Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Ogólnym celem tego transferu energii rezonansu Forstera z żywymi komórkami lub testu opartego na FRET jest ocena selektywnych dla receptora sprzężonego z białkiem G lub GPCR w różnych warunkach agonistycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie GPCR dotyczące interakcji GPCR z różnymi efektorami oraz wpływu różnych leków na potwierdzenie receptora. Główną zaletą tej techniki jest to, że czujniki są modułowe i można je łatwo przeprojektować pod kątem różnych kombinacji peptydów GPCR i G alfa, w tym pełnej i podjednostki G alfa.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w selekcję białka G i odpowiedź na różne ligeny. Może być również stosowany do badania fizjologicznych konsekwencji zróżnicowanej aktywacji białka G. Przed rozpoczęciem procedury należy wyhodować interesujące komórki w kompletnym podłożu w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż kultury osiągną konfluencję.

Następnie odłącz komórki za pomocą trypsyny i przejdź kultury w ilości osiem razy 10 do piątej komórki na komórkę w dwóch milimetrach pożywki do kultury tkankowej, potraktowanej sześcioma dobrze naczyniami przez szesnaście do 20 godzin hodowli. Po 16 do 20 godzinach przygotować jedną reakcję transfekcji na studzienkę, gdy komórki przylgną do płytek w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić mieszaniny odczynników do zrównoważenia przez 15 do 30 minut. Pod koniec inkubacji dodać jedną reakcję do każdej kultury komórkowej kroplami w poprzek studzienki.

Delikatnie potrząsając płytką, aby zapewnić dokładne rozprowadzenie odczynnika w kulturach. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 20 godzinach przeanalizuj kultury pod kątem ekspresji białek błony komórkowej i oceń stan komórki.

Jeśli obserwuje się znaczną internalizację białka, należy monitorować transfekcję, aż do momentu wykrycia znaczącej ekspresji na błonie plazmatycznej. Ocena poziomu ekspresji białka jest niezbędna do optymalnej konfiguracji eksperymentalnej. Jeśli komórki słabo transfekowały lub ekspresja białka jest zbyt niska, poczekaj na pobranie komórek.

W przeciwnym razie sygnał fluorescencyjny może być nieodpowiedni do analizy. Gdy komórki będą gotowe do pobrania, przenieś je do szafki bezpieczeństwa biologicznego i delikatnie usuń jeden mililitr pożywki. Za pomocą pipety P1000 ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pozostałej pożywki na studzienkę i przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek

Policz komórki i zagnieźdź komórki przez odwirowanie. Usuń pożywkę z osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić supernatant w jednym mililitrze buforu komórkowego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i powtórzyć wirowanie.

Zawiesić osad w stężeniu cztery razy 10 do szóstej komórki na mililitr w buforze świeżej komórki po drugim wirowaniu. Następnie dodaj 90 mikrolitrów komórek kontrolnych do kuwety i uzyskaj kontrolne widmo FRET. Po zebraniu od trzech do pięciu powtórzeń widm kontrolnych ze świeżymi 90 mikrolitrami komórek dla każdego pomiaru, powtórzyć etapy zawiesiny, wirowania i płukania dla transfekowanych komórek.

Porcjować 90 mikrolitrów transfekowanych komórek do każdej probówki o pojemności 500 mikrolitrów w uchwycie od drugiego do sześciu i od ośmiu do 12 w bloku grzewczym, delikatnie zawieszając komórki między każdą podwielokrotnością. Gdy wszystkie komórki zostaną przeniesione, dodaj 10 mikrolitrów buforu leku do probówek od dwóch do sześciu dla próbek nieleczonych stanem. Następnie dodać 10 mikrolitrów jednego milimola roztworu leku do probówki ósmej.

Uruchom minutnik, aby odliczać od 10 minut i użyj pipety P200, aby delikatnie wymieszać zawartość probówki. Po wymieszaniu zamknij rurkę i włóż ją z powrotem do bloku grzewczego. Następnie natychmiast podnieś rurkę drugą.

Delikatnie wymieszaj jego zawartość z nową końcówką. Dodać 90 mikrolitrów transfekowanej zawiesiny komórek do niepoddanej działaniu substancji kuwety i umieścić kuwetę we fluorometrze. Uzyskać widmo FRET dla próbki, stosując te same parametry, co dla widm kontrolnych.

Po dziewięciu minutach i 10 sekundach rurkę kolczastą dziewięć z 10 mikrolitrami jednomilimolowego roztworu leku. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i włóż probówkę z powrotem do bloku grzewczego. Następnie natychmiast weź probówkę trzecią, wymieszaj i odmierz zawartość kuwety, jak pokazano właśnie dla probówki drugiej.

Po pięciu minutach i 10 sekundach delikatnie wymieszaj probówkę ósmą z pipetą P200. Dodać 90 mikrolitrów zawiesiny komórek do oddzielnej kuwety w celu pomiaru próbki poddanej działaniu leku i uzyskać widmo FRET dla próbki stanu leku. Po uzyskaniu wszystkich widm zapisz pliki projektu.

Dokładnie umyj kuwety ultra czystą wodą i uzupełnij rurki na następny stan. Na tym obrazie pokazano jednorodną monowarstwę hodowli komórkowej, która jest optymalna dla posiewu i transfekcji w sześciu dołkach. Komórki te rosną w zbite wzory, które prowadzą do kształtów dendrytycznych, jednak nie są zalecane do spójnego posiewu i dokładnej analizy ekspresji białek lub pomiaru FRET.

Warunki transfekcji można również zoptymalizować w celu uzyskania powtarzalnej ekspresji. Po zebraniu wszystkich danych i wprowadzeniu ich do pliku CSV w celu analizy, wygenerowane wyniki będą przypominać te reprezentatywne widma RAW i znormalizowane średnie FRET. Wszystkie widma RAW FRET z tego reprezentatywnego eksperymentu wykazują płynny, wystarczający zakres sygnału do szumu, co pozwala na spójną analizę danych przy minimalnym piku wody z próbki.

Gdy dane są znormalizowane przy 475 nanometrach, liczba na sekundę tej wartości jest ustawiona na 1,0 i widoczna staje się znacząca zmiana przy odczycie 525 nanometrów między próbkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu nanometra. Jeśli ekspresja białka jest niska lub występuje słaba wydajność transfekcji lub niska gęstość komórek w kuwecie do odczytu fluorescencji, dane RAW mogą być zaszumione, powodując problem z odejmowaniem i normalizacją tła, co skutkuje widmami, które nie są wyrównane i nie można ich przeanalizować. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 25 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatności podczas obchodzenia się z komórkami na wszystkich etapach eksperymentu. Po tej procedurze technika może zostać rozszerzona o testowanie różnych czujników receptora FRET, różnych leków i efektorów oraz różnych typów komórek. Po opracowaniu technika ta przyczyniła się do rozwoju GPCR, gdzie ostatnie badania z wykorzystaniem tych czujników rzuciły światło na molekularny mechanizm selekcji białka G.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać określone potwierdzenia GPCR za pomocą testu pomiarowego FRET na uwięzi komórkowej na żywo. Nie zapominaj, że praca z hodowlą komórek ssaków i niektórymi eksperymentalnymi lekami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.