Name: Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka z tętnic i żył psów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Naucz się izolować pierwotne komórki śródbłonka z naczyń krwionośnych psów. Ta metoda pozwala uzyskać czystą populację komórek do badań nad chorobami układu krążenia i angiogenezą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Hansowi de Graafowi i Tomasowi Veenendaalowi za ich pomoc techniczną w tworzeniu EC.

Oświadczenie etyczne: Naczynia krwionośne użyte w tym badaniu zostały pobrane jako nadwyżka materiału uzyskanego ze świeżych zwłok psów (n= 4) od zdrowych psów poddanych eutanazji do innych niezwiązanych badań (polityka Uniwersytetu 3R). Nieprawidłowe naczynia krwionośne (wewnątrz- i zewnątrzwątrobowe zastawki wrotno-systemowe, n = 1 każde) zostały pobrane pośmiertnie po świadomej zgodzie właścicieli od psów przedstawionych w Klinice Uniwersyteckiej dla Zwierząt Towarzyszących Uniwersytetu w Utrechcie.
1. Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka psów
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć płytki 6-dołkowe 2 ml/studzienkę 0,5% w/v żelatyny i pozostawić na 2 godziny w inkubatorze z nawilżoną atmosferą 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar roztworu żelatyny przed wysiewem komórek pierwotnych.</li>
	<li>W asepcie usuń interesujące Cię naczynia krwionośne (np. aortę, żyłę główną, żyłę główną) ze świeżych zwłok psów (ryc. 1A). Utrzymuj anatomię układu naczyń, umieszczając proste kleszcze na obu końcach naczynia będącego przedmiotem zainteresowania. Unikaj niepotrzebnej manipulacji tkanką za pomocą kleszczy, aby zapobiec uszkodzeniu komórek śródbłonka.
	<ol>
		<li>Przeciąć zaciśnięte naczynie na obu końcach nożyczkami chirurgicznymi i usunąć ze zwłok. Transport w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) na lodzie. 
		UWAGA: Do tej procedury preferowana jest długość naczynia około 5 cm, ale te, które mierzą 1 cm, również zapewnią wystarczającą ilość komórek do hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś naczynie krwionośne na szalkę Petriego wypełnioną lodowatym HBSS. Za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń wszelkie przylegające tkanki i tłuszcz z zewnątrz naczynia, utrzymując samo naczynie w stanie nienaruszonym (ryc. 1B). Upewnij się, że naczynie jest dobrze widoczne przez cały czas cięcia: odciągnij otaczającą tkankę za pomocą zacisku lub kleszczy, aby uzyskać optymalny view.
	<ol>
		<li>Zamknij wszystkie gałęzie naczynia ligaturami (np. poliglaktyną 3-0), a następnie usuń je nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie wejdź do końca naczynia za pomocą zakrzywionych kleszczy do komarów Halsted, zaciśnij końcówkę kleszczy na drugim końcu naczynia, a następnie wycofaj się, powoli odwracając naczynie, aż całkowicie wywróci się na lewą stronę (Rysunek 1C-G). Na zewnątrz znajduje się teraz warstwa komórek śródbłonka. Jeśli napotkasz jakiekolwiek trudności podczas odwracania naczynia, ponownie zanurz się w HBSS, aby zmniejszyć tarcie.</li>
	<li>Umieść szwy sznurkowe na obu końcach naczynia, aby całkowicie je zamknąć i zapobiec narażeniu jakiejkolwiek tkanki naczyniowej nieśródbłonkowej na procedurę trawienia (ryc. 1H). Użyj końców ligatury, aby manipulować odwróconym naczyniem.</li>
	<li>Jeśli trawienie i hodowla są przeprowadzane później, należy dokonać kriokonserwacji odwróconego naczynia przed protokołem trawienia (krok 1.7).
	<ol>
		<li>Umieść odwrócone naczynie w kriowiale i wypełnij pożywką do zamrażania kultur komórkowych. Zamrozić w temperaturze -80 °C za pomocą pojemnika do zamrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C, jeżeli naczynia mają być zużyte w ciągu jednego tygodnia. W przypadku długotrwałego przechowywania należy umieścić kriowiale w temperaturze -180 °C. Podczas izolacji EC należy szybko rozmrozić kriowia w łaźni wodnej (37 °C) i natychmiast umieścić w lodowatym HBSS. Postępować zgodnie ze wskazówkami w 1.7. 
		UWAGA: Należy wziąć pod uwagę, że całkowita wydajność EC po izolacji będzie niższa ze względu na utratę żywotności podczas procesu zamrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść naczynie do probówki o pojemności 50 ml i przepłukać je dwukrotnie w HBSS w celu usunięcia erytrocytów (lub pozostałości pożywki zamrażającej w przypadku rozmrażania) (ryc. 1I).</li>
	<li>Roztrawić naczynie w 50 ml probówce z roztworem 30 ml kolagenazy typu II (0,15 j./ml) i rozlać (0,15 j./ml) w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka psów (CECGM) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z przerywanym delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Wyjąć naczynie z probówki i odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 250 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w CECGM i wysiać 2 ml zawiesiny komórek na studzienkę (1 - 3 dołki w zależności od wielkości naczynia). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w powietrzu i zmieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Przejdź przez komórki, gdy zostanie osiągnięta konfluencja 70 - 80%.
	<ol>
		<li>Umyj komórki wstępnie podgrzanym HBSS, aby usunąć martwe lub nieprzyłączone komórki. Dodać 200 μl rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (1x) do każdej studzienki i umieścić z powrotem w inkubatorze na 5 minut lub do momentu, gdy wszystkie komórki zostaną odłączone.</li>
		<li>Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i zatrzymaj trypsynizację, dodając 10 ml pożywki hodowlanej (CEGM), w tym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Wirować przez 5 minut przy 250 x g. Kontynuować hodowlę na wstępnie pokrytej żelatyną płytce lub kolbie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka
<ol>
	<li>Hoduj komórki śródbłonka aorty psów (CnAOEC) i porównuj morfologię pierwotnych i komercyjnych linii komórkowych dwa razy w tygodniu pod mikroskopem. 
	UWAGA: Typowy wzorzec wzrostu EC w płatach można najlepiej zaobserwować, gdy osiągnięta zostanie konfluencja > 70%.
	<ol>
		<li>Hodowla CnAOEC w CECGM na 0,5% w/v żelatynowej kolbie T75. Komórki przechodzą raz w tygodniu, gdy zbieg wynosi 70 - 80%.
		<ol>
			<li>W celu pasażowania przemyj komórki raz wstępnie podgrzanym HBSS i dodaj 1 ml rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (1x). Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na 5 minut lub do momentu odłączenia wszystkich komórek. Dezaktywować trypsynę, dodając 10 ml pożywki hodowlanej (CEGM) zawierającej 10% FCS. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 250 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
			<li>Pobrać 10 μl podwielokrotności zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:1 0,4% błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i umieść4,0 x 10 5 żywotnych komórek w nowej kolbie T75. Dodać 10 ml wstępnie ogrzanego CECGM do kolby i wyhodować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizolować RNA z pasażu 1 hodowanych CaPEC i CnAOEC.
	<ol>
