Name: Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj procedury chirurgiczne i metodykę mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo. Model umożliwia badanie biologii przerzutów i ocenę skuteczności terapii uzupełniających po resekcji guza pierwotnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Jo Hill za pomoc histopatologiczną, dr Johnowi Gleysteenowi za instruktaż techniki chirurgicznej, Tessie Diebel za pomoc w filmowaniu, wszystkim członkom laboratoriów Wong i Coussens za krytyczne spostrzeżenia i dyskusje, a także OHSU Knight Cancer Institute za wsparcie finansowe. Autorzy dziękują za wsparcie od T32GM071388-10 i T32CA106195-11 dla CEG, NCI/NIH, Programu Badań nad Rakiem Piersi Departamentu Obrony, Fundacji Susan G Komen, Fundacji Badań nad Rakiem Piersi oraz Stand Up To Cancer - Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Convergence Translational Research Grant (SU2C-AACR-DT14-14) dla LMC, nagrody Fundacji Women's Health Circle of Giving dla MHW, oraz Brenden-Colson Center for Pancreatic Health do MHW i LMC.

Zwierzęta użyte w poniższym protokole są objęte Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Oregon Health & Science University, który został zaprojektowany tak, aby był zgodny z przepisami Ustawy o Dobrostanie Zwierząt i Polityki Publicznej Służby Zdrowia (PHS).
Utrzymanie sterylnych warunków: Sterylizowane narzędzia powinny być używane i między myszami, powinny być wytarte do czysta sterylną gazą, wypłukane w PBS, a następnie sterylizowane środkiem dezynfekującym 70% etanolu przez co najmniej 15 minut. Do operacji przetrwania należy nosić czepek chirurgiczny, maskę na twarz, fartuch i rękawiczki. Przedoperacyjne przygotowanie zwierzęcia do operacji przeżycia jest zawarte w poniższym protokole. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z listą odczynników i sprzętu.
1. Izolacja i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z pierwotnych guzów sutka
<ol>
	<li>Znieczulić 100-dniowe transgeniczne myszy MMTV-PyMT (FVB/n) dawczyni i utrzymać je w ciągłej sedacji, podając 2% izofluranu przez maskę znieczulającą. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona z brakiem odruchu szczypania stopy.</li>
	<li>W sterylnym otoczeniu należy wyciąć pierwotne guzy sutka od 100-dniowych transgenicznych samic myszy MMTV-PyMT (FVB / n), oddzielając guz sutka od leżącej nad nim skóry i otaczającej tkanki tłuszczowej i / lub węzłów chłonnych za pomocą sterylnych nożyczek. Poddaj znieczulone myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela ręcznie zmiel pierwotne guzy na małe kawałki (~1,0 mm3). Umieść fragmenty guza w 3,0 mg / ml kolagenazy A i 4,0 U / ml DNazy I rozpuszczonej w DMEM. Użyj ~10 ml powyższej pożywki trawiącej na guz o średnicy 1,0 cm.
