Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny
29 grudnia 2016
Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.
Ogólnym celem tej procedury jest lepsze zrozumienie kształtu i ruchu komórek podczas gastrulacji Drosophila. Tutaj przedstawiamy solidną metodę pomiaru gastrulacji Drosophila, aby oznaczyć inicjację morfogenetycznego ruchu komórkowego na tym etapie rozwoju embrionalnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że przegrupowanie komórek w czasie gastrulacji można zidentyfikować wraz ze zwężeniem wierzchołkowym podczas gastrulacji.
Aby rozpocząć eksperyment, przygotuj mieszaninę 375 mililitrów wody. 125 mililitrów 100% dostępny w handlu sok jabłkowy. 12,5 grama agaru.
12,5 grama glukozy. Następnie podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż agar się rozpuści. I wlej go do trzycentymetrowego naczynia do hodowli komórkowych.
Przechowuj mieszaninę w temperaturze 4 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Po przygotowaniu talerza z jabłkami dodaj na niego cienką warstwę zagniecionej pasty drożdżowej, aby muchy mogły złożyć jaja. Umieść 25 samców i 25 samic much w butelce na talerzu z jabłkami pokrytym ugniatanymi drożdżami.
Owiń plastikowe butelki bulionowe Drosophilas folią aluminiową, aby skłonić muchy do złożenia większej liczby jaj. Trzymaj butelkę do góry dnem w inkubatorze przez noc. Następnego ranka wymień talerz z sokiem jabłkowym na świeży.
Następnie owiń butelkę folią aluminiową i pozwól muchom złożyć jaja przez trzy do czterech godzin. Po złożeniu jaj przez muchy poluzuj jaja z talerza za pomocą wacika. Zbierz zarodki na sitko i umyj je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS.
Umyj zarodki jeszcze trzy razy za pomocą PBS, w 12-dołkowych szalkach hodowlanych. Odśwież zarodki za pomocą 50% wybielacza, w 12-dołkowych szalkach hodowlanych. Po procesie dechorionacji należy przemyć zarodki jeszcze trzy razy PBS.
Przenieś zarodki do trzycentymetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej PBS. I wybierz zarodki w piątym etapie pod mikroskopem, w oparciu o poziom przezroczystości na ich granicach. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów zbierz zarodki w stadium.
Następnie umieść dwa wybrane zarodki na szklanym szkiełku nakrywkowym i usuń nadmiar PBS za pomocą bibuły. Za pomocą drobno skręconej bibułki ustaw zarodki grzbietową stroną do szkiełka nakrywkowego. Następnie przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru silikonowego za pomocą cienkiej igły.
Dodaj małą kroplę pustego oleju węglowego 700 na zarodki i umieść szkiełko nakrywkowe zawierające zarodki do góry nogami na wciętym szkiełku. Pozostawiając trochę miejsca na dole slajdu. Następnie przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka.
Na koniec zbadaj zarodki za pomocą systemu obrazowania konfokalnego, lasera argonowego 488 i obiektywu zanurzeniowego w oleju. Obrazy poklatkowe zostały wykonane z obrazowania na żywo, przy użyciu DE-kadheryny GFP ruchu komórek w ciągu 500 sekund, w celu analizy obszarów wierzchołkowych poszczególnych komórek Drosophila podczas gastrulacji. Po 500 sekundach wyraźnie widoczne jest zwężenie wierzchołkowe i wgłębienie.
Korzystając z naszej metody. Możemy lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne gastrulacji Drosophila, a także przejście nabłonkowe do mezenchymalnego, zaangażowane w przerzuty raka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia procedurę obrazowania na żywo gastrulacji Drosophila, co pozwala na lepsze zrozumienie konstrikcji apikalnej podczas wczesnego rozwoju. Technika ta umożliwia szczegółową analizę ruchów komórkowych zaangażowanych w modyfikację struktury tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Wstęp
- Gastrulacja Drosophila jest krytyczną fazą rozwoju embrionalnego.
- Zrozumienie kształtu i ruchu komórek jest niezbędne do pojęcia procesów rozwojowych.
- Konstrykcja apikalna odgrywa istotną rolę w ruchach morfogenetycznych.
- Techniki obrazowania na żywo mogą dostarczyć informacji na temat dynamicznych zachowań komórkowych.
