Name: Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj dwufotonową mikroskopię podłużną do śledzenia przebudowy naczyń mózgowych w modelu mysim choroby Alzheimera. Ta metoda pozwala wizualizować zmiany naczyniowe in vivo z minimalną inwazyjnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Ligue Francaise contre l'épilepsie (do M.A-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Grant AVENIR R12087FS (dla F.J), grant od uniwersytetu w Montpellier (dla F.J) oraz grant od Federation pour la Recherche sur le Cerveau (dla N.M.). Dziękujemy za pomoc techniczną ze strony firmy Chrystel Lafont w ośrodku IPAM w Montpellier, gdzie znajduje się główna platforma obrazowania in vivo. Dziękujemy również Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) za korektę manuskryptu.

Myszy mają dostęp ad libitum do pożywienia, wody i są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność. Wszystkie procedury na zwierzętach laboratoryjnych są zgodne z prawem krajowym i europejskim i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (CEEA-LR-00651-01). Do tej procedury wykorzystano łącznie 6 transgenicznych myszy 5xFAD i 4 myszy kontrolne typu dzikiego (WT) z miotu.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Dootrzewnowo (IP) wstrzyknąć Methoxy-X04 (10 mg / kg) 48 godzin przed zabiegiem w celu oznaczenia złogów Aβ11.</li>
	<li>Przygotować sterylny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) (120 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukozy; pęcherzyk z 95% O2/ 5% CO2 przed dodaniem 2,5 mM CaCl2).</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze, żyletkę i wiertło) za pomocą autoklawu lub sterylizatora z gorącymi kulkami przed zabiegiem aseptycznym.</li>
	<li>Wyczyść stół chirurgiczny i płytkę mikroskopu 70% etanolem i przykryj czystą chłonną szmatką.</li>
	<li>Wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę (odpowiednio 75 mg/kg i 10 mg/kg) i przeciwbólowy ketoprofen (2,5 mg/kg) IP.</li>
	<li>Sprawdź odpowiedni poziom znieczulenia za pomocą uszczypnięcia łapy lub ogona.</li>
	<li>Nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy i ogol sierść (od nosa do uszu), unikając wąsów. Krem do depilacji można stosować, o ile następuje dokładne spłukanie wodą, aby zapobiec podrażnieniu skóry. Ogol pozostałą sierść żyletką. Wysterylizuj skórę roztworem antyseptycznym powidonu i jodu.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem lornetkowym i wykonaj nacięcie skóry od uszu do nosa. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę. Naciąć okostną i kilkakrotnie przepłukać czaszkę sterylnym płynem ślimakowym, aby zatamować ewentualne krwawienie.</li>
</ol>
2. Oznaczanie naczyń krwionośnych i przygotowanie cienkiego okienka czaszki (40 min)
<ol>
	<li>Usuń maść do oczu bawełnianą końcówką. Nałóż kroplę miejscowego znieczulenia okulistycznego (tetrakaina 1%) i delikatnie uciskaj skórę wokół oczodołu, aby uzyskać wypukłość.</li>
	<li>Wstrzyknąć izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) sprzężony z dekstranem (70 kDa) (100 mg/kg lub 50 μl roztworu o stężeniu 50 mg/ml; igła insuliny podskórnej) do zatoki zaoczodołowej zgodnie z procedurą opisaną przez Yardeni i współpracowników 12. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Upewnij się, że skóra jest cofnięta, a czaszka jest czysta i sucha wokół wybranego obszaru obrazowania. Nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego wokół okienka urządzenia do montażu na głowie (składającego się z ułożonych w stos żyletek, patrz Rysunek 1) i przyklej wokół obszaru docelowego, delikatnie uciskając przez kilka sekund 10.</li>
	<li>Pociągnij końce skóry do krawędzi okienka urządzenia do montażu na głowie, upewniając się, że obszar jest suchy. Zabezpiecz skórę i krawędź okna niewielką ilością kleju cyjanoakrylowego klasy weterynaryjnej i poczekaj, aż wyschnie (Rysunek 1).</li>
	<li>Zabezpiecz zwierzę na etapie za pomocą urządzenia do montażu na głowie. Spłucz sterylnym płynem CSF i upewnij się, że studzienka między skórą a urządzeniem do montażu na głowie jest idealnie uszczelniona. Owiń mysz kocem survivalowym, aby utrzymać normotermię.</li>
	<li>Wykonać przerzedzenie czaszki w roztworze płynu mózgowo-rdzeniowego, jak opisano wcześniej10. Należy pamiętać, że skóra głowy nie jest całkowicie usunięta. Regularnie zmieniaj aCSF, aby usunąć resztki kości i uniknąć przegrzania tkanek. Wszelkie pozostałe resztki kości można usunąć za pomocą krótkich zaciągnięć powietrza. Rozwiązanie aCSF tłumi również drgania powstające podczas wiercenia. 
	UWAGA: Grubość czaszki myszy waha się od 80 do 150 μm w zależności od wieku zwierzęcia i regionu zainteresowania.</li>
	<li>Za pomocą wiertła dentystycznego (przy średniej prędkości i zadziorach 0,7 mm) rozpocznij rozrzedzanie powierzchni czaszki w obszarze o średnicy 1,0 mm, wykonując regularny ruch pionowy równolegle do czaszki i usuń większość kości gąbczastej (pierwsze 40 - 70 μm). pamiętaj o wymianie płynu CSF co 20-30 sekund i ogranicz nieprzerwane wiercenie do 3-4 sekund. Należy pamiętać, że kość w pobliżu szwów jest silnie unaczyniona. Nałożyć wstępnie nasączoną piankę żelową CSF, aby zatrzymać ewentualne krwawienie.</li>