	<ol>
		<li>Trawienie należy przeprowadzać w sterylnej butelce o pojemności 25 ml ze sterylnym mieszadłem przy ~125 obr./min i temperaturze 37 °C przez 40 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymać trawienie, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do końcowego rozcieńczenia 10% i umieścić całą mieszaninę na mokrym lodzie, gdzie jest utrzymywana.</li>
	<li>Przefiltruj strawioną zawiesinę guza przez nylonowe sitko o wielkości 0,7 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wyrzuć guz pozostały w sitku. Odwirować supernatant przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM na 1,0 cm guza i ponownie przefiltrować przez nylonowe sitko o wielkości 0,7 μm. Policzyć stężenie komórek, a następnie odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10% dimetylosulfotlenku z 90% FBS w stężeniu 2 x 107 żywych komórek/ml. Zawiesiny jednokomórkowe całego guza pierwotnego należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ortotopowe wstrzyknięcie guza sutka
<ol>
	<li>Częściowo rozmrozić zamrożone zawiesiny guza pierwotnego w temperaturze 37 °C, aż zamrożony osad będzie mógł zostać uwolniony z probówki kriogenicznej do 20 ml DMEM i policzyć komórki. Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w DMEM 1:1: preparat błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, wyekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) w stężeniu 1 x 107 komórek/ml (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść znieczuloną biorcę samicy myszy syngenicznej brzuszną stroną do góry i utrzymuj w ciągłej sedacji, podając 2% izofluranu przez maskę anestezjologiczną.</li>
	<li>Wysterylizuj prawe 4. miejsce wstrzyknięcia gruczołu sutkowego za pomocą aerozolu 70% etanolu i nałóż poli(winylopirolidon)-jod za pomocą sterylnego wacika.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl (1 x 106 żywych komórek z zamrożonych zawiesin guza pierwotnego) ukośnie do góry do nieoczyszczonej prawej czwartej gruczołu sutkowego 6 do 10 tygodniowej samicy myszy FVB/n za pomocą strzykawki insulinowej 29 G 0,3 ml.</li>
</ol>
3. Chirurgiczna resekcja ortotopowego guza sutka
<ol>
	<li>38-60 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych należy poddać eutanazji myszy niewykazujące ortotopowej objętości guza w zakresie od 172 do 450 mm3 objętości [długość x (szerokość2)/2] (około 75% myszy, którym wstrzyknięto).</li>
	<li>Umieść znieczulone myszy wykazujące odpowiednią wielkość guza brzuszną stroną do góry pod ciągłą sedacją, podając 2% izofluranu przez maskę anestezjologiczną i potwierdź, że mysz jest odpowiednio znieczulona z brakiem odruchu szczypania stopy. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas sedacji.</li>
	<li>Rozpyl 70% etanolu, aby wysterylizować obszar chirurgiczny otaczający guz pierwotny, a następnie nałóż poli(winylopirolidon)-jod za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. 
	UWAGA: Depilacja w miejscu operacji spowodowała przeczosy skóry i/lub infekcje u ~5% myszy i dlatego została wykluczona z tego etapu (dane nie pokazane).</li>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 1C, wykonaj wstępne nacięcie skóry za pomocą nożyczek przyśrodkowo-ogonowych do guza.</li>
	<li>Następnie wykonaj górne wycięcie skóry (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C) przyśrodkowo do guza. Zwróć uwagę na konieczność kauteryzacji wszelkich naczyń krwionośnych odżywiających guz znajdujący się na skórze przed przedłużeniem nacięcia.</li>
	<li>Kontynuuj nacięcie skóry bocznie (z tyłu guza), a następnie wykonaj górne wycięcie skóry (bocznie do guza) i wycięcie przyśrodkowe (powyżej guza) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Po wycięciu skóry na obwodzie wokół guza (<silna klasa="xfig">Ryc. 1C), podnieś leżącą na powierzchni skórę przyczepioną do guza za pomocą kleszczy, jednocześnie tępo wycinając guz z dala od mięśni ściany brzucha i utrzymując gruczoły sutkowe w stanie nienaruszonym.</li>
	<li>Zidentyfikuj (przez rozwarstwienie) i kauteryzuj duże naczynia biegnące przez 4. i 5. gruczoły sutkowe.</li>
	Wyciąć około połowy 4 i 5 gruczołów sutkowych w miejscu kauteryzacji, aby uwolnić guz, leżącą nad nim skórę i segmenty gruczołów sutkowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).<li></li>
	<li>W przypadku krwawienia zidentyfikuj aktywnie krwawiące naczynia i natychmiast je przyżegaj. Jeśli utracisz więcej niż 250 μl krwi, wyklucz mysz z badania i poddaj ją eutanazji.</li>
	<li>Zamknij miejsca wycięć klipsami do ran za pomocą aplikatora do klipsów do ran (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Usuń klipsy do ran 10 dni po operacji za pomocą środka do usuwania klipsów do ran.</li>
	<li>Podawać podskórnie ciepłą, sterylną sól fizjologiczną (4% masy ciała zwierzęcia) i utrzymywać zwierzę w cieple za pomocą lampy grzewczej. Sprawdzaj zwierzęta co 5-10 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. 
