeczywistym, czy cała tkanka nowotworowa została usunięta, czy też pozostała tkanka nowotworowa pozostaje ukryta na marginesach chirurgicznych1. Upewnienie się, że nie pozostały żadne naciekające brzegi guza, jest jednym z najważniejszych celów chirurgicznych, a chirurdzy muszą stąpać po cienkiej linie między rygorystyczną i ostrożną resekcją tkanki. Jeśli zbyt duża ilość zostanie usunięta, nasilają się niepożądane skutki uboczne dla pacjenta; Jeśli usunięta zostanie zbyt mała ilość, zwiększa się częstotliwość nawrotów2,3. Dlatego tak ważne jest wyznaczenie dokładnych marginesów guza i uważamy, że chemiluminescencyjne obrazowanie śródoperacyjne może pomóc w poprawie dokładności identyfikacji marginesów guza, pomagając chirurgom w wizualizacji tkanki złośliwej, która w przeciwnym razie mogłaby pozostać niewykryta za pomocą ustalonych technik.
Obecnie bada się wiele technologii obrazowania pod kątem ich możliwej użyteczności jako śródoperacyjnych systemów obrazowania. Należą do nich sondy emitujące promieniowanie β i γ4, fluorescencja optyczna5, spektroskopia Ramana6,7 oraz Cherenkov luminescence8,9. Do tej pory jednak żadne z nich nie stało się standardowymi narzędziami klinicznymi. Optyczne obrazowanie fluorescencyjne okazało się do tej pory najbardziej obiecującą z tych technik i dlatego jest najbardziej zbadane. Chociaż wykazano już, że jest to cenne narzędzie dla wielu zastosowań, nie jest pozbawione ograniczeń. Rzeczywiście, jego główną wadą jest fluorescencja tła generowana przez z natury autofluorescencyjną tkankę biologiczną. Ten sygnał autofluorescencyjny tła jest produktem wzbudzenia otaczającej tkanki, oprócz fluoroforu, przez zewnętrzne źródło światła potrzebne do wygenerowania sygnału fluorescencyjnego. Z praktycznego punktu widzenia ta autofluorescencja może potencjalnie prowadzić do niskiego stosunku sygnału do szumu, co może ograniczyć użyteczność tej technologii na sali operacyjnej.
Główną zaletą obrazowania chemiluminescencyjnego nad obrazowaniem fluorescencyjnym jest to, że nie jest potrzebne światło wzbudzające. W rezultacie nie ma autofluorescencji tła. W obrazowaniu chemiluminescencyjnym energia wzbudzenia jest zamiast tego generowana chemicznie. Proces ten nie wytwarza niezamierzonego sygnału tła i dlatego może skutkować wyższymi stosunkami sygnału do szumu. Może to ostatecznie doprowadzić do bardziej precyzyjnego i dokładnego wykrywania marginesów chirurgicznych. Nieco zaskakujące jest to, że użyteczność tego podejścia jako techniki obrazowania śródoperacyjnego pozostała niezbadana10. Rzeczywiście, najbliższym przykładem tej techniki jest utlenianie luminolu przez mieloperoksydazę u myszy11,12,13. Chemiluminescencyjne obrazowanie biomedyczne jest zatem raczej niezbadanym obszarem badań, który może przynieść następujące korzyści: (1) minimalna autofluorescencja skutkująca niskim sygnałem tła przy wyższym stosunku sygnału do szumu; (2) przestrajalne długości fal emisji chemiluminescencyjnych w zakresie od światła widzialnego do bliskiej podczerwieni; oraz (3) funkcjonalizowane kompleksy chemiluminescencyjne, które w połączeniu z technologiami łączników i już istniejącymi celowanymi biomolekułami zapewniają dostęp do całych bibliotek ukierunkowanych sond do obrazowania molekularnego14.
To badanie potwierdzające zasadność ilustruje potencjalną użyteczność obrazowania chemiluminescencyjnego w środowisku biomedycznym przy użyciu środka do obrazowania na bazie rutenu. Właściwości chemiluminescencyjne tego związku są dobrze zbadane, a badania sięgają połowy lat 1960. XX wieku15. Po aktywacji chemicznej środek wytwarza światło o długości około 600 nm16, co dobrze nadaje się do celów obrazowania medycznego. Energia aktywacji jest dostarczana przez reakcję redoks, która prowadzi do stanu wzbudzonego - który ma czas życia 650 ns w wodzie 17 - po którym następuje generowanie fotonów po relaksacji tego wzbudzonego stanu. Dzięki zastosowaniu specjalnie zaprojektowanego zdalnego nebulizatora byliśmy w stanie wykryć ten związek zarówno ex vivo, jak i in vivo. Wyniki wstępnych eksperymentów są bardzo obiecujące, co sugeruje dalsze badania nad tą technologią.