	<li>Użyj ostrego jednorazowego okulistycznego ostrza mikrochirurgicznego, aby kontynuować ścieńczenie czaszki, uważając, aby nie wywierać nadmiernego nacisku. Końcowy obszar ma średnicę około 0,5 mm i grubość 20 - 35 μm. 
	UWAGA: Ze względu na odrost kości i bliznowacenie konieczne jest dalsze rozrzedzenie okienka podczas każdej sesji obrazowania.</li>
</ol>
3. Mikroskopia dwufotonowa (45 min)
<ol>
	<li>W razie potrzeby wstrzyknąć 19 mg/kg ketaminy w celu utrzymania odpowiedniego znieczulenia. </li>
	<li>Przenieś mysz (przymocowaną do stolika do montażu na głowie) pod dwufotonowym mikroskopem laserowym. Używając obiektywu 20X zanurzonego w wodzie z aperturą numeryczną 1,0, zlokalizuj cieńsze okno czaszki w środku pola optycznego za pomocą lampy epifluorescencyjnej. Upewnij się, że obiektyw jest zawsze zanurzony w CSF.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie laserowe za pomocą lasera impulsowego z blokadą trybu (Ti-Sapphire 680-1040nm). Ustaw długość fali wzbudzenia na 750 nm, aby wykryć emitowaną fluorescencję metoksy-XO4 i FITC-dekstranu odpowiednio w kanałach niebieskim i zielonym. 
	UWAGA: Mikroskop posiada dwa rozdzielacze wiązki o długości fali 506 nm i 555 nm. Światło niebieskie jest wychwytywane przez detektor NDD wyposażony w filtr 470 ± 12 nm. Zielone światło jest wychwytywane przez detektor GaAsP o wysokiej czułości wyposażony w filtr 525 ± 25 nm. Maksymalna moc lasera emitowana przez obiektyw nie powinna przekraczać 10 mW, aby uniknąć uszkodzenia tkanek wywołanego laserem.</li>
	<li>Uzyskaj stos o małym powiększeniu (500 μm x 500 μm, 512 x 512 pikseli; krok 2 μm) przy 0,7-krotnym powiększeniu numerycznym, aby stworzyć mapę 3D do precyzyjnej relokalizacji zwrotu z inwestycji w późniejszych punktach czasowych.</li>
	<li>Uzyskaj mozaikę 4 obrazów o dużym powiększeniu cyfrowym z 2-krotnym zoomem numerycznym (200 μm x 200 μm, 512 x 512 pikseli; krok 1 μm). Korzystając z oprogramowania do obrazowania, przesuwaj okno w krokach co 200 μm, aby uchwycić wszystkie obszary. Głębokość stosów wynosi zazwyczaj 250 μm, zaczynając od powierzchni pial na każdym obrazie mozaiki.</li>
	<li>Przed wyjęciem myszy z mikroskopu zrób zdjęcie lub wykonaj ręcznie narysowaną mapę 2D unaczynienia krwi w celu przyszłej relokacji pola obrazowania.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie i ponowne obrazowanie
<ol>
	<li>Zdejmij urządzenie do montażu na głowie, wywierając przyczepność, trzymając czaszkę pod spodem. Jeśli klej pozostanie przyczepiony do czaszki lub skóry, zeskrob go ostrożnie drobnymi kleszkami. Zszyj skórę głowy i umieść mysz w podgrzewanej klatce, aby monitorować powrót do zdrowia po znieczuleniu przed powrotem do klatki domowej. Nałożyć miejscowy krem z antybiotykiem na szew i wstrzyknąć ketoprofen (2,5 mg/kg) IP przez następne 2 dni.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.1 do 2.5 dla powtarzających się sesji obrazowania. W razie potrzeby należy ogolić kość ostrzem mikrochirurgicznym, aby zapewnić optymalną jakość obrazu. 
	UWAGA: Dodatkowe przerzedzenie za pomocą wiertła dentystycznego może być konieczne, gdy przerwa między sesjami obrazowania jest dłuższa niż jeden miesiąc.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem za pomocą światła epifluorescencyjnego zgodnie z mapą 2D unaczynienia krwi wykonaną z poprzedniej sesji (krok 3.6).</li>
	<li>Rozpocznij dwufotonowe skanowanie laserowe i dostosuj stolik mikroskopu, aby uzyskać wyrównanie w skali mikrometrycznej, korzystając z mapy 3D uzyskanej w kroku 3.4. Przejdź do szczegółowego obrazowania zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja trójwymiarowa i analiza obrazu po akwizycji
<ol>
	<li>Uzyskaj trójwymiarowe rekonstrukcje naczyń krwionośnych i osadów amyloidu za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D, takiego jak IMARIS (używana wersja 8.0 i 7.7.2).</li>
	<li>Użyj wtyczki Normalize Layer w menu przetwarzania obrazu i podmenu zmiany kontrastu, aby uzyskać idealny kontrast dwóch kanałów na całej głębokości stosu obrazów.</li>
	<li>Otwieraj obrazy z tego samego regionu we wszystkich punktach czasowych jednocześnie i zawsze przetwarzaj je równolegle, aby porównać różne punkty czasowe.</li>
	<li>Śledź naczynia za pomocą modułu śledzenia filamentu.
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę filamentu, aby utworzyć nowy filament, pomiń automatyczny znacznik i wybierz metodę automatycznej ścieżki.</li>
		<li>Upewnij się, że wybrany kanał odpowiada obrazowi naczyniowemu i korzystając z funkcji wyboru wskaźnika, kliknij rozwidlenie naczynia, które jest zachowane w sesjach obrazowania, przytrzymując shift + control, aby określić punkt początkowy. Użyj funkcji wyboru wskaźnika i kliknij, przytrzymując Shift, aby wybrać punkty końcowe filamentów. 
		UWAGA: Porównanie uzyskanych szkieletów wykaże zmiany strukturalne układu naczyniowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj analizę płaszczyzna po płaszczyźnie, aby śledzić nowe płytki. Nałóż moduł powierzchniowy na niebieski kanał, aby śledzić wzrost blaszek Aβ. Kliknij ikonę powierzchni, aby utworzyć nową powierzchnię i kontynuować automatyczne tworzenie powierzchni. Użyj metody progowania, aby ustawić i odjąć sygnał tła. Menu statystyk dostarcza danych dotyczących powierzchni poszczególnych depozytów amyloidu.</li>
</ol>