	UWAGA: Podawanie bupiwakainy lub lidokainy zwiększało śmiertelność pooperacyjną (dane nie pokazane). Myszy, które wykazywały oznaki bólu (garbienie się, niechęć do ruchu, brak pielęgnacji) 1 godzinę po operacji zostały poddane eutanazji.
	<ol>
		<li>Gdy mysz w pełni wyzdrowieje, zwróć ją do towarzystwa innych myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja i przetwarzanie krwi i płuc do cytometrii przepływowej i histologii
<ol>
	<li>W punktach końcowych badania należy w razie potrzeby przygotować myszy do różnych ocen histopatologicznych. 90 minut przed eutanazją podać każdej myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie bromodeoksyurydyny (BrdU, 50 μg/g masy myszy) w stężeniu 6,25 μg/μL w 1x PBS. 
	UWAGA: Zamrożone zapasy rozpuszczonej bromodeoksyurydyny zużyć w ciągu 1 miesiąca po przygotowaniu.</li>
	<li>10 minut przed eutanazją, przy znieczuleniu myszy, należy pobrać krew zadoczodołową (>500 μl) za pomocą heparynizowanych kapilarek, a następnie przenieść do probówek pokrytych dipotasowym EDTA trzymanych na lodzie.</li>
	<li>Aby usunąć płuca i pozostałą tkankę sutkową, wykonaj nacięcie w linii środkowej nożyczkami od dolnej części brzucha do ust, aby odsłonić jamę piersiową i otrzewnową (<silna klasa = "xfig">Rycina 2A) i złuść skórę z boku, aby odsłonić również pozostałe prawe 4 i 5 gruczoły sutkowe.</li>
	<li>Wytnij pozostałą tkankę gruczołu sutkowego i zbadaj ją, aby wykluczyć odrost pierwotnego guza, oceniając seryjnie ciętą tkankę zatopioną w parafinie (FFPE) utrwaloną w formalinie za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) (Uzupełniające <silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Aby usunąć płuca, otwórz ścianę brzucha do przepony nożyczkami, a następnie poddaj zwierzę eutanazji, przecinając aortę brzuszną w celu odprowadzenia krwi przed perfuzją płuc (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B-2C).</li>
	<li>Przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej od strony brzucha, unikając płuc i serca. Następnie odsłoń klatkę piersiową, przecinając boczne boki klatki piersiowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Używając igły o rozmiarze 23 na strzykawce o pojemności 20 ml, wykonaj perfuzję płuc za pomocą ~5,0 ml DPBS (~10 ml / min) przez prawą komorę serca, aż płuca staną się całkowicie białe (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E-2F). Natychmiast odetnij serce od głównych naczyń, aby krew nie przedostała się ponownie do płuc.</li>
	<li>Aby tkanka płucna została utrwalona i przetworzona do oceny histopatologicznej, wstrzyknij ~ 1,0 ml 10% formaliny w temperaturze 4 °C do odsłoniętej tchawicy skośnie stroną w kierunku płuc za pomocą igły o rozmiarze 23 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2G-2H). Przerwij wstrzykiwanie, gdy płuca zostaną całkowicie rozszerzone i wypełnione utrwalaczem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I).</li>
	<li>Wyciąć płaty płuc z tchawicy i emersji utrwalić tkankę płucną w neutralnie buforowanej formalinie w celu późniejszego zatopienia parafiny lub zamrożenia pożywki OCT, zgodnie ze standardowymi procedurami histopatologicznymi.</li>
	<li>Ilościowo oceń obciążenie przerzutami w płucach przez seryjne cięcie tkanki płucnej FFPE i oceń skrawki mikrotomów (100 μm, trzynaście sekcji), przez barwienie H&E (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B).</li>
</ol>

<ol><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Res. 8, 212(2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SEER+Cancer+Statistics+Review+1975-2008%22">SEER Cancer Statistics Review 1975-2008</a>. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/</a> (2011).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Breast+Cancer+%28Version+3.2014%29%22">Breast Cancer (Version 3.2014)</a>. , Accessed November 25.
