Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym
9 marca 2017
Ten protokół opisuje nową technikę obrazowania śródoperacyjnego, która wykorzystuje kompleks rutenu jako źródło chemiluminescencyjnej emisji światła, wytwarzając w ten sposób wysokie proporcje sygnału do szumu podczas obrazowania in vivo. Obrazowanie śródoperacyjne to rozwijająca się dziedzina, która może zrewolucjonizować sposób wykonywania zabiegów chirurgicznych.
Ogólnym celem tego protokołu jest zaoferowanie nowej techniki obrazowania przedklinicznego, międzyoperacyjnego, chemiluminescencyjnego, która może przynieść korzyści w porównaniu z istniejącymi technikami optycznymi pod względem stosunku sygnału do szumu i limitów wykrywalności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, które do tej pory nie były dostępne za pomocą tradycyjnych technik obrazowania optycznego w wielu dziedzinach związanych z naukami biologicznymi. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ma wysoki stosunek sygnału do szumu i nie wymaga natychmiastowego światła ani promieniowania.
Odkryliśmy, że implikacje tej techniki rozciągają się na międzyoperacyjne obrazowanie wielu stanów chorobowych, w tym raka, ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu, który ta technika ma do zaoferowania. Ponieważ do tej techniki nie jest potrzebne światło padające, nie ma problemów z absorpcją światła padającego. Ponadto dostępna jest duża skrzynka z narzędziami chemicznymi do funkcjonalizacji cząsteczki rdzenia chemiluminescencyjnego.
Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować 100 mikrolitrów roztworów wzorcowych chlorku tris(bypirydyny)rutenu(II) w wodzie z odwróconej osmozy. Następnie połącz każdy wzorzec ze 100 mikrolitrami 25-milimolowego roztworu azotanu amonu i ceru w wodzie z odwróconej osmozy na szkiełku mikroskopowym. Otwórz oprogramowanie do obrazowania czytnika bioluminescencji i kliknij przycisk Zainicjuj.
W trybie obrazowania upewnij się, że luminescencyjne i zdjęcie są zaznaczone, a fluorescencyjne nie jest zaznaczone. Ustaw czas naświetlania luminescencyjnego, parametry filtra binning, f/stop i emisji. Ustaw czas ekspozycji zdjęcia, parametry grupowania i przysłony.
Następnie ustaw wysokość obiektu odpowiednio do próbki, która ma być zobrazowana. Ustaw pole widzenia na B, aby uzyskać 14-centymetrową odległość między kamerą a stolikiem na próbki. Przykryj podłogę komory obrazowania czytnika bioluminescencji w stoliku na próbkę czarnym papierem konstrukcyjnym.
Następnie umieść pierwsze szkiełko z kroplą wzorcowej mieszaniny na stoliku na próbkę z kroplą wyśrodkowaną w zielonym krzyżu świetlnym. Następnie napełnij trzyuncjową butelkę z rozpylaczem specjalnie zbudowanego nebulizatora roztworem 1:3 trietyloaminy w roztworze 50/50 wody i etanolu. Upewnij się, że w rurze aspiracyjnej nie ma pęcherzyków powietrza.
Umieść zespół nebulizatora w komorze obrazowania z dyszą natryskową skierowaną w stronę kropli, która ma być obrazowana, nie zasłaniając kamery view kropli. Upewnij się, że wyłącznik zasilania nebulizatora i wskaźnik zasilania są włączone, przełącznik magnetyczny jest wyłączony, a nebulizator zasilający i przewody pilota nie są splątane. Zakryj gorące punkty, takie jak znaki na szkiełku, małymi kawałkami czarnego papieru budowlanego.
Umieść co najmniej 40 centymetrów przewodu zdalnego sterowania nebulizatorem w komorze obrazowania. Delikatnie zamknij drzwiczki komory, nie zaciskając przewodów nebulizatora. W oprogramowaniu instrumentu kliknij przycisk pobierz, włącz automatyczne zapisywanie i ustaw ścieżkę do pliku danych.
Zainicjuj sekwencję obrazowania. Gdy migawka otworzy się ze słyszalnym kliknięciem, przełącz przełącznik nebulizatora trzy razy, aby rozpylić trzy serie roztworu trietyloaminy na próbkę. Powtórzyć procedurę dla każdego szkiełka wzorcowego w celu określenia minimalnego wykrywalnego stężenia rutenu do obrazowania.