		<li>Zebrać co najmniej 1 x 103 komórki jako osad, dodać 20 μl odczynnika do przygotowania próbki (SPR) i inkubować przez 1 minutę w celu lizy komórek. Po inkubacji ostrożnie zebrać lizat komórkowy zawierający całkowity RNA i przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć mRNA w cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA (np. iScript) zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowuj cDNA w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia lub w temperaturze -20 °C przez długi czas, aż będzie gotowe do wykonania qPCR.</li>
	<li>Zmierz ekspresję genu markera śródbłonka CD31, aby potwierdzić pochodzenie komórek śródbłonka. Przeprowadzić konfigurację eksperymentalną i kwantyfikację zgodnie z wytycznymi MIQEprécis 10. W celu normalizacji zmierz ekspresję genów referencyjnych GAPDH, RPS19 i B2MG11.
	<ol>
		<li>Przygotować 10-krotne rozcieńczenie otrzymanego cDNA w wodzie wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Przygotuj 4-krotne rozcieńczenie z połączonych próbek cDNA dla linii wzorcowej i użyj wody wolnej od nukleaz jako kontroli bez matrycy. Rozcieńczyć próbki pięciokrotnie, aby osiągnąć 50-krotne całkowite rozcieńczenie dla reakcji qPCR. Pipetować 10 μl reakcji w dwóch powtórzeniach w formacie 384-dołkowym, używając 4 μl cDNA i 6 μl fluoroforu zmieszanego z 20 pmol startera do przodu i do przodu (Tabela 1).</li>
		<li>Ustaw program na 95 °C na 5 minut w celu aktywacji polimerazy Taq, a następnie 39 cykli po 10 sekund w temperaturze 95 °C w celu denaturacji i 30 sekund w Tm w celu wyżarzania i wydłużenia. Tm dla każdego zestawu podkładów przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>Wykonuj analizy krzywej topnienia po każdym przebiegu, aby upewnić się, że tylko jeden produkt jest amplifikowany. Znormalizować poziomy ekspresji próbek, używając średniej względnej ilości genów odniesienia i obliczyć ΔCt, jeśli skuteczność reakcji wynosi od 95% do 105%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń funkcjonalność EC za pomocą testu angiogenezy.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl macierzy zewnątrzkomórkowej do każdego dołka wstępnie schłodzonego szkiełka do angiogenezy i rozprowadzić końcówką pipety, aby pokryć powierzchnię studzienki. Utrzymuj macierz zewnątrzkomórkową na lodzie i unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do żelu. Zestalić żel, umieszczając szkiełko na szalce Petriego z ręcznikami papierowymi nasączonymi wodą w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 30 minut.</li>
		<li>Dodaj 1,0 x 104 pierwotne EC w 50 μl śródbłonka na dołek. Inkubować szkiełko przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Po 6 godzinach rób zdjęcia z 20-krotnym powiększeniem, upewniając się, że na zdjęciu znajduje się cała studnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Failure+Models%3A+Traditional+and+Novel+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Vasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy.</a> Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).</li>
<li>van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+liver+shunts+in+dogs+elucidate+pathways+regulating+embryonic+development+and+clinical+disorders+of+the+portal+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein.</a> Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).</li>
<li>Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phosphorylation+of+the+mTORC2%2FAkt%2F4E-BP1+pathway+in+newly+derived+canine+hemangiosarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines.</a> BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).</li>
<li>Boilson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circulating+progenitor+cells+in+left+ventricular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction.</a> Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolysis+and+proliferative+endarteritis%3A+two+related+processes+in+chronic+infections%3F+The+model+of+the+blood-borne+pathogen+Dirofilaria+immitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).</li>
<li>Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+radicals+mediate+endothelial+cell+damage+by+complement-stimulated+granulocytes.+An+in+vitro+model+of+immune+vascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage.</a> J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).</li>
<li>Aranguren, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+novel+transcription+factor+code+determining+the+human+arterial-specific+endothelial+cell+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature.</a> Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).</li>
<li>van Balkom, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+require+miR-214+to+secrete+exosomes+that+suppress+senescence+and+induce+angiogenesis+in+human+and+mouse+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells.</a> Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).</li>
<li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+%28HUVEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> J. Vis. Exp. (3), e183(2007).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIQE+precis%3A+Practical+implementation+of+minimum+standard+guidelines+for+fluorescence-based+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments.</a> BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).</li>
<li>Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+canine+reference+genes+for+accurate+quantification+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).</li>
<li>Heishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-214+and+MicroRNA-126+Are+Potential+Biomarkers+for+Malignant+Endothelial+Proliferative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases.</a> Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).</li>
<li>Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterisation+of+canine+mitral+valve+interstitial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells.</a> Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).</li>
<li>van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+congenital+portosystemic+shunts%3A+disconnections+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected.</a> The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).</li>
<li>Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+%28VEGF%29+levels+in+the+blood+serum+of+dogs+with+malignant+neoplasms+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.+Hung%22%5BJournal%5D)">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity.</a> Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+study+of+hydralazine%2C+a+potential+anti-angiogenic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent.</a> Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W badaniach koncentrujących się na EC psów pierwotna linia CnAOEC jest używana do modelowania linii śródbłonka psa3, 12, 13. W badaniach na ludziach kultura HUVEC jest nadal uważana za złoty standard. Oczywiste jest, że skupianie się wyłącznie na EC pochodzących z pępowiny jest zdecydowanym ograniczeniem w badaniach sercowo-naczyniowych. Komórki śródbłonka mają specyficzny wzorzec ekspresji genów określający specyfikację tętniczo-żylną. Aby wyjaśnić te różnice w naczyniach poporodowych, przedstawiamy tę nowato...