<ol><li>Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cerebral+microvascular+plasticity+from+birth+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).</li>
<li>Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbed+neural+activity+disrupts+cerebral+angiogenesis+during+a+postnatal+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period.</a> Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).</li>
<li>Masamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+sprouting%2C+extension%2C+and+creation+of+new+capillary+connections+with+adaptation+of+the+neighboring+astrocytes+in+adult+mouse+cortex+under+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).</li>
<li>Marchi, N., Lerner-Natoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+remodeling+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular remodeling and epilepsy.</a> Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).</li>
<li>Giannoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+pathology+during+the+progression+of+experimental+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).</li>
<li>Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+amyloidosis+impairs+the+gliovascular+unit+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).</li>
<li>Herzig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+is+targeted+to+the+vasculature+in+a+mouse+model+of+hereditary+cerebral+hemorrhage+with+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.</a> Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates%2C+neurodegeneration%2C+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer%27s+disease+mutations%3A+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Liston, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+glucocorticoid+oscillations+promote+learning-dependent+synapse+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance.</a> Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Klunk, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04%2C+a+systemically+administered+Congo+red+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Cao, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+experience-dependent+molecular+changes+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+attack%3A+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Joseph-Mathurin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+immunization+worsens+iron+deposits+in+the+choroid+plexus+and+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds.</a> Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).</li>
<li>Sadowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technika otwartej czaszki do mikroskopii dwufotonowej in vivo oferuje przewagę w postaci nieograniczonej liczby sesji obrazowania w dużych polach obrazowania13,14. Jednak technika ta powoduje również stan zapalny w obszarze zainteresowania14, często niezgodny lub wpływający na odczyty nerwowo-naczyniowe15. Wręcz przeciwnie, technika przezczaszkowa rozrzedzonej czaszki nie powoduje zapalenia nerwów, umożliwiając wiarygodne obrazowanie struktur naczyniowo-mózgowych i akumulacji bla...

