Name: Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę FRET do oceny konformacji GPCR selektywnych dla białka G w żywych komórkach. Technika pozwala badać interakcje receptorów z różnymi efektorami i wpływ leków na aktywację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.U.M został ufundowany przez American Heart Association Pre-doctoral Fellowship (14PRE18560010). Badania zostały sfinansowane przez American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) i NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) dla SS.

1. Przygotowanie DNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj konstrukty sensorowe, stosując modularny schemat klonowania. Należy odnieść się do projektu sensora β2-AR opisanego wcześniej1.</li>
	<li>Przygotuj DNA zgodnie z protokołem komercyjnego zestawu do miniprepu i eluuj w 2 mM roztworze Tris-HCl, pH 8, przy stężeniu ≥ 750 ng/µl, A260/A280 w zakresie 1,7 - 1,9 oraz A260/A230 w zakresie 2,0 - 2,29.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Hodować komórki HEK-293T-Flp-n w medium DMEM zawierającym 4,5 g/L D-glukozy, uzupełnionym o 10% FBS (inaktywowany ciepłem) (v/v), 1% suplement L-glutaminy, 20 mM HEPES, pH 7,5 w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z 5% CO2. W kolejnych etapach manipulować komórkami w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Pozostawić komórki do momentu uzyskania konfluencyjnej monowarstwy przed przeniesieniem do płytek sześcio-dołkowych. Czas osiągnięcia konfluencji zależy od początkowej gęstości wysiewu. Do wysiewu w płytkach sześcio-dołkowych należy używać płytek, które osiągają konfluencję w ciągu 1 - 2 dni od wysiewu. Konfluencyjna płytka hodowlana o średnicy 10 cm ma gęstość komórek wynoszącą około 4 x 106 komórek/ml. Obraz wzrostu hodowli komórkowej przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Przemyć komórki 10 ml PBS i poddać trypsynizacji przy użyciu 0,25% trypsyny (patrz Dyskusja, akapit 2). Wysiać 8 x 105 komórek/dołek w 2 ml medium w płytkach sześcio-dołkowych przeznaczonych do hodowli tkanek i pozostawić do adhezji na 16 - 20 h.</li>
</ol>
3. Warunki transfekcji
<ol>
	<li>Zastosuj przesunięcie czasowe transfekcji dla konstruktów, które mogą wymagać różnych przedziałów czasowych w celu osiągnięcia optymalnej ekspresji (między 20 a 36 h). Zsynchronizuj warunki w celu ujednolicenia czasu trwania eksperymentu. Przygotuj również kontrolną studzienkę z komórkami nietransfekowanymi o analogicznej gęstości, która posłuży do odjęcia szumu tła i rozproszenia podczas analizy.</li>
	<li>Doprowadzić odczynniki do transfekcji do temperatury pokojowej: pożywkę z obniżoną zawartością surowicy, DNA oraz odczynnik do transfekcji.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym) połączyć odczynniki w sterylnej probówce do mikrocentryfugi w następującej kolejności: wymieszać 2 µg DNA z 100 µl pożywka z obniżoną zawartością surowicy. Spike 6 µl odczynnika do transfekcji do mieszaniny pożywki i DNA, nie dotykając powierzchni mieszaniny ani ścianek probówki. Przygotować jedną reakcję transfekcji na każdą studzienkę. Warunki transfekcji można zoptymalizować (1 - 4 µg DNA, 3 - 6 µl odczynnika do transfekcji) w celu uzyskania spójnych poziomów ekspresji. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania bardziej zoptymalizowanych proporcji.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 15–30 min. Nie używać mieszaniny reakcyjnej, jeśli czas inkubacji przekroczył 30 min.</li>
	<li>Dodaj odczynnik do komórek w postaci kropel w obrębie studzienki i delikatnie wstrząśnij płytką sześciostudzienkową, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Dodaj jedną porcję odczynnika na każdą studzienkę.</li>
	<li>Po 20 godzinach ekspresji należy monitorować fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu do hodowli tkankowych. Ekspresję w populacji należy ocenić przy użyciu obiektywu 10X, a lokalizację białka w komórce przy użyciu obiektywu 40X. Należy obserwować ekspresję białka w błonie plazmatycznej (PM). Jeśli stwierdzono znaczną internalizację, należy monitorować transfekcję do momentu wykrycia istotnej ekspresji w błonie plazmatycznej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników i sprzętu