Psy są używane jako duży model zwierzęcy do badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi i mogą również cierpieć na wrodzone (genetyczne) nieprawidłowości naczyniowe1, 2. Do badania tych chorób często wykorzystuje się komercyjne linie komórkowe śródbłonka do oceny funkcjonalności komórek śródbłonka (EC). Dla psów dostępna jest jedna komercyjna linia komórek śródbłonka (CnAOEC), pochodząca z aorty psów. Ta linia komórkowa jest najczęściej używana w badaniach jako kontrolna normalna EC3-5. W badaniach nad ludzkim układem sercowo-naczyniowym najczęściej stosowanymi liniami komórek śródbłonka są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i ludzkie komórki śródbłonka tętnicy pępowinowej (HUAEC) pochodzące odpowiednio z ludzkiej żyły pępowinowej i tętnicy. HUVEC jest stosowany jako złoty standard w badaniach naczyniowych od 1980 roku6. Uważa się, że jest to klasyczny system modelowy do badania funkcji śródbłonka i adaptacji choroby. Komórki śródbłonka wyizolowane z różnych naczyń krwionośnych różnią się wyglądem i funkcjonalnością ze względu na podłoże genetyczne i ekspozycję na mikrośrodowisko7. Ponadto HUVEC i HUAEC pochodzą z pępowiny, rozwojowej struktury naczyniowej, która może nie w pełni naśladować dorosłe naczynia krwionośne w odniesieniu do warunków, na które są narażone, i odpowiedzi na chorobę. W związku z tym przełożenie wyników uzyskanych w HUVEC i HUAEC na choroby sercowo-naczyniowe w ogóle jest niewystarczające.
Podczas badania adaptacji i zachowania dorosłych EC, pierwotne EC z naczynia będącego przedmiotem zainteresowania powinno być używane jako bardziej bezpośrednie podejście. Aby wyizolować te komórki, opisano kilka metod. Szeroko opisaną metodą, która jest również stosowana w przypadku HUVEC, jest płukanie naczynia roztworem do trawienia enzymatycznego8. Często prowadzi to do zanieczyszczenia substancjami niebędącymi EC, takimi jak komórki mięśni gładkich i fibroblasty9. Inną często stosowaną metodą izolacji jest trawienie enzymatyczne mielonej tkanki naczynia krwionośnego, a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) na podstawie markera komórek śródbłonka Cluster of Differentiation (CD)31,7, 8. Sortowanie FACS i późniejsza hodowla komórek wymaga stosunkowo dużej ilości komórek i dlatego nie nadaje się do izolacji śródbłonka z małych naczyń krwionośnych. W związku z tym naszym celem było opracowanie nowej, solidnej metody izolowania populacji czystych komórek śródbłonka z różnych naczyń krwionośnych psów o wysokiej czystości. Aby przetestować skuteczność nowej metody izolacji, wyizolowaliśmy i uzyskaliśmy czyste hodowle pierwotnych komórek śródbłonka psów (CaPEC) z różnych tętnic i żył psów, zarówno dużych, jak i małych. Metoda ta umożliwia również hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z chorych i/lub nieprawidłowych naczyń krwionośnych, takich jak wrodzone wewnątrz- lub zewnątrzwątrobowe zastawki wrotno-systemowe, co jest powszechną chorobą u psów2. Metoda ta pozwala na wyizolowanie dodatkowych istotnych typów komórek tego samego naczynia, takich jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, ponieważ większość naczynia pozostaje nienaruszona podczas zabiegu.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka psów&nbsp;</td><td>Zastosowania komórkowe</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>Zastosowania komórkowe</td><td>CnAOECs</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Regeneracyjne medium do zamrażania komórek</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Przechowywać na lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne (Mayo lub Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do komarów&nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do komarów zakrzywione</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>poliglaktyna 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna komora licząca</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka liczące, dwukomorowe</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Powoli rozmrażać na lodzie</td></tr> <tr><td>i mikro;-Slide Angiogeneza</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu śródbłonka</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka z tętnic i żył psów