<table><tbody><tr><td>Drewniana część A (12,5 &; 2,5 & razy; 1,8 cm)</td><td>&nbsp; Woodcraft</td><td>131404</td><td>Wycięte z arkusza sklejki brzozowej 3/4" x 24" x 30"</td></tr><tr><td>Drewniana część B (12,7 & razy; 10,7 & razy; 1,8 cm)</td><td>Rzemiosło</td> drewniane <td>131404</td><td>Wytnij z arkusza sklejki brzozowej 3/4" x 24" x 30"</td></tr><tr><td>Część drewniana C (11 & razy; 2,5 & razy; 1,8 cm)</td><td>Drewno 131404</td><td></td><td>Wytnij z 3/4" x 24" x 30& bdquo; blacha ze sklejki brzozowej</td></tr><tr><td>(4 i razy; 25 mm)</td><td>Śruba</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Wartości nominalne 3 uncje mini opryskiwacza</td><td>Łóżko, wanna i nie tylko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pręt ze stali nierdzewnej (10 cm ze stali 1/16 ")</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Ołówek Klasyczny HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>Spinacz do papieru</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>głośnikowy</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>Bateria alkaliczna Energizer 9 V</td><td>Energizer Holdings Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, wyjściowy moment obrotowy 3,4 kg / cm @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plastikowe opaski kablowe 28 cm</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 drut</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 drut</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 moc</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 moc</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 przełącznik dwustabilny</td><td>littleBits Inc.</td>Przełącznik <td></td><td>dwustabilny</td></tr><tr><td>i2 littleBits 011 serwo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 serwo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm drut pokryty tworzywem sztucznym opaski skręcane</td><td>Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&-bipirydylo)dichlororuten(II) sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>Azotan amonu ceru(IV)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td>Wodę oczyszczono za pomocą Milipore Mili-Q (R &ge; 18 M&Omega;)</td></tr><tr><td>Samica nagich (niekrewniaczych) myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>wiek 5 - 6 tygodni</td></tr><tr><td>Szczep C57BL/6J&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samce myszy NU/J w&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>wiek 6 & ndash; 8 tygodni</td></tr><tr><td>IVIS 200 czytnik bioluminescencji</td><td>Suwmiarka Live Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 oprogramowanie</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Techniki obrazowania śródoperacyjnego mają potencjał, aby uczynić interwencje chirurgiczne bezpieczniejszymi i bardziej skutecznymi; z tych powodów, takie techniki szybko przenoszą się na sale operacyjne. W tym miejscu przedstawiamy nowe podejście, które wykorzystuje technikę, która nie została jeszcze zbadana w obrazowaniu śródoperacyjnym: obrazowanie chemiluminescencyjne. Metoda ta wykorzystuje reporter chemiluminescencyjny na bazie rutenu wraz ze specjalnie zbudowanym systemem nebulizacji do tworzenia obrazów ex vivo lub in vivo o wysokim stosunku sygnału do szumu. Reporter na bazie rutenu wytwarza światło po wystawieniu na działanie wodnego roztworu utleniającego i ponownej redukcji w otaczającej tkance. Metoda ta pozwoliła nam wykryć stężenia reporterowe już od 6,9 pmol/cm2. W tej pracy przedstawiamy wizualny przewodnik po naszych badaniach in vivo potwierdzających słuszność koncepcji obejmujących wstrzyknięcia podskórne i dożylne u myszy. Wyniki sugerują, że technologia ta jest obiecującym kandydatem do dalszych badań przedklinicznych i ostatecznie może stać się użytecznym narzędziem na sali operacyjnej.

System nebulizacji opisany w sekcji 1 protokołu może zostać zbudowany z łatwo dostępnych materiałów przy niskich kosztach. Jest on przeznaczony do roli wkładki umożliwiającej zdalne wyzwalanie rozpylania czynnika redukującego/utleniającego wewnątrz czytnika bioluminescencyjnego (Rycina 1). Nasza konstrukcja pozwala na bezpieczną pracę nebulizatora w czytniku bioluminescencyjnym w odległości 14 cm od soczewki. Podczas pracy nie zaobserwowano zaparowania ani rozmycia obrazu...