Cel badania
- W celu lepszego zrozumienia ruchów komórkowych podczas gastrulacji Drosophila.
- W celu opracowania wiarygodnej metody pomiaru morfogenetycznych ruchów komórkowych.
- W celu zidentyfikowania przearanżowań komórek oraz konstrykcji apikalnej podczas gastrulacji.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie specyficznej mieszaniny do obrazowania.
- Obrazowanie na żywo embrionów Drosophila podczas gastrulacji.
- Analiza ruchów komórkowych i zmian kształtu.
- Identyfikacja kluczowych zdarzeń morfogenetycznych.
Główne wyniki
- Pomyślne zarejestrowanie obrazów na żywo z procesu gastrulacji Drosophila.
- Identyfikacja konstrikcji apikalnej i reorganizacji komórek.
- Pogłębienie wiedzy na temat dynamiki komórkowej podczas wczesnego rozwoju.
- Solidna metodologia dla przyszłych badań w dziedzinie biologii rozwoju.
Wnioski
- Procedura dostarcza cennych informacji na temat gastrulacji Drosophila.
- Obrazowanie na żywo jest potężnym narzędziem do badania ruchów komórkowych.
- Wyniki przyczyniają się do szerszego zrozumienia procesów rozwojowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie na żywo zmian kształtu i ruchu komórek podczas gastrulacji Drosophila stanowi solidną platformę do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw przejścia epitelialno-mezenchymalnego (EMT), procesu zaangażowanego w włóknienie i przerzuty nowotworowe. Metoda ta umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację konstrikcji apikalnej i reorganizacji komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w wczesnym etapie walidacji celów dla szlaków związanych z EMT. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną od biologii rozwoju do mechanistycznych badań nad chorobami w obszarze R&D biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów związanych z EMT oraz dynamiki szlaków sygnałowych w żywym kontekście wielokomórkowym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację zdarzeń morfogenetycznych powiązanych z mechanizmami chorobowymi.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla genów kontrolujących konstrikcję apikalną oraz przejścia w losie komórki.
- Zapewnia pewność prognostyczną w priorytetyzacji celów modulujących EMT w portfolio onkologicznym i włóknistym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany system obrazowania do kwantyfikacji ruchu komórek i zmian ich kształtu w czasie rzeczywistym.
- Umożliwia powtarzalny pomiar konstrikcji apikalnej i reorganizacji komórek jako ilościowych wyników analizy.
- Wspiera standaryzację platform do screeningu fenotypowego związków modulujących EMT.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do późniejszych etapów wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje rozwojowe procesy EMT z modelami przerzutów i przebudowy tkanek istotnymi w kontekście chorób.
- dostarcza wglądu w mechanizmy, który pomaga w wyborze translacyjnych biomarkerów do badań przedklinicznych.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka przy rozwoju kandydatów ukierunkowanych na EMT w oparciu o dowody fenotypowe w żywych komórkach.
- Wzmacnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w obszarach chorób napędzanych przez EMT.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania integruje kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez po opracowanie modeli przedklinicznych dla celów związanych z EMT.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie ścieżek dla regulatorów EMT oraz morfogenezy.
- Screening: Dostarcza ilościowe i powtarzalne wyniki dotyczące kształtu i ruchu komórek, umożliwiając optymalizację testów.
- Analityka: Zapewnia dane z obrazowania wysokotreściowego do analizy porównawczej zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy rozwojowe z modelami EMT istotnymi dla chorób w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do różnorodnych badań nad EMT i morfogenezą.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje ryzyko mechanistyczne w programach odkrywania leków celujących w EMT.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne przepływy pracy obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności międzyprojektowej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach w wskazaniach zależnych od EMT.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów modulujących EMT w różnych obszarach terapeutycznych z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obrazowania żywych komórek, mikroskopii konfokalnej oraz embriologii Drosophila.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej aparatury obrazującej oraz oprogramowania analitycznego do analizy time-lapse.
- Dla zapewnienia powtarzalności konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i określania stadiów rozwojowych embrionów pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji konstruktów reporterowych i warunków obrazowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przepustowość oraz konieczność precyzyjnej manipulacji embrionami.