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Choroby sercowo-naczyniowe są badane zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynaryjnej. Komórki śródbłonka były szeroko stosowane jako model in vitro do badania unaczynienia, angiogenezy (guza) i miażdżycy. Obecnym standardem badań in vitro na ludzkich komórkach śródbłonka (EC) jest wykorzystanie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i ludzkich komórek śródbłonka tętnicy pępowinowej (HUAEC). Do badań śródbłonka psów dostępna jest tylko jedna linia komórkowa (CnAOEC), która pochodzi ze śródbłonka aorty psów. Chociaż obecnie nie jest to w pełni zrozumiałe, istnieje różnica między EC pochodzącymi z tętnic lub żył. Aby uzyskać bardziej bezpośrednie podejście do badań funkcjonalności in vitro nad EC, opisujemy nową metodę izolowania pierwotnych komórek śródbłonka psów (CaPEC) z różnych naczyń. Technika ta zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia szybko rosnącymi komórkami, takimi jak fibroblasty i komórki mięśni gładkich, co jest powszechnym problemem w standardowych metodach izolacji, takich jak płukanie naczynia roztworami enzymatycznymi lub mielenie naczynia przed trawieniem tkanki zawierającej wszystkie komórki. Technika, którą opisujemy, została zoptymalizowana dla modelu psa, ale może być łatwo wykorzystana u innych gatunków, takich jak człowiek.