Aby rozpocząć procedurę obrazowania in vivo, należy przygotować 100 mikrolitrów roztworu zawierającego od 8 do 33 nanomoli chlorku tris(bypirydyny)rutenu(II) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Przygotować 25-milimolowy wodny roztwór azotanu amonu i ceru. Następnie wstrzyknąć dożylnie 100 mikrolitrów rutenu do żyły ogonowej zdrowych myszy.
Poświęć myszy 10 minut po wstrzyknięciu przez uduszenie dwutlenkiem węgla. Usuń skórę z tułowia za pomocą nacięcia w kształcie litery Y, a następnie usuń łuk żebrowy, aby odsłonić serce i płuca. Wytnij ujście w prawym przedsionku i wstrzyknij 20 mililitrów PBS przez igłę o rozmiarze 24 do lewej komory.
Przetnij skórę brzucha, aby odsłonić nerki i wątrobę. Jeśli narządem będącym przedmiotem zainteresowania jest wątroba, nerka lub śledziona, wykonaj widoczne podłużne przecięcie przez narząd. Przygotuj nową sekwencję obrazowania w oprogramowaniu czytnika bioluminescencyjnego.
W przypadku obrazowania całego brzucha umieść mysz w komorze obrazowania z otwartym brzuchem skierowanym w stronę aparatu i głową skierowaną w stronę tylnej części instrumentu. Wyśrodkuj narząd zainteresowania na zielonym celowniku lightboxa. Dokładnie umyj butelkę z rozpylaczem i dyszę z zespołu nebulizatora, a następnie napełnij butelkę roztworem azotanu amonu i ceru.
Umieść nebulizator w komorze obrazowania z dyszą natryskową skierowaną na miejsce obrazowania. Upewnij się, że kamera jest drożna, przewody nie są splątane, a co najmniej 40 centymetrów przewodu pilota znajduje się w komorze. Zamknij komorę i rozpocznij sekwencję obrazowania.
Gdy migawka otworzy się z kliknięciem, przełącz przełącznik trzy razy, aby rozpylić trzy serie środka utleniającego na miejsce obrazowania. Po zobrazowaniu wyjmij zespół nebulizatora i dokładnie przepłucz dyszę natryskową, aby zapobiec krystalizacji azotanu amonu i ceru. W celu późniejszego obrazowania i oceny ilościowej poszczególnych narządów, wyjmij mysz z instrumentu i wytnij narządy wewnętrzne, zaczynając od otwartej jamy ciała.
Przeciąć skórę tylnej nogi w celu wycięcia próbek tkanki mięśniowej. Jeśli narządem zainteresowania jest wątroba, nerka lub śledziona, przetnij narząd na pół podłużnie. Następnie umieść narząd na szalce Petriego lub kawałku czarnego papieru budowlanego.
Zobrazuj każdy narząd w taki sam sposób, jak całe zwierzę, spłukując dyszę rozpylającą po każdej sekwencji. W tej procedurze myszom wstrzyknięto środek do obrazowania na bazie rutenu, a badaną tkankę spryskano utleniaczem w celu wywołania chemiluminescencji. Minimalne wykrywalne stężenie środka obrazującego określono na 6,9 pikomoli na centymetr kwadratowy w tych warunkach.
Obrazy chemiluminescencji w świetle białym narządów będących przedmiotem zainteresowania uzyskano za pomocą czytnika bioluminescencyjnego. Sygnał chemiluminescencji obserwowano głównie w nerkach po wstrzyknięciu dożylnym, co wskazuje na eliminację przez nerki hydrofilowego kationu tris(bypirydyny)rutenu(II). Stosunek sygnału do szumu czynnika obrazującego w porównaniu z samym PBS wynosił 27:1 w nerkach i 21:1 w wątrobie.
Węzły chłonne podkolanowe myszy oceniano również za pomocą podskórnego wstrzyknięcia bardziej stężonego roztworu środka do obrazowania na bazie rutenu. Węzły chłonne zawierające środek obrazujący wykazywały znacznie większy blask niż węzły chłonne zawierające sam PBS. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest prawidłowo wykonana.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykluczeniu światła z otoczenia i unikaniu zanieczyszczenia rutenem tris bpy. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się obrazowaniem biomolekularnym do badania stanów chorobowych, takich jak rak u myszy. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pytania, które nie były dostępne za pomocą tradycyjnych technik obrazowania optycznego, każde pytanie, które można zbadać za pomocą tradycyjnych technik, potencjalnie można rozwiązać za pomocą chemiluminescencji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nową technikę obrazowania śródoperacyjnego z wykorzystaniem kompleksu rutenu do chemiluminescencyjnej emisji światła, co pozwala na zwiększenie stosunku sygnału do szumu podczas obrazowania in vivo. To innowacyjne podejście ma potencjał przekształcić procedury chirurgiczne poprzez zapewnienie wyraźniejszych wyników obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Obrazowanie śródoperacyjne
- Techniki chemiluminescencyjne
- Procedury chirurgiczne
Wstęp
- Istniejące techniki obrazowania optycznego mają ograniczenia w zakresie stosunku sygnału do szumu.