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM zapasy leku i przechowywać w temperaturze -80 °C: bitartrat izoproterenolu (10 mM w dH2O zawierającej 30 mM kwasu askorbinowego). Przygotować na lodzie/w pomieszczeniu chłodniczym i natychmiast zamrozić szokowo. Alikwoty można przygotować i przechowywać do jednego roku.</li>
	<li>Przygotować bufor komórkowy (~ 2 ml na warunek) i przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przygotowywać świeżą porcję każdego dnia. Składniki buforu komórkowego znajdują się w Tabeli 2.</li>
	<li>Przygotować bufor lekowy (10 ml) i przechowywać w temperaturze pokojowej. Składniki buforu lekowego znajdują się w Tabeli 2.</li>
	<li>Przemyć kuwety kwasem, używając stężonego HCl. Zneutralizować słabą zasadą (1 M KOH), a następnie dokładnie wypłukać kuwety wodą dH2O.</li>
	<li>Przygotować stanowisko pracy wokół fluorometru, wyposażając je w kilka pudełek końcówek do pipet o pojemności 10, 20 i 100 µl, minutnik ustawiony na 10 min, dostępną linię próżniową z końcówkami do czyszczenia kuwet, chusteczki do zadań precyzyjnych oraz butelkę z wodą ultraczystą H2O.</li>
	<li>Nagrzać zewnętrzną kąpiel wodną dla fluorometru oraz blok grzewczy do 37 °C.</li>
	<li>Włączyć fluorometr; ustawić program detekcji fluorescencji dla CFP na wzbudzenie 430 nm, pasmo przepustowości 8 nm; zakres emisji 450 nm - 60 nm, pasmo przepustowości 4 nm. Dla detekcji YFP, służącej wyłącznie jako kontrola sensora (patrz Dyskusja), ustawić wzbudzenie na 490 nm, pasmo przepustowości 8 nm, zakres emisji 50 - 60 nm, pasmo przepustowości 4 nm. Ustawienia detekcji CFP zostaną wykorzystane do uzyskania widma FRET w tym eksperymencie.</li>
	<li>Umieścić dwanaście probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w bloku grzewczym, jak pokazano na Rysunku 2 poniżej. Probówki te służą jako uchwyty dla probówek z alikwotami komórek (probówki do mikrocentryfugi 50 µl). W uchwytach 1 i 7 umieścić niewielki kawałek tkanki, aby zamortyzować umieszczone tam kuwety. 
	Uwaga: Należy używać osobnych kuwet dla warunku nieleczonego i warunku z lekiem, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.</li>
</ol>
<img alt="Stanowisko do PCR z 12 oznakowanymi probówkami; przygotowanie eksperymentu amplifikacji DNA do analizy genetycznej." src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie probówek do mikrowirówki i referencyjne rozmieszczenie w bloku grzewczym. Kuweta dla próbek niepoddanych działaniu leku znajduje się w pozycji 1; probówki z alikwotami komórek znajdują się w pozycjach 2–6. Kuweta dla próbek poddanych działaniu leku znajduje się w pozycji 7; probówki z alikwotami komórek znajdują się w pozycjach 8–12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<ol start="9">
	<li>Napełnić uchwyty 2 - 6 oraz 8 - 12 około 750 µl wody, aby stworzyć miniaturową kąpiel wodną o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić dziesięć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 50 µl z alikwotami komórek w miniaturowych kąpielach wodnych (uchwyty 2 - 6, 8 - 12). Każda probówka będzie stanowić pojedynczy powtórzenie danej warunków (5 nieleczonych, 5 leczonych lekiem).</li>
	<li>Monitorować ekspresję w komórkach (patrz krok 3.6).</li>
</ol>
5. Eksperyment i zbieranie danych
<img alt="Schemat transfekcji kultur komórkowych; analiza widm FRET; mikroskopia fluorescencyjna; ekspresja białek." src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Schemat doświadczenia. Szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania i przeprowadzenia eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Bibliografia Rysunek 3 do schematu doświadczalnego. Gdy komórki będą gotowe do zebrania, na podstawie ekspresji białka wykrytej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz Dyskusja, akapit 4): w komorze z laminarnym przepływem powietrza delikatnie usunąć ok. 1 ml pożywki, resuspender komórki w ich hodowli za pomocą końcówki P1 0 i przenieść resuspensję do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. 