 <a target="_blank" href="http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf">http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf</a> (2016).</li>
<li>Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/annonc/article/23/suppl_7/vii11/144433/Locally-recurrent-or-metastatic-breast-cancer-ESMO">Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).</li>
<li>Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK13196/">Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine</a>. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-3+links+tumor+differentiation+and+dissemination+in+a+luminal+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model.</a> Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Nature. 436, 518-524 (2005).</li>
<li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4548055/">FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis.</a> J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Verkooijen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients%27+refusal+of+surgery+strongly+impairs+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival.</a> Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28303905">Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili sprzeczności z danymi przedstawionymi w niniejszym dokumencie.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Podczas wycinania guza z dala od ściany jamy brzusznej, guz może pozostać przylegający do ściany jamy brzusznej. Zaobserwowano to u <5% myszy, którym wstrzyknięto guz (dane nie pokazane). W przypadku myszy z guzami przylegającymi do ściany jamy brzusznej mysz powinna zostać poddana eutanazji, ponieważ resekcja jest trudna bez pierwotnego wzrostu guza.
Ograniczenia modelu/techniki:
<p class=...

Kobiety w Ameryce Północnej mają ~12% ryzyko zachorowania na raka piersi w ciągu całego życia2; większość z tych osób będzie miała usunięte guzy pierwotne poprzez operację, a następnie, w zależności od podtypu nowotworu, zostanie poddana celowanej, endokrynologicznej, chemioterapii i/lub radioterapii w trybie uzupełniającym3. Przykłady obejmują kobiety, u których zdiagnozowano nowotwory z dodatnim receptorem hormonalnym, otrzymujące terapie antyestrogenowe oraz kobiety z guzami HER2-dodatnimi, otrzymujące terapie ukierunkowane na HER2 z radioterapią/chemioterapią, podczas gdy żadne terapie celowane nie są jeszcze dostępne dla guzów potrójnie ujemnych3. Pomimo postępów w radioterapii, chemioterapii, spersonalizowanych i opartych na hormonach terapiach, które uzupełniają resekcję chirurgiczną, choroba nawraca u 30-70% kobiet, u których zdiagnozowano chorobę w stadium II lub III4, ponieważ terapie są w dużej mierze nieskuteczne w zwalczaniu choroby przerzutowej w odległych narządach, w tym w płucach, kościach, mózgu i/lub wątrobie5. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że gdy choroba przerzutowa występuje przy braku pierwotnego wzrostu guza, oznacza to, że rozsiane komórki nowotworowe prawdopodobnie były już obecne w narządach wtórnych w momencie ostatecznej operacji. Dlatego pilnie potrzebne są terapie zdolne do wyeliminowania lub spowolnienia wzrostu guzów przerzutowych.
Podczas gdy mysie modele de novo kancerogenezy sutka były niezwykle pouczające w ujawnianiu mechanizmów regulujących postęp nowotworowy1, istniejące modele również mają kilka ograniczeń. Jednym z nich jest fakt, że modele transgeniczne de novo zazwyczaj rozwijają guzy pierwotne w wielu gruczołach sutkowych, przy czym obciążenie pierwotnym guzem ogranicza czas trwania badań. Podczas gdy pierwotna ucieczka komórek nowotworowych i wysiewanie przerzutów prawdopodobnie występują na wczesnym etapie progresji nowotworu w tych modelach, szczery rozwój guzów przerzutowych następuje późno i, w zależności od modelu myszy i tła szczepu, często jest częściowo penetrant1. To jeszcze bardziej ogranicza użyteczność modeli de novo do odkrywania cząsteczek regulujących przerzuty w narządach wtórnych oraz do oceny przedklinicznej skuteczności terapii w warunkach adiuwantowych.
