Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych
26 grudnia 2016
Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.
Celem tego protokołu badań przesiewowych siRNA jest zbadanie wpływu wyciszania genów na wzrost sferoidów linii komórek rakowych. W porównaniu z tradycyjnymi technikami dwuwymiarowych hodowli komórkowych, sferoidy nowotworowe wykazują warunki bardziej podobne do tych spotykanych w nowotworach in vivo. Metoda ta jest przydatna do funkcjonalnej oceny często zmienianych genów w nowotworach u ludzi, a co ważniejsze, może być wykorzystana do określenia, które geny są potencjalnymi onkogenami lub supresorami nowotworów w bardziej złożonych warunkach hodowli, takich jak te obserwowane w hodowli trójwymiarowej, a w szczególności w niedotlenieniu.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo dostosować, dzięki czemu naukowcy mogą jej używać do badania konkretnych genów w preferowanych liniach komórkowych. Uważamy, że opiera się on na obecnych metodach ukierunkowanych badań przesiewowych sRNA. Ogólnie docenia się, że ukierunkowane badania przesiewowe, a nie szczepy całego genomu, pozwalają naukowcom zadawać konkretne pytania i generować bardziej wiarygodne wyniki.
Przeanalizowaliśmy wpływ wyciszania genów na żywotność i rozmiar sferoidów, ale można również użyć barwników biometrycznych do innego odczytu ekranu, takiego jak apoptoza. Procedurę demonstruje Patty Wai z naszego laboratorium. Rozpocznij od rozmrożenia 96-dołkowych płytek zawierających bibliotekę siRNA w temperaturze pokojowej.
Następnie wirować przez pięć minut w temperaturze 1 000 g za pomocą wirówki stołowej. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy zawierającej zoptymalizowany odczynnik do transfekcji do dołków każdej płytki. Inkubować przez 15 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów transfekcyjnych zawierających siRNA.
Podobnie jak w przypadku każdego rurociągu przesiewowego, zdolność tworzenia sferoidów linii komórkowych w warunkach transfekcji powinna być solidnie zoptymalizowana przed wykonaniem pełnego badania. Następnie trypsynizować komórki, które mają być przesiewane, aż oderwą się od kolby. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę odpowiednią objętością pożywki specyficznej dla linii komórkowej, przenieś do probówki wirówkowej i wiruj przez pięć minut z prędkością 1000 g w wirówce stołowej, aby zebrać komórki.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zawiesinie jednokomórkowej z odpowiednią objętością pożywki. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie rozcieńczyć zawiesinę do 5 000 komórek na 180 mikrolitrów zimną pożywką.
Przenieść zawiesinę komórek do zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 180 mikrolitrów należy wymieszać i przenieść zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę zawierającą siRNA. Odwirować płytkę w ilości 1 000 g we wstępnie schłodzonej wirówce o temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W tym momencie komórki pojawią się jako mozaika na dnie studzienek. Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem. W tym momencie komórki powinny zostać zagregowane razem, aby utworzyć pojedynczą sferoidę w środku studni.
Dodaj 100 mikrolitrów kompletnego podłoża do każdej studzienki, aby pobudzić wzrost przed powrotem do inkubatora. Po trzech dniach wzrostu delikatnie usuń 100 mikrolitrów podłoża z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki. Siódmego dnia zbadaj sferoidy pod mikroskopem, a następnie przystąp do ilościowego określania rozmiaru sferoidów na czytniku płytek, który może ilościowo monitorować wzrost sferoidów w czasie.
Aby określić ilościowo rozmiar sferoidy, najpierw otwórz oprogramowanie na komputerze. Wybierz płytkę 96-dołkową, wybierz odpowiedni typ płytki i wprowadź nazwę eksperymentu. Następnie włóż 96-dołkową płytkę zawierającą sferoidy do stacjonarnego cytometru do obrazowania na płytce mikrodołkowej.
Następnie wybierz aplikację Tumorsphere. Wybierz ostrość opartą na obrazie, aby zmienić ostrość tak, aby sferoida była ostra i miała optymalny kontrast. Wybierz dołki, które wymagają skanowania, i rozpocznij skanowanie.
Następnie upewnij się, że maska obiektu dokładnie odzwierciedla rozmiar sferoidy. W przypadku sferoid BT474 hodowanych przez siedem dni dostosuj Precyzja na Wysoka i ustaw minimalną średnicę kolonii na 200 mikronów. Użyj funkcji Eksportuj, aby wyeksportować dane w postaci pliku danych z adnotacjami, który zostanie przeanalizowany w celu zidentyfikowania siRNA o statystycznie istotnym wpływie na obszar sferoidalny.