	Uwaga: Należy unikać stosowania trypsyny, ponieważ może ona strawić koniec N-końcowy i/lub kieszeń wiążącą sensora GPCR.</li>
	<li>Policz komórki, aby upewnić się, że w zawiesinie uzyskano odpowiednią gęstość komórek. Zoptymalizuj objętość resuspensji dla 4 x 106 komórek/ml</li>
	<li>Wirować komórki w wirówce z koszykami wahadłowymi w temperaturze pokojowej przy 290 x g przez 3 min. Po wirowaniu usunąć nadfiltr.</li>
	<li>DELIKATNIE resuspendować komórki w 1 ml buforu do komórek (przechowywanego w 37 °C) i powtórz krok 5.3. Podczas drugiego wirowania pobierz alikwot 10 mM roztworu zapasu leku z -80 °CPrzygotować rozcieńczenie 1:100 w buforze do leku (Drug Buffer), aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 1 mM, i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po drugim wirowaniu należy usunąć nadkład i ostrożnie resuspenderować komórki w 1 ml buforu do komórek (4 x 106 komórek/ml). Zmierzyć OD600 próbki w spektrofotometrze, używając 1 ml komórek, a w ramach próbki zerowej (blank) 1 ml buforu do komórek (Cell Buffer). Należy przenieść komórki do jednorazowej plastikowej kuwety, a bezpośrednio po pomiarze spektrofotometrycznym przenieść je z powrotem do probówki do mikrocentryfugi.</li>
	<li>W celu uzyskania widma kontrolnego dla komórek nietransfekowanych, delikatnie resuspender komórki nietransfekowane w 1 ml buforu do komórek (Cell Buffer) za pomocą pipety P10, dodać 90 µl komórek do kuwety i zarejestruj widmo FRET przy wzbudzeniu 430 nm, pasmie przepustowym 8 nm, emisji 450–60 nm, pasmie przepustowym 4 nm. Pobierz 3–5 powtórnych widm z nowej 90 µl komórek. Przechowywać zapas komórek w 37 °C pomiędzy pomiarami delikatnie resuspender za pomocą pipety P10 pomiędzy każdą alikwotą próbki, a kuwetę przepłukać wodą ultraczystą H2O2O pomiędzy próbkami.</li>
	<li>W zależności od warunków eksperymentalnych, odmierzyć aликwoty 90 µl transfekowanych komórek do każdej z 500 µl probówki w uchwytach 2–6 oraz 8–12 w bloku grzewczym. Między każdą alikwotacją delikatnie resuspendować zapas komórek za pomocą pipety P10.</li>
	<li>Po rozdzieleniu komórek na aliquoty należy dodać 10 µl buforu do leku do probówek 2–6 dla próbek w warunkach nieleczonych.</li>
	<li>Rozpocząć eksperyment poprzez dodanie 10 µl do probówki 8 1 mM roztworu leku, uruchomić timer z odliczaniem od 10 min i delikatnie wymieszać zawartość probówki za pomocą pipety P20. Zamknąć probówkę i zwrócić do 37 °C blok grzejny</li>
	<li>Bezzwłocznie pobrać probówkę 2, delikatnie wymieszać za pomocą pipety P200 (używając nowej końcówki), dodać 90 µl zawiesiny komórkowej do kuwety z warunkiem kontrolnym (niepoddanym działaniu), a następnie umieść w fluorometrze.</li>
	<li>Należy zarejestrować widmo FRET przy wzbudzeniu 430 nm, szerokości pasma 8 nm oraz emisji 450–60 nm, szerokości pasma 4 nm.</li>
	<li>W czasie 9 min – 10 s do probówki 9 należy dodać 10 µl do 1 mM roztworu leku, delikatnie wymieszać za pomocą pipety P20 (używając nowej końcówki), a następnie umieścić probówkę z powrotem w bloku grzewczym.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.10–5.1 dla probówki 3 oraz krok 5.12 dla probówki 10.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.10 – 5.13 w odstępach 1 min (08:10, 07:10, itd.), aż do momentu zebrania widm dla wszystkich próbek w warunkach bez leku oraz dodania leku do wszystkich próbek w warunkach z lekiem. Podczas każdego etapu pipetowania należy używać nowej końcówki, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.</li>
	<li>W czasie 5 min - 10 s należy rozpocząć delikatne mieszanie zawartości probówki 8 (warunki z lekiem) za pomocą pipety P20, a następnie dodać 90 µl przenieść zawiesinę komórkową do oddzielnej kuwety dla próbki poddanej działaniu leku i umieścić w fluorometrze.</li>
	<li>Należy zarejestrować widmo FRET (patrz krok 5.1 w celu zapoznania się z ustawieniami).</li>
	<li>Powtórz kroki 5.15 – 5.16 w odstępach 1-minutowych (04:10, 03:10, itp.) dla pozostałych próbek w warunkach podania leku (probówki 9–12).</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu należy zapisać pliki projektu i dokładnie umyć kuwety wodą ultraczystą H2O2O, a następnie uzupełnij zapas probówek dla kolejnego stanu. Należy zadbać o to, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej podczas etapu płukania. Wymień końcówkę w H2W butelce, a także w linii próżniowej pomiędzy kolejnymi etapami przemywania.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Zapisz i wyeksportuj pliki danych w formacie SPC do późniejszej analizy. Programy analityczne są dostępne do pobrania ze strony publikacji Laboratorium Sivaramakrishnan.</li>