Aby obejść te ograniczenia, opracowaliśmy de novo autochtoniczny model przerzutów raka sutka do płuc. Rodzicielskie transgeniczne samice (tj. MMTV-PyMT na tle szczepu FVB/n dla badań opisanych w niniejszym dokumencie) z późnymi nowotworami sutka de novo są w wieku ~100 dni6, w którym to momencie ich pierwotne guzy są chirurgicznie wycinane i enzymatycznie dysocjowane w zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesiny (1 x 106 komórek) są z kolei ortotopowo eksplantowane do 6-7-tygodniowych syngenicznych samic myszy, u których pojedyncze pierwotne guzy sutka rozwijają się w okresie od 38 do 60 dni (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). Przy określonej wielkości guza (od 172 do 450 mm3) myszy biorcy są znieczulane, a guzy pierwotne są chirurgicznie wycinane tak, aby zminimalizować odrost guza w miejscu operacji, co jest zgodne z operacją u kobiet (rysunek uzupełniający 1). Na tle szczepu FVB/n myszy rozwijają histologicznie wykrywalne ogniska przerzutowe w płucach z penetracją 45% przez ~ 115 dni po operacji (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B). Dzięki wydłużonemu opóźnieniu wzrostu guza z przerzutami, model ten jest wyjątkowo przygotowany do dostarczania terapii uzupełniającej oraz do wyjaśniania i oceny podstawowej biologii wpływającej na progresję przerzutów po chirurgicznym usunięciu guzów pierwotnych.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Zamówienie na receptę</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td></td><td>Roche 11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 ml butelka Pyrex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Atlanta Bio&nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,7 i mikro; M Nylonowe sitko&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Sulfotlenek dimetylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Preparat rozpuszczalnej błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu, ekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)</td></tr><tr><td>Poli(winylopirolidon)&ndash; Kompleks jodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0,3 ml strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji małych naczyń</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do ran</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip aplikator do nawijania ran&nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do usuwania klipsów do nawijania AutoClip&nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksyurydyna</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparynizowane rurki kapilarne&nbsp;</td><td>Rurki Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer z dipotasem EDTA&nbsp;</td><td></td><td></td> Strzykawka BD 365974 <td></td></tr><tr><td>20 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Oct-medium zamrażające&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalina, buforowana, 10% (bufor fosforanowy)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g igła</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mysz</td><td>Jackson</td><td>Laboratories 001800</td><td></td></tr></tbody></table>

procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Ograniczającym szybkość aspektem transgenicznych mysich modeli gruczolakoraka sutka jest to, że pierwotne obciążenie guzem w tkance sutkowej zazwyczaj definiuje punkty końcowe badania. W związku z tym badania koncentrujące się na wyjaśnieniu mechanizmów przerzutów de novo w późnym stadium są zagrożone, podobnie jak badania oceniające skuteczność terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na mediatory przerzutów w leczeniu adiuwantowym. Liczne modele mysiego raka sutka zostały opracowane poprzez ukierunkowaną ekspresję dominujących onkoprotein do komórek nabłonka sutka, dając modele zmiennie naśladujące histopatologiczne i zdefiniowane transkryptomem podtypy raka piersi powszechne u kobiet<klasa sup = 'xref'>1. Chociaż wiele nauczyliśmy się na temat biologii karcynogenezy sutka za pomocą tych modeli, ich użyteczność w identyfikacji cząsteczek regulujących wzrost przerzutów w późnym stadium jest zagrożona, ponieważ myszy są zwykle poddawane eutanazji we wcześniejszych punktach czasowych z powodu znacznego obciążenia guzem pierwotnym. Ponadto, ponieważ znaczny odsetek kobiet, u których zdiagnozowano raka piersi, otrzymuje terapię uzupełniającą po chirurgicznej resekcji guzów pierwotnych, a przed pojawieniem się wykrywalnej choroby przerzutowej, pilnie potrzebne są przedkliniczne modele przerzutów de novo jako platformy do oceny nowych terapii ukierunkowanych na ogniska przerzutowe. Aby rozwiązać te niedobory, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo raka sutka, w którym pierwotne guzy sutka są chirurgicznie wycinane, a następnie ogniska przerzutowe rozwijają się w ciągu 115 dni po operacji. Ta długa latencja zapewnia wykonalny model do identyfikacji funkcjonalnie istotnych regulatorów progresji przerzutów u myszy bez guza pierwotnego, a także model do oceny przedklinicznej skuteczności terapeutycznej środków mających na celu blokowanie funkcjonalnie istotnych cząsteczek wspomagających przeżycie i wzrost guza.