Ten protokół opisuje nową technikę obrazowania śródoperacyjnego, która wykorzystuje kompleks rutenu jako źródło chemiluminescencyjnej emisji światła, wytwarzając w ten sposób wysokie proporcje sygnału do szumu podczas obrazowania in vivo. Obrazowanie śródoperacyjne to rozwijająca się dziedzina, która może zrewolucjonizować sposób wykonywania zabiegów chirurgicznych.

Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zaoferowanie nowej techniki obrazowania przedklinicznego, międzyoperacyjnego, chemiluminescencyjnego, która może przynieść korzyści w porównaniu z istniejącymi technikami optycznymi pod względem stosunku sygnału do szumu i limitów wykrywalności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, które do tej pory nie były dostępne za pomocą tradycyjnych technik obrazowania optycznego w wielu dziedzinach związanych z naukami biologicznymi. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ma wysoki stosunek sygnału do szumu i nie wymaga natychmiastowego światła ani promieniowania.Odkryliśmy, że implikacje tej techniki rozciągają się na międzyoperacyjne obrazowanie wielu stanów chorobowych, w tym raka, ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu, który ta technika ma do zaoferowania. Ponieważ do tej techniki nie jest potrzebne światło padające, nie ma problemów z absorpcją światła padającego. Ponadto dostępna jest duża skrzynka z narzędziami chemicznymi do funkcjonalizacji cząsteczki rdzenia chemiluminescencyjnego.Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować 100 mikrolitrów roztworów wzorcowych chlorku tris(bypirydyny)rutenu(II) w wodzie z odwróconej osmozy. Następnie połącz każdy wzorzec ze 100 mikrolitrami 25-milimolowego roztworu azotanu amonu i ceru w wodzie z odwróconej osmozy na szkiełku mikroskopowym. Otwórz oprogramowanie do obrazowania czytnika bioluminescencji i kliknij przycisk Zainicjuj.W trybie obrazowania upewnij się, że luminescencyjne i zdjęcie są zaznaczone, a fluorescencyjne nie jest zaznaczone. Ustaw czas naświetlania luminescencyjnego, parametry filtra binning, f/stop i emisji. Ustaw czas ekspozycji zdjęcia, parametry grupowania i przysłony.Następnie ustaw wysokość obiektu odpowiednio do próbki, która ma być zobrazowana. Ustaw pole widzenia na B, aby uzyskać 14-centymetrową odległość między kamerą a stolikiem na próbki. Przykryj podłogę komory obrazowania czytnika bioluminescencji w stoliku na próbkę czarnym papierem konstrukcyjnym.Następnie umieść pierwsze szkiełko z kroplą wzorcowej mieszaniny na stoliku na próbkę z kroplą wyśrodkowaną w zielonym krzyżu świetlnym. Następnie napełnij trzyuncjową butelkę z rozpylaczem specjalnie zbudowanego nebulizatora roztworem 1:3 trietyloaminy w roztworze 50/50 wody i etanolu. Upewnij się, że w rurze aspiracyjnej nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść zespół nebulizatora w komorze obrazowania z dyszą natryskową skierowaną w stronę kropli, która ma być obrazowana, nie zasłaniając kamery view kropli. Upewnij się, że wyłącznik zasilania nebulizatora i wskaźnik zasilania są włączone, przełącznik magnetyczny jest wyłączony, a nebulizator zasilający i przewody pilota nie są splątane. Zakryj gorące punkty, takie jak znaki na szkiełku, małymi kawałkami czarnego papieru budowlanego.Umieść co najmniej 40 centymetrów przewodu zdalnego sterowania nebulizatorem w komorze obrazowania. Delikatnie zamknij drzwiczki komory, nie zaciskając przewodów nebulizatora. W oprogramowaniu instrumentu kliknij przycisk pobierz, włącz automatyczne zapisywanie i ustaw ścieżkę do pliku danych.Zainicjuj sekwencję obrazowania. Gdy migawka otworzy się ze słyszalnym kliknięciem, przełącz przełącznik nebulizatora trzy razy, aby rozpylić trzy serie roztworu trietyloaminy na próbkę. Powtórzyć procedurę dla każdego szkiełka wzorcowego w celu określenia minimalnego wykrywalnego stężenia rutenu do obrazowania.Aby rozpocząć procedurę obrazowania in vivo, należy przygotować 100 mikrolitrów roztworu zawierającego od 8 do 33 nanomoli chlorku tris(bypirydyny)rutenu(II) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Przygotować 25-milimolowy wodny roztwór azotanu amonu i