	<li>Utwórz pliki ścieżek dla oprogramowania analitycznego, które zawierają programy analizy (v9, v15), pliki próbek nietransfekowanych (patrz krok 5.6 w sekcji zbierania widm komórek nietransfekowanych), plik danych wyjściowych (OUTPUT) oraz pliki wartości rozdzielonych przecinkami (CSV) do wprowadzania danych.</li>
	<li>Wprowadź następujące informacje do pliku CSV (patrz przykład w Tabeli 3) i przypisz odpowiednie warunki dla każdej próbki, w tym: 
	Nazwa pliku – poszczególne pliki wykresów SPC 
	Receptor – określ, który konstrukt GPCR został przebadany (np. Β2) 
	Łącznik (Binder) – określ, który wariant peptydowy konstruktu został przebadany (np. S) 
	Agonista – określ warunki nieleczone (N) lub leczone lekiem (D) 
	Katalog – folder ze ścieżką, w którym zapisano pliki SPC, zazwyczaj zorganizowany według daty 
	OD – zarejestrowana gęstość optyczna próbki z spektrofotometru</li>
	<li>Wprowadź nazwy plików dla próbek nietransfekowanych (krok 5.6), aby odjąć tło buforu i szum rozproszony od próbek.</li>
	<li>Wprowadź warunki do programu analitycznego.</li>
	<li>Uruchom programy w celu analizy próbek w ramach poszczególnych warunków (v9) oraz pomiędzy warunkami (v15).</li>
	<li>Wyklucz pliki próbek, które są ewidentnymi wartościami odstającymi w zestawie danych, lub dostosuj odejmowanie poprzez zwiększenie lub zmniejszenie wartości OD poszczególnych plików.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do pliku OUTPUT w celu uzyskania dostępu do obliczonych stosunków FRET (525 nm/475 nm).</li>
	<li>Oblicz ΔFRET, odejmując średni stosunek FRET dla warunku nieleczonego od poszczególnych stosunków FRET dla warunków leczonych (lekiem).</li>
</ol>

<ol><li>Malik, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G+Protein-selective+G+Protein-coupled+Receptor+%28GPCR%29+Conformations+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells.</a> J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).</li>
<li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Alexander, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+analysis+of+the+rhodopsin-G-protein+complex+links+the+%CE%B15+helix+to+GDP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gi%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Conklin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-Terminal+Mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+That+Alter+the+Fidelity+of+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation.</a> Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).</li>
<li>Onaran, H. O., Costa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+have+all+the+active+receptor+states+gone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Where have all the active receptor states gone.</a> Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fbioluminescence+resonance+energy+transfer+techniques+to+study+G-protein-coupled+receptor+activation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.</a> Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).</li>
<li>Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+millisecond+activation+switch+of+G+protein-coupled+receptors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Stumpf, A. D., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+based+on+G+protein-coupled+receptors+-+added+work+or+added+value%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value.</a> Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER%2FK+%CE%B1-helix+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Wąski zakres dynamiki pomiarów FRET w tym systemie wzmacnia konieczność czułej kontroli jakości na każdym etapie tego protokołu. Najważniejszymi krokami zapewniającymi udany eksperyment FRET są: 1) hodowla komórek, 2) transfekcja, 3) ekspresja białek oraz 4) terminowa, precyzyjna koordynacja podczas wykonywania testu.
Zdrowie komórek i jakość konserwacji/posiewu mogą mieć znaczący wpływ na stosunek sygnału do szumu w systemie eksperymentalnym, a zły stan komórek może uniemożliwić wykrycie jaki...