Ponad 75% myszy biorców, które otrzymały 1 x 106 komórki z pierwotnych guzów piersi pochodzące od myszy MMTV-PyMT, rozwijają pojedyncze gruczolakowate raki piersi o rozmiarach od 172 do 450 mm3 w ciągu 38–60 dni (dane nie przedstawiono). Myszy kwalifikujące się do randomizacji są następnie włączane do grup badawczych po chirurgicznym usunięciu guzów pierwotnych, jak pokazano (Rysunek 1C). Nawroty guza pierwotnego zidentyfikowano u mniej ...

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Opracowaliśmy nowy mysi model przerzutów raka sutka de novo, który ściśle naśladuje przebieg raka piersi u ludzi, zapewniając przedkliniczną platformę do oceny biologii, leżącej u podstaw progresji choroby z przerzutami oraz skuteczności terapii podawanych w leczeniu uzupełniającym. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Zdrowia i Nauki w Oregonie. Nasz mysi model został opracowany poprzez zebranie enzymatycznie zdysocjowanych guzów pierwotnych od transgenicznych 100-dniowych myszy z wirusem guza sutka polyoma middle T lub MMTV-PyMT wirusa guza sutka.Jeden raz od 10 do szóstego komórki nowotworowe są ortotopowo wstrzykiwane do syngenicznych samic myszy biorców, a guzy pierwotne rozwijają się w okresie od 38 do 60 dni. Myszy z guzami o wielkości od 170 do 450 milimetrów sześciennych są zapisywane do chirurgicznej resekcji guza pierwotnego. Analiza po 115 dniach od operacji wykazała, że myszy mają histologicznie wykrywalne ogniska przerzutów w płucach z penetracją 45%.Ten film przedstawia chirurgiczną resekcję pierwotnego guza sutka, kluczowego elementu przedklinicznego modelu mysiego. Myszom podaje się 2% izofluran, a operację można rozpocząć, gdy odruch szczypania stopy jest nieobecny. Spryskaj skórę pokrywającą guz pierwotny 70% etanolem.Betadine jest następnie nakładana na obszar chirurgiczny, zaczynając od skóry pokrywającej guz, a następnie obszar otaczający guz pierwotny za pomocą sterylnego wacika. Za pomocą nożyczek z końcówką wykonuje się wstępne nacięcie w skórze przyśrodkowej ogonowej do guza pierwotnego. Nacięcie jest przedłużone w kierunku nadrzędnym, przyśrodkowym do guza pierwotnego.Zidentyfikuj i kauteryzuj potencjalne naczynia odżywiające guz z leżącej nad nim skóry. Jeśli wystąpi krwawienie, należy przeprowadzić dalszą kauteryzację. Wykonując boczne nacięcie skóry poniżej guza pierwotnego, należy unikać przecinania leżącego poniżej gruczołu sutkowego, ponieważ mogą być obecne naczynia.Nacięcie skóry jest następnie rozciągane obwodowo wokół guza pierwotnego. Cienkie zrosty w gruczole sutkowym przyśrodkowym do guza są następnie starannie preparowane, oddzielając guz od ściany brzucha. W obrębie tych zrostów mogą znajdować się naczynia krwionośne.Kauteryzuj wszystkie naczynia zidentyfikowane w zrostach przed cięciem. Strzałki wskazują czwarty i piąty prawy gruczoł sutkowy, pokazane powyżej i poniżej guza. Piąty gruczoł sutkowy jest następnie kauteryzowany i wycinany, ponieważ może zawierać małe naczynia, które są trudne do uwidocznienia.Po oddzieleniu guza od ściany jamy brzusznej można zidentyfikować większe naczynia. Naczynie biegnące przez czwarty gruczoł sutkowy jest oznaczone górną strzałką. Leżąca poniżej tętnica udowa jest pokazana przez środkową strzałkę.A duże naczynie zasilające guz między czwartym a piątym