Różne naczynia krwionośne zostały pomyślnie poddane opisanemu protokołowi izolacji (Rysunek 2). Możliwe było wypreparowanie i odwrócenie aorty, żyły głównej, żyły wrotnej oraz tętnicy wieńcowej od zdrowych psów (wszystkie naczynia od każdego psa, n= 4). Przy zastosowaniu tego samego podejścia izolowano EC z dwóch wrodzonych przecieków wrotno-układowych (pozawątrobowego i wewnątrz wątrobowego, po n= 1 każdy). Choć aorta była łatwo odwracalna, segmenty aorty piersiowej stan...

Potrzebne są nowatorskie metody izolacji pierwotnych komórek śródbłonka z naczyń krwionośnych. Protokół ten opisuje nową technikę, która całkowicie odwraca naczynia krwionośne będące przedmiotem zainteresowania, wystawiając tylko stronę śródbłonka na trawienie enzymatyczne. Uzyskana w ten sposób hodowla czystych komórek śródbłonka może być wykorzystana do badania chorób sercowo-naczyniowych, modelowania chorób i angiogenezy.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka z tętnic i żył psów

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Ogólnym celem tej metody jest izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka psów w celu badania chorób układu sercowo-naczyniowego in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych, takie jak zachowanie komórek śródbłonka podczas angiogenezy, angiogenezy nowotworowej oraz miażdżycy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania i hodowli czystej populacji pierwotnych komórek śródbłonka nawet z bardzo małych naczyń krwionośnych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ inwersja i szycie naczynia mogą wydawać się skomplikowane, lecz w rzeczywistości są one łatwe do opanowania w praktyce. Aby wyizolować i hodować pierwotne psie komórki śródbłonka (CAPECs), należy użyć 0,5% żelatyny do wstępnego pokrycia płytek sześciodołkowych, a następnie inkubować je w komorze nawilżanej w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez dwie godziny. Po aseptycznym pobraniu odpowiednich naczyń krwionośnych z psiowskiego zwłok zgodnie z protokołem tekstowym, należy przenieść naczynia krwionośne do szalek Petriego wypełnionych lodowatym HBSS.Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń przylegającą tkankę ora

isolation-culture-primary-endothelial-cells-from-canine-arteries

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródbłonka z aorty brzusznej modelu świni za pomocą jednoetapowego trawienia kolagenazy. Komórki śródbłonka mogą być hodowane do dalszych zastosowań.

Izolacja komórek śródbłonka aorty świń (pAEC): oparta na enzymach metoda izolowania komórek śródbłonka z pobranej aorty brzusznej świni

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Opisana jest skuteczna metoda enzymatyczna do izolacji pierwotnych komórek śródbłonka aorty świńskiej (pAEC) od miniaturowych świń. Wyizolowane pierwotne pAEC mogą być wykorzystane do zbadania odpowiedzi immunologicznej i krzepnięcia w ksenotransplantacji.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka aorty od miniaturowych świń

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Naucz się izolować pierwotne komórki śródbłonka z naczyń krwionośnych psów. Ta metoda pozwala uzyskać czystą populację komórek do badań nad chorobami układu krążenia i angiogenezą.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka z tętnic i żył psów

Przeglądaj więcej filmów