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) to receptory siedmioma transbłonowymi. Sam ludzki genom zawiera około 800 genów kodujących GPCR, które są aktywowane przez różne ligandy, w tym światło, substancje zapachowe, hormony, peptydy, leki i inne małe cząsteczki. Prawie 30% wszystkich farmaceutyków dostępnych obecnie na rynku jest ukierunkowanych na GPCR, ponieważ odgrywają one dużą rolę w wielu stanach chorobowych2. Pomimo dziesięcioleci szeroko zakrojonych prac nad tą rodziną receptorów, nadal istnieją istotne nierozstrzygnięte pytania w tej dziedzinie, szczególnie w odniesieniu do mechanizmów molekularnych, które napędzają interakcje GPCR-efektor. Do tej pory opublikowano tylko jedną strukturę krystaliczną o wysokiej rozdzielczości, która dostarcza informacji na temat interakcji między receptoremβ 2-adrenergicznym (β2-AR) a białkiem Gs3. Wraz z szeroko zakrojonymi badaniami prowadzonymi w ciągu ostatnich trzech dekad, potwierdza to jeden konkretny składnik strukturalny, który ma kluczowe znaczenie w tej interakcji: C-koniec podjednostki Gα. Struktura ta jest ważna zarówno dla aktywacji białka G przez GPCR4, jak i selekcji białka G5-6. W związku z tym C-koniec Gα stanowi kluczowe ogniwo między stymulacją liganda GPCR a selektywną aktywacją białka G.
Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady sugerują, że GPCR zaludniają szeroki krajobraz konformacyjny, z podzbiorami konformacji GPCR wiążącymi ligandy. Chociaż dostępnych jest kilka technik, w tym krystalografia, NMR i spektroskopia fluorescencyjna oraz spektrometria mas do badania krajobrazu konformacyjnego GPCR, brakuje podejść do wyjaśnienia ich funkcjonalnego znaczenia w doborze efektorów7. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na rezonansowym transferze energii Fӧrster (FRET) do wykrywania selektywnych konformacji GPCR w białku G. FRET opiera się na bliskości i równoległej orientacji dwóch fluoroforów o nakładających się widmach emisji (donor) i wzbudzenia (akceptor)8. W miarę zbliżania się do siebie fluoroforów donorowych i akceptorowych w wyniku zmiany konformacyjnej białka lub interakcji białko-białko, FRET między nimi wzrasta i można go zmierzyć przy użyciu szeregu metod8. Bioczujniki oparte na FRET są szeroko stosowane w dziedzinie GPCR9. Zostały one wykorzystane do badania zmian konformacyjnych w GPCR poprzez wstawienie donora i akceptora do trzeciej pętli wewnątrzkomórkowej i C-końca GPCR; czujniki zostały zaprojektowane do badania interakcji GPCR i efektorowych poprzez oddzielne znakowanie GPCR i efektora (podjednostek/aresztsyn białka G) za pomocą pary FRET10; niektóre czujniki wykrywają również zmiany konformacyjne w białku G11. Te bioczujniki umożliwiły tej dziedzinie zadanie wielu nierozstrzygniętych pytań, w tym zmian konformacyjnych w GPCR i efektorze, kinetyki interakcji GPCR-efektor i ligandów allosterycznych12. Nasza grupa była szczególnie zainteresowana stworzeniem bioczujnika, który mógłby wykrywać konformacje GPCR specyficzne dla białka G w warunkach zależnych od agonistów. Ten bioczujnik opiera się na niedawno opracowanej technologii o nazwie SPASM (systematic protein affinity strength modulation)13. SSKURCZ polega na wiązaniu oddziałujących domen białkowych za pomocą łącznika ER/K, który kontroluje ich efektywne stężenia. Otoczenie łącznika parą fluoroforów FRET tworzy narzędzie, które może raportować stan interakcji między białkami12. Poprzednio1 moduł SPASM był używany do wiązania C-końca Gα z GPCR i monitorowania ich interakcji z fluoroforami FRET, mCytryną (określaną w tym protokole przez jej powszechnie znany wariant, Żółte Białko Fluorescencyjne (YFP), szczyt wzbudzenia/emisji przy 490/525 nm) i mCerulean (określany w tym protokole przez powszechnie znany wariant Cyan Fluorescent Protein (CFP), szczyt wzbudzenia/emisji 430/475 nm). Od końca N do C, ten genetycznie kodowany pojedynczy polipeptyd zawiera: GPCR o pełnej długości, akceptor FRET (mCitrine/YFP), łącznik ER/K 10 nm, donor FRET (mCerulean/CFP) oraz peptyd Gα C-końcowy. W tym badaniu czujniki są w skrócie określane jako peptyd GPCR-linker length-Gα. Wszystkie komponenty są oddzielone nieustrukturyzowanym linkerem (Gly-Ser-Gly)4, który umożliwia swobodną rotację każdej domeny. Szczegółowa charakterystyka takich czujników została wcześniej przeprowadzona przy użyciu dwóch prototypowych GPCR: β2-AR i opsin1.