Po obrazowaniu usuń 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj 100 mikrolitrów luminescencyjnego barwnika żywotności, aby określić żywotność komórek. Po inkubacji płytek przez 15 minut, zeskanuj płytkę za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych. Protokół ten może być również dostosowany do stosowania z innymi liniami komórek nowotworowych.
Procedura odwrotnej transfekcji kontroli niedocelowych nie wpłynęła znacząco na żywotność żadnej z badanych linii, podczas gdy transfekcja ubikwityny B, pozytywnej kontroli zabijającej komórki, znacznie zmniejszyła żywotność. Komórki BT474 poddano odwrotnej transfekcji za pomocą 200-genowej biblioteki siRNA ludzkiego siGENOME w trzech egzemplarzach. Zaobserwowano obszar sferoidalny i żywotność.
Zidentyfikowano istotne wartości odstające ze wskaźnikiem z wynikiem z większym niż 1,7. SiRNA, które znacznie zwiększyły lub zmniejszyły obszar sferoidalny i żywotność, są zacieniowane na niebiesko, a czerwony przedstawia kontrolne siRNA. Ten zestaw mikrofotografii pokazuje reprezentatywne obrazy sferoid BT474 siedem dni po odwrotnej transfekcji z E-Kadheryną, kontrolną kontrolą nieukierunkowaną, PIK3CA, ERBB2 lub SF3B1 siRNA.
Ten histogram pokazuje, w jaki sposób leczenie każdym siRNA wpłynęło na żywotność komórek siedem dni po odwrotnej transfekcji. Knockdown ERBB2 i PIK3CA znacznie zmniejszył żywotność komórek w porównaniu z kontrolami. Obraz ten pokazuje, że sferoidy mogą być z powodzeniem wybarwione immunologicznie, aby ujawnić wpływ wyciszania genów na białka docelowe.
Po opanowaniu, kilkaset genów może zostać przebadanych w wielu liniach komórkowych w ciągu jednego dnia, co pozwala na solidną identyfikację potencjalnie nowych genów ważnych dla przetrwania w hodowli trójwymiarowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie hodować sferoidy komórek rakowych, które są podatne na wyciszanie genów za pośrednictwem sRNA. Będziesz także mógł zbadać wpływ wyciszania genów, wykonując immunohistochemię na sferoidy.
Może to dostarczyć cennych informacji przestrzennych, które mogą poinformować Cię o podstawowej biologii.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia podejście funkcjonalnej genomiki do identyfikacji potencjalnych docelowych substancji leczniczych poprzez badanie efektów wyczerpywania genów na sferydach linii komórek nowotworowych. Te sferydy zapewniają bardziej dokładny model ludzkich guzów in vivo w porównaniu z tradycyjnymi kulturami 2D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Funkcjonalna Genomika
- Biologia Nowotworów
- Techniki hodowli komórek
Tło
- Wyciszenie genów może ujawniać onkogeny i supresory nowotworowe.
- Sferydy nowotworowe naśladują mikrośrodowisko guza bliżej niż kultury 2D.
- Selektywne badanie siRNA pozwala na konkretne badanie genów.
- Warunki hipoksyczne można badać za pomocą tej metody.
Cel badania
- Badanie wpływu wyciszania genów na wzrost sferydów nowotworowych.
- Identyfikacja genów, które mogą służyć jako nowe cele lecznicze.
- Poprawa rozumienia funkcji genów w środowisku hodowli 3D.
Zastosowane metody
- Badanie siRNA w sferydach linii komórek nowotworowych.
- Optymalizacja warunków transfekcji dla uzyskania trwałych sferydów.
- Ilościowa analiza wielkości i żywotności sferydów przy użyciu cytometrii obrazkowej.
- Analiza wpływu wyciszania genów na żywotność i wzrost komórek.
Główne wyniki
- Zaobserwowano istotne wpływy specyficznych siRNA na żywotność i wielkość sferydów.
- Wyciszenie ERBB2 i PIK3CA zmniejszyło żywotność komórek w porównaniu z kontrolą.
- Osiągnięto trwałe zidentyfikowanie genów ważnych dla przeżycia w hodowli 3D.
- Wykazano przystosowywalność metody do różnych linii komórek nowotworowych.
Wnioski
- To podejście umożliwia badanie setek genów w ciągu jednego dnia.
- Stanowi cenną narzędzie do identyfikacji potencjalnych docelowych substancji leczniczych w nowotworach.
- Metoda poprawia rozumienie funkcji genów w bardziej fizjologicznie odpowiednim kontekście.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