gruczołem sutkowym jest oznaczone dolną strzałką. Następnie przeprowadza się kauteryzację wzdłuż dużego naczynia biegnącego między czwartym a piątym gruczołem sutkowym, upewniając się, że unika się kauteryzacji leżącej poniżej tętnicy udowej na nodze. Po zakończeniu kauteryzacji dużego naczynia przeciąć naczynie aż do czwartego gruczołu sutkowego.Zlokalizuj i kauteryzuj drugie duże naczynie biegnące przez czwarty gruczoł sutkowy. Przeciąć naczynie bez przecinania całego gruczołu sutkowego, aby w przypadku wystąpienia krwawienia naczynie można było łatwo zidentyfikować i dalej kauteryzować. Następnie wycina się pozostałą część czwartego gruczołu sutkowego.Pokrywająca ją skóra jest następnie zamykana klipsami do ran za pomocą aplikatora AutoClip Clip Clip Upewnij się, że skóra leżąca nad nią jest wystarczająco oddzielona od ściany brzucha, aby uniknąć przycięcia mięśnia znajdującego się pod spodem. Zbliż do siebie boczne i środkowe krawędzie rany, unosząc skórę w kierunku przednim, aby założyć klips na ranę.Upewnij się, że nie przycinasz dróg moczowo-płciowych lub leżącego pod nimi mięśnia prawej nogi. Mobilizacja prawej nogi poprzez usunięcie taśmy może pozwolić na łatwiejsze założenie klipsów na rany. Klipsy do ran należy usunąć 10 dni po zabiegu.Chirurgiczna resekcja guza pierwotnego pokazanego na tym filmie pozwala na rozwój rozsianych komórek rakowych w ogniskach przerzutowych w płucach 115 dni po operacji, gdzie pokazano przedstawiciela każdego z nich na obrazie ognisk przerzutowych. Biorąc pod uwagę, że duży odsetek kobiet, u których zdiagnozowano raka piersi, przechodzi chirurgiczne usunięcie guza i może ulec chorobie przerzutowej po operacji, ustaliliśmy przedkliniczny model mysi, który naśladuje przebieg choroby i leczenia pacjenta. Rejestrując metodologię chirurgicznego usuwania pierwotnego guza sutka, ten kluczowy element naszego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo można łatwo odtworzyć w celu oceny biologii choroby przerzutowej po resekcji guza i skuteczności terapii uzupełniającej.

surgical-procedures-methodology-for-preclinical-murine-model-de-novo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Mysi model przerzutów do mózgu raka piersi jest tworzony za pomocą obrazowania ultradźwiękowego we wstrzyknięciu dosercowym komórek MDA-MB231/Br-GFP. Rozwój wieloogniskowych przerzutów wewnątrzczaszkowych monitorowano podłużnie za pomocą rezonansu magnetycznego 9,4 T o wysokiej rozdzielczości.

Iniekcja dosercowa pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego w celu opracowania mysiego modelu przerzutów raka piersi do mózgu, a następnie podłużnego rezonansu magnetycznego

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

W tym protokole opisujemy mysi model niekompletnej chirurgicznej resekcji mięsaka tkanek miękkich do testowania terapii (neo)adjuwantowych.

Mysi model niekompletnie wyciętego mięsaka tkanek miękkich do testowania terapii (neo)adjuwantowych

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj procedury chirurgiczne i metodykę mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo. Model umożliwia badanie biologii przerzutów i ocenę skuteczności terapii uzupełniających po resekcji guza pierwotnego.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Przeglądaj więcej filmów