Ten czujnik jest przejściowo transfekowany do komórek HEK-293T, a eksperymenty na żywych komórkach oparte na fluorometrze mierzą widma fluorescencji pary FRET w dowolnych jednostkach zliczeń na sekundę (CPS) w obecności lub braku ligandu. Pomiary te służą do obliczenia stosunku FRET między fluoroforami (YFPmax/CFPmax). Zmianę FRET (ΔFRET) oblicza się następnie poprzez odjęcie średniego stosunku FRET próbek niepoddanych działaniu substancji od współczynnika FRET próbek poddanych działaniu liganda. ΔFRET można porównać między konstruktami (β peptyd 2-AR-10 nm-Gαs w porównaniu z peptydem2-AR-10 nm-no β). W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół ekspresji tych czujników w żywych komórkach HEK-293T, monitorowania ich ekspresji oraz konfiguracji, wykonywania i analizy pomiaru FRET na żywych komórkach opartego na fluorometrze w stanach nieleczonych w porównaniu z lekami. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla czujnika peptydowegoβ 2-AR-10 nm-Gαs poddanego działaniu dwuwinianu izoproterenolu 100 μM, można go zoptymalizować dla różnych par i ligandów GPCR-Gα.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 nm-Czujnik peptydowy gazu</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET Zestaw miniprep plazmidu</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Elute w 2 mM Bufor elucyjny Tris</td></tr><tr><td>Komórki HEK-293T-Flp-n</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- wysoki poziom glukozy</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Ciepły w&nbsp; 37 &deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>FBS, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskie</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Zredukowane podłoża surowicy; Przynieś do RT przed użyciem</td></tr><tr><td>XtremeGene HP transfection reagenet</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Wysoce zalecane ze względu na jego konsystencję. Przynieś do RT przed użyciem</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>Użyj z oprogramowaniem FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa o długości ścieżki 3 mm</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Może wymagać uchwytu/adaptera kuwety do użytku z fluorometrem, dostępny w Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Podgrzewana pompa do kąpieli cyrkulacyjnej Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Ciepła do 37 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Ciepły do 37 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda wolna od DNA/RNAzy</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>Stosować w RT</td></tr><tr><td>D(+)-glukoza, bezwodna aprotynina</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>z płuc bydlęcych</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>hemisulfian leupeptyny</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy, klasa odczynnika</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- izoproterenol (+)-dwuwinian</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Użyj świeżej porcji w każdym eksperymencie</td></tr></tbody></table>

selektywne dla białka g konformacje gpcr mierzone za pomocą czujników fret w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Badania oparte na transferze energii rezonansu (FRET) stają się coraz bardziej powszechne w badaniach nad sygnalizacją GPCR. Nasza grupa badawcza opracowała wewnątrzcząsteczkowy czujnik FRET do wykrywania interakcji między podjednostkami Gα a GPCR w żywych komórkach po stymulacji agonistycznej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wykrywania zmian w FRET między receptorem 2-adrenergicznym β a peptydem C-końca Gαs po leczeniu chlorowodorkiem izoproterenolu 100 μM, jak wcześniej scharakteryzowano1. Nasz czujnik FRET jest pojedynczym polipeptydem składającym się szeregowo z GPCR o pełnej długości, fluoroforu akceptorowego FRET (mCitrine), łącznika ER / K SPAT (systematyczna modulacja siły powinowactwa do białek), fluoroforu donorowego FRET (mCerulean) i peptydu C-końcowego Gα. Protokół ten szczegółowo opisze przygotowanie komórek, warunki transfekcji, konfigurację sprzętu, wykonanie testu i analizę danych. Ten eksperymentalny projekt wykrywa niewielkie zmiany w FRET wskazujące na interakcje białko-białko, a także może być wykorzystany do porównania siły oddziaływania między ligandami i parami białek GPCR-G. Aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu w naszych pomiarach, protokół ten wymaga zwiększonej precyzji na wszystkich etapach i jest prezentowany tutaj, aby umożliwić powtarzalne wykonanie.