Układ naczyniowy mózgu to wielokomórkowa struktura, która jest anatomicznie i funkcjonalnie sprzężona z neuronami. Dynamiczna przebudowa naczyń zachodzi w trakcie rozwoju mózgu i podczas progresji patologii ośrodkowego układu nerwowego (OUN) 1,2. Powszechnie przyjmuje się, że uszkodzenie naczyń mózgowych jest cechą charakterystyczną wielu chorób OUN, w tym padaczki, choroby Alzheimera (AD), urazowego uszkodzenia mózgu i zapalenia mózgu 3,4. Dlatego śledzenie zmian naczyniowo-mózgowych in vivo staje się istotne podczas modelowania chorób OUN, od początku do fazy przewlekłej. Ponieważ modyfikacje naczyń mózgowych często występują równocześnie z uszkodzeniem lub plastycznością neuronów, obrazowanie układu nerwowo-naczyniowego stanowi kluczowy punkt wyjścia do rozszyfrowania patofizjologii chorób OUN.
Ten protokół opisuje podłużną procedurę opartą na dwóch fotonach, aby śledzić przebudowę układu naczyniowo-mózgowego w mysim modelu AD, postępującą patologię charakteryzującą się wadami naczyń mózgowych na naczyniach dużego i małego kalibru spowodowanymi odkładaniem się blaszki amyloidogennej 5-7. Procedura ta pozwala na wizualizację złogów amyloidu oraz śledzenie ich położenia i wzrostu w odniesieniu do przebudowy nerwowo-naczyniowej w trakcie trwania choroby. Niezbędne barwniki fluorescencyjne są wstrzykiwane przed każdą sesją obrazowania w celu wizualizacji naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych u transgenicznych myszy z AD8. Wielokrotne sesje obrazowania ROI przez przerzedzone okno przezczaszkowe czaszki są nieinwazyjne i są metodą z wyboru do oceny przebudowy nerwowo-naczyniowej w mózgu żywej myszy 2,5,9,10.
Poniższa procedura przedstawia protokół chirurgiczny, akwizycję i przetwarzanie obrazu. Scharakteryzowano wczesną progresję mózgowej angiopatii amyloidowej (CAA), głównie w obrębie dużych tętniczek oponowo-rdzeniowych i penetrujących.

<table><tbody><tr><td>methoxy-X04</td><td>tocris</td><td>4920</td><td>stosować 10 mg/kg</td></tr><tr><td>FITC-Dekstran 70 Kda</td><td>sigma</td><td>46945</td><td>stosować 100 mg/kg</td></tr><tr><td>pianki żelowej/mikory Bloxang</td><td>Bausch i Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ostrze chirurgiczne</td><td>surgistar</td><td>6900</td><td>musi być ostre i nie wgniecione</td></tr><tr><td>lornetka z roztworem antysceptycznym powidon-jod</td><td>betadyna</td><td></td><td></td></tr><tr><td> mikroskop stereoskopowy</td><td>olympus</td><td>SX10</td><td>optymalny kontrast obrazu ma kluczowe znaczenie dla tej procedury</td></tr><tr><td>Mikroskop 2-fotonowy</td><td>zeiss</td><td></td><td>Zeiss LSM 710mp</td></tr><tr><td>drobne nożyczki-toughcut</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>14058-09</td><td>te nożyczki są zoptymalizowane do cięcia skóry i tkanek miękkich</td></tr></tbody></table>

podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób oun

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Przebudowa układu naczyniowego mózgu jest powszechną cechą patologii mózgu. Techniki obrazowania in vivo mają zasadnicze znaczenie dla wykrywania plastyczności lub uszkodzeń naczyń mózgowych występujących z czasem oraz w związku z aktywnością neuronów lub przepływem krwi. Mikroskopia dwufotonowa in vivo pozwala na badanie plastyczności strukturalnej i funkcjonalnej dużych jednostek komórkowych w żywym mózgu. W szczególności preparat z przerzedzonym okienkiem czaszki umożliwia wizualizację obszarów zainteresowania kory mózgowej (ROI) bez wywoływania znacznego stanu zapalnego mózgu. Możliwe są powtarzalne sesje obrazowania korowego ROI, zapewniając charakterystykę cech charakterystycznych choroby w czasie podczas progresji wielu chorób OUN. Ta technika docierania do struktur pialnych w odległości 250 μm od mózgu opiera się na wykrywaniu sond fluorescencyjnych kodowanych przez genetyczne markery komórkowe i/lub ważne barwniki. Te ostatnie (np. dekstrans fluorescencyjny) są używane do mapowania przedziału świetlnego struktur naczyniowo-mózgowych. Kolejnym elementem opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zastosowanie markera in vivo złogów amyloidu, Methoxy-O4, do oceny postępu choroby Alzheimera (AD). Opisujemy również przetwarzanie obrazu po akwizycji wykorzystywane do śledzenia zmian naczyniowych i odkładania się amyloidu. Skupiając się obecnie na modelu choroby Alzheimera, opisany protokół jest istotny dla innych zaburzeń OUN, w których zachodzą patologiczne zmiany naczyniowo-mózgowe.

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji naczyń mózgowych i złogów amyloidu w czasie. W celu znakowania złogów amyloidu wstrzyknięto barwniki fluorescencyjne (methoxy-XO4) 11, a w celu wypełnienia światła naczyń mózgowych zastosowano (FITC-Dextran)1. Moduły oprogramowania do analizy obrazów 3D zostały wykorzystane do stworzenia obrazów 3D stałego pola widzenia zarejestrowanego w kolejnych punktach czasowych. Reprezentatywne obrazy uzyskane z kory somatosensoryc...

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie przebudowy naczyń krwionośnych w mózgu myszy podczas progresji choroby przewlekłej w dłuższych okresach czasu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak rola przebudowy naczyń mózgowych w chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona małoinwazyjna i nie wywołuje stanu zapalnego neuronów, co czyni ją idealną do badania patologii, w których zapalenie odgrywa istotną rolę.Technika ta umożliwia wizualizację naczyń oponowych oraz naczyń penetrujących korę, uzupełniając techniki histologiczne ukierunkowane na wizualizację mikrokapilar w parenchymie bariery krew-mózg. Procedurę zaprezentuje Margarita Arango-Lievano, post-doc z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić stół operacyjny oraz płytkę mikroskopu 70%etanolem, a następnie przykryć je czystą, chłonną ściereczką. Następnie należy sprawdzić odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując ucisk łapy lub ogona. Potem należy nałożyć sterylną maść okulistyczną do oczu i ogolić futro od nosa do uszu za pomocą żyletki.Następnie zdezynfekuj skórę roztworem antyseptycznym jodku po

longitudinal-vivo-imaging-cerebrovasculature-relevance-to-cns

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Jednoczesna ocena hemodynamiki mózgu mózgu i właściwości rozpraszania światła w tkance mózgowej szczura in vivo jest demonstrowana przy użyciu konwencjonalnego wielospektralnego systemu obrazowania odbicia rozproszonego.

Jednoczesna ocena właściwości hemodynamiki mózgu i rozpraszania światła w mózgu szczura in vivo za pomocą wielospektralnego obrazowania odbicia rozproszonego

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

Poznaj dwufotonową mikroskopię podłużną do śledzenia przebudowy naczyń mózgowych w modelu mysim choroby Alzheimera. Ta metoda pozwala wizualizować zmiany naczyniowe in vivo z minimalną inwazyjnością.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Przeglądaj więcej filmów