- Wysoki stosunek sygnału do szumu jest kluczowy dla dokładnego obrazowania w warunkach chirurgicznych.
- Tradycyjne metody obrazowania często wymagają światła padającego, co może prowadzić do problemów z absorpcją.
- Dostępny jest szeroki zestaw narzędzi chemicznych do funkcjonalizacji chemiluminescencyjnej cząsteczki rdzeniowej.
Cel badania
- Wprowadzenie nowej przedklinicznej techniki obrazowania śródoperacyjnego.
- Poprawa granic detekcji oraz przejrzystości obrazowania w porównaniu z istniejącymi metodami.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia różnych stanów chorobowych, w tym nowotworów.
Zastosowane metody
- Opracowanie kompleksu rutenu do chemiluminescencyjnej emisji światła.
- Ocena stosunku sygnału do szumu w obrazowaniu.
- Porównanie z tradycyjnymi technikami obrazowania optycznego.
- Zastosowanie tej techniki w różnych dziedzinach nauk biologicznych.
Główne wyniki
- Nowa technika oferuje znacznie wyższy stosunek sygnału do szumu.
- Eliminuje ona potrzebę stosowania światła padającego, co pozwala uniknąć problemów z absorpcją.
- Wykazano skuteczność metody w obrazowaniu wielu stanów chorobowych.
- Istnieje potencjał do szerszych zastosowań w naukach biologicznych.
Wnioski
- Ta technika obrazowania chemiluminescencyjnego może usprawnić obrazowanie śródoperacyjne.
- Stanowi ona realną alternatywę dla tradycyjnych metod optycznych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w przypadku różnych jednostek chorobowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wysokoczułe obrazowanie chemiluminescencyjne z wykorzystaniem reporterów opartych na rutenie rozwiązuje kluczowe problemy związane z detekcją i stosunkiem sygnału do szumu w badaniach śródoperacyjnych oraz przedklinicznych. Technika ta umożliwia precyzyjną wizualizację celów biologicznych bez zakłóceń wywołanych przez światło padające, co wspiera pewne podejmowanie decyzji w przełomowych punktach odkryć i badań translacyjnych. Solidne granice detekcji oraz zdolność do adaptacji sprawiają, że metoda ta stanowi cenny zasób w rozwoju projektów badawczych oraz zarządzaniu portfelem z uwzględnieniem ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek biologicznych i stanów chorobowych przy użyciu obrazowania o wysokim stosunku sygnału do szumu.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów molekularnych in vivo i ex vivo.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie ilościowych danych o rozkładzie przestrzennym.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad zaangażowaniem celu i lokalizacją w tkankach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania niezbędne do standaryzacji testu.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów procesów screeningu związków.
- Umożliwia niezawodną detekcję celów o niskiej liczności, wspierając wiarygodny rozwój testu.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w wielu modelach biologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby w zakresie translacyjnego obrazowania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie wizualizacji in vivo.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe progi obrazowania.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przedklinicznych badaniach skuteczności i dystrybucji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania chemiluminescencyjnego integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania po badania przedkliniczne, umożliwiając płynną weryfikację hipotez, walidację celów oraz ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących rozmieszczenia tkanek oraz interakcji z celem molekularnym.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania niezbędne do przygotowania testów.
- Analityka: Umożliwia czuły pomiar stężeń reporterów i stosunków sygnału do szumu w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki obrazowaniu in vivo w modelach istotnych dla danej choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje modułowe możliwości obrazowania, które można dostosować do różnych systemów biologicznych i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym rozwijanie portfela.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów odkrywczych i translacyjnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu chemiluminescencyjnym oraz w pracy z modelami biologicznymi.
- Wymaga specjalistycznego instrumentarium, takiego jak czytniki bioluminescencyjne i niestandardowe systemy nebulizacji.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i integralności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów tkanek i systemów modelowych po wprowadzeniu odpowiednich korekt w protokole.
- Kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników jest staranne wykluczenie światła zewnętrznego oraz zanieczyszczeń.