Uogólniony schemat konfiguracji i przebiegu eksperymentu szczegółowo przedstawiono na Ryc. 3.
Aby wykryć zmianę FRET w wąskim zakresie dynamicznym sensora, kluczowe jest przestrzeganie niuansów systemu. Jakość komórek ma fundamentalne znaczenie zarówno dla ekspresji białek, jak i spójności pobieranych próbek. Rysunek 1 przedstawia obrazy hodowlanych komórek rosnących w jednolitej warstwie (10X), co jest optymalne dla wysiewu na płytki sześciodołkowe i transfek...

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Ogólnym celem tego testu opartego na transferze energii rezonansowej Förstera (FRET) w żywych komórkach jest ocena konformacji receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR) selektywnych względem białek G w różnych warunkach stymulacji agonistami. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie GPCR dotyczące oddziaływań tych receptorów z różnymi efektorami oraz wpływu różnych leków na konformację receptora. Główną zaletą tej techniki jest modułowość czujników, które można łatwo zmodyfikować dla różnych kombinacji GPCR i peptydów białka G$\alpha$, w tym dla pełnych białek oraz podjednostek G$\alpha$.Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w dobór białek G i odpowiedź na różne ligandy, może być również zastosowana do zbadania fizjologicznych konsekwencji różnicowej aktywacji białek G. Przed rozpoczęciem procedury należy hodować odpowiednie komórki w medium kompletnym w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% dwutlenku węgla, aż kultury osiągną pełną konfluencję.Następnie odklej komórki za pomocą trypsyny i przesiej kultury w zagęszczeniu 8 × 10⁵ komórek na dołek w 2 ml pożywki do sześciodołkowych płytek hodowlanych traktowanych do hodowli tkanek na 16 do 20 godzin inkubacji. Po 16 do 20 godzinach, gdy komórki przylgną do płytek, przygotuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza jedną reakcję transfekcji na każdy dołek i pozostaw mieszaniny odczynników do wyrównania temperatury na 15 do 30 minut. Po zakończeniu inkubacji dodaj jedną reakcję do każdej kultury komórkowej, dodając odczynnik kroplami na całej powierzchni dołka.Delikatnie potrząśnij płytką, aby zapewnić dokładne rozprowadzenie odczynnika w kulturach. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 20 godzinach przeanalizuj kultury pod kątem ekspresji białek błony plazmatycznej i oceń kondycję komórek.Jeśli zaobserwowano znaczną internalizację białka, należy monitorować transfekcję aż do wykrycia istotnej ekspresji w błonie plazmatycznej. Ocena poziomu ekspresji białka jest niezbędna dla optymalnego przygotowania eksperymentu. Jeśli transfekcja komórek przebiegła słabo lub ekspresja białka jest zbyt niska, należy odczekać z ichi zbieraniem.W przeciwnym razie sygnał fluorescencyjny może być niewystarczający do przeprowadzenia analizy. Gdy komórki będą gotowe do zbioru, przenieś je do komory z laminarnym przepływem powietrza i delikatnie odlej jeden mililitr pożywki. Za pomocą pipety P1000 resuspenduj komórki w jednym mililitrze pozostałej pożywki na studzienkę, a następnie przenieś zawiesiny komórkowe do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Należy policzyć komórki, a następnie poddać je wirowaniu w celu uzyskania osadu komórkowego. Usunąć medium znad osadu komórkowego. Delikatnie resuspender supernatant w jednym mililitrze buforu do komórek o temperaturze 37 °C i powtórzyć wirowanie.Po drugim wirowaniu resuspenduj osad w świeżym buforze do komórek do stężenia 4×10⁶ komórek/ml. Następnie dodaj 90 µl komórek kontrolnych do kuwety i zarejestruj kontrolne widmo FRET. Po zebraniu od trzech do pięciu powtórzeń widm kontrolnych, używając dla każdego pomiaru świeżej porcji 90 µl komórek, powtórz etapy resuspensji, wirowania i przemywania dla komórek transfektowanych.Przenieś po 90 µL przetransfekowanych komórek do każdej probówki o pojemności 500 µL w uchwytach od 2 do 6 oraz od 8 do 12 w bloku grzewczym, delikatnie