ceru. Następnie wstrzyknąć dożylnie 100 mikrolitrów rutenu do żyły ogonowej zdrowych myszy.Poświęć myszy 10 minut po wstrzyknięciu przez uduszenie dwutlenkiem węgla. Usuń skórę z tułowia za pomocą nacięcia w kształcie litery Y, a następnie usuń łuk żebrowy, aby odsłonić serce i płuca. Wytnij ujście w prawym przedsionku i wstrzyknij 20 mililitrów PBS przez igłę o rozmiarze 24 do lewej komory.Przetnij skórę brzucha, aby odsłonić nerki i wątrobę. Jeśli narządem będącym przedmiotem zainteresowania jest wątroba, nerka lub śledziona, wykonaj widoczne podłużne przecięcie przez narząd. Przygotuj nową sekwencję obrazowania w oprogramowaniu czytnika bioluminescencyjnego.W przypadku obrazowania całego brzucha umieść mysz w komorze obrazowania z otwartym brzuchem skierowanym w stronę aparatu i głową skierowaną w stronę tylnej części instrumentu. Wyśrodkuj narząd zainteresowania na zielonym celowniku lightboxa. Dokładnie umyj butelkę z rozpylaczem i dyszę z zespołu nebulizatora, a następnie napełnij butelkę roztworem azotanu amonu i ceru.Umieść nebulizator w komorze obrazowania z dyszą natryskową skierowaną na miejsce obrazowania. Upewnij się, że kamera jest drożna, przewody nie są splątane, a co najmniej 40 centymetrów przewodu pilota znajduje się w komorze. Zamknij komorę i rozpocznij sekwencję obrazowania.Gdy migawka otworzy się z kliknięciem, przełącz przełącznik trzy razy, aby rozpylić trzy serie środka utleniającego na miejsce obrazowania. Po zobrazowaniu wyjmij zespół nebulizatora i dokładnie przepłucz dyszę natryskową, aby zapobiec krystalizacji azotanu amonu i ceru. W celu późniejszego obrazowania i oceny ilościowej poszczególnych narządów, wyjmij mysz z instrumentu i wytnij narządy wewnętrzne, zaczynając od otwartej jamy ciała.Przeciąć skórę tylnej nogi w celu wycięcia próbek tkanki mięśniowej. Jeśli narządem zainteresowania jest wątroba, nerka lub śledziona, przetnij narząd na pół podłużnie. Następnie umieść narząd na szalce Petriego lub kawałku czarnego papieru budowlanego.Zobrazuj każdy narząd w taki sam sposób, jak całe zwierzę, spłukując dyszę rozpylającą po każdej sekwencji. W tej procedurze myszom wstrzyknięto środek do obrazowania na bazie rutenu, a badaną tkankę spryskano utleniaczem w celu wywołania chemiluminescencji. Minimalne wykrywalne stężenie środka obrazującego określono na 6,9 pikomoli na centymetr kwadratowy w tych warunkach.Obrazy chemiluminescencji w świetle białym narządów będących przedmiotem zainteresowania uzyskano za pomocą czytnika bioluminescencyjnego. Sygnał chemiluminescencji obserwowano głównie w nerkach po wstrzyknięciu dożylnym, co wskazuje na eliminację przez nerki hydrofilowego kationu tris(bypirydyny)rutenu(II). Stosunek sygnału do szumu czynnika obrazującego w porównaniu z samym PBS wynosił 27:1 w nerkach i 21:1 w wątrobie.Węzły chłonne podkolanowe myszy oceniano również za pomocą podskórnego wstrzyknięcia bardziej stężonego roztworu środka do obrazowania na bazie rutenu. Węzły chłonne zawierające środek obrazujący wykazywały znacznie większy blask niż węzły chłonne zawierające sam PBS. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest prawidłowo wykonana.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykluczeniu światła z otoczenia i unikaniu zanieczyszczenia rutenem tris bpy. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem biomolekularnym do badania stanów chorobowych, takich jak rak u myszy. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pytania, które nie były dostępne za pomocą tradycyjnych technik obrazowania optycznego, każde pytanie, które można zbadać za pomocą tradycyjnych technik, potencjalnie można rozwiązać za pomocą chemiluminescencji.

a-novel-technique-for-generating-observing-chemiluminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Poznaj nową technikę obrazowania chemiluminescencyjnego z użyciem kompleksu ruteniu, która zapewnia wyższy stosunek sygnału do szumu niż tradycyjne metody optyczne. Ta metoda umożliwia precyzyjne obrazowanie chorób, w tym nowotworów, podczas zabiegów chirurgicznych.

Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym

Przeglądaj więcej filmów