resuspendując komórki pomiędzy kolejnymi aliquotami. Po przeniesieniu wszystkich komórek, dodaj 10 µL buforu do leku do probówek od 2 do 6 dla próbek w warunkach nieleczonych. Następnie dodaj 10 µL 1 mM roztworu leku do probówki numer 8.Uruchom minutnik z odliczaniem od 10 minut i użyj pipety P200, aby delikatnie wymieszać zawartość probówki. Po wymieszaniu zamknij probówkę i włóż ją z powrotem do bloku grzewczego. Następnie niezwłocznie pobierz drugą probówkę.Delikatnie wymieszaj zawartość, używając nowej końcówki. Dodaj 90 µl zawiesiny przetransfekowanych komórek do kuwety dla warunku nieleczonego i umieść kuwetę w fluorometrze. Wykonaj pomiar widma FRET dla próbki, stosując te same parametry, co w przypadku widm kontrolnych.W dziewiątej minucie i 10 sekundzie do probówki dziewiątej dodaj 10 µL 1 mM roztworu leku. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i umieść ją ponownie w bloku grzejnym. Następnie natychmiast pobierz probówkę trzecią, wymieszaj i zmierz zawartość kuwety, tak jak przed chwilą zademonstrowano dla probówki drugiej.W piątej minucie i dziesiątej sekundzie delikatnie wymieszaj zawartość probówki nr 8 za pomocą pipety P200. Przenieś 90 µL zawiesiny komórkowej do oddzielnej kuwety w celu pomiaru próbki traktowanej lekiem i zarejestruj widmo FRET dla próbki w warunkach podania leku. Po zarejestrowaniu wszystkich widm zapisz pliki projektu.Dokładnie wymyj kuwety wodą ultraczystą i ponownie uzupełnij probówki dla kolejnego wariantu. Na tym obrazie przedstawiono jednorodną monowarstwę hodowli komórkowej, która jest optymalna do wysiewu do płytek sześciodołkowych i transfekcji. Komórki rosnące w skupiskach, które prowadzą do powstania kształtów dendrytycznych, nie są natomiast zalecane dla zapewnienia spójnego wysiewu i dokładnej analizy ekspresji białek lub pomiaru FRET.Warunki transfekcji można również zoptymalizować, aby uzyskać powtarzalną ekspresję. Po zebraniu wszystkich danych i wprowadzeniu ich do pliku CSV w celu analizy, wygenerowane wyniki będą przypominać te reprezentatywne surowe i znormalizowane średnie widma FRET. Wszystkie surowe widma FRET z tego reprezentatywnego eksperymentu wykazują gładki, wystarczający stosunek sygnału do szumu, co pozwala na spójną analizę danych przy minimalnym piku wody z próbki.Po znormalizowaniu danych przy 475 nanometrach, wartość zliczeń na sekundę dla tej długości fali zostaje ustawiona na 1,0, co uwidacznia istotną zmianę w odczycie przy 525 nanometrach pomiędzy próbkami traktowanymi a nietraktowanymi. Jeśli ekspresja białka jest niska, wydajność transfekcji jest słaba lub gęstość komórek w kuwecie do pomiaru fluorescencji jest zbyt mała, surowe dane mogą być zaszumione, co może powodować problemy przy odejmowaniu tła i normalizacji, prowadząc do powstania widm, które nie są spójne i nie mogą zostać poddane analizie. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, cały proces można zrealizować w 25 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z komórkami na wszystkich etapach eksperymentu. Po opanowaniu tej procedury technikę można rozszerzyć na testowanie różnych sensorów FRET dla receptorów, różnych leków i efektorów oraz różnych typów komórek. Po opracowaniu technika ta przyczyniła się do rozwoju dziedziny GPCR, gdzie niedawne badania z wykorzystaniem tych sensorów rzuciły światło na molekularny mechanizm wyboru białek G.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat sposobu oceny konkretnych konformacji GPCR przy użyciu pomiaru z zastosowaniem konstruktu tether FRET w żywych komórkach. Proszę pamiętać, że praca z kulturami komórek ssaków oraz niektórymi lekami eksperymentalnymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj metodę FRET do oceny konformacji GPCR selektywnych dla białka G w żywych komórkach. Technika pozwala badać interakcje receptorów z różnymi efektorami i wpływ leków na aktywację.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów