Name: Histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę histologiczną do ilościowej oceny zawału mięśnia sercowego u szczurów z wykorzystaniem systematycznego pobierania próbek i analizy obrazu. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie rozmiaru zawału oraz zmian w lewej komorze serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez Szwajcarską Fundację Narodową [SNF 310030-149986 do MNG], Uniwersytet we Fryburgu i Szpital we Fryburgu.

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Europejską Konwencją o Opiece nad Zwierzętami. Zabiegi chirurgiczne zostały wykonane zgodnie ze szwajcarską ustawą o ochronie zwierząt po uzyskaniu zezwolenia Państwowego Urzędu Weterynaryjnego we Fryburgu, zatwierdzonego przez Szwajcarski Federalny Urząd Weterynaryjny, Szwajcaria.
1. Zbieranie serc
UWAGA: Wszystkie interwencje chirurgiczne były wykonywane w znieczuleniu izofluranem. Podjęto wysiłki, aby zmniejszyć cierpienie zwierząt. W szczególności wszystkie zwierzęta otrzymały podskórne wstrzyknięcie w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny przed znieczuleniem. Chirurgiczny protokół indukcji zawału mięśnia sercowego został wcześniej opisany w innym miejscu13.
<ol>
	<li>Wykonać sternotomię u zwierzęcia z zawałem mięśnia sercowego w znieczuleniu (zwierzę zaintubowane, 2,5% izofluranu, znieczulenie właściwe potwierdzone odruchem szczypania łapy).
	<ol>
		<li>Otwórz zwierzę, przecinając skórę, a następnie mięśnie nożyczkami chirurgicznymi. Wytnij żebra po lewej i prawej stronie, a następnie usuń klatkę piersiową.</li>
		<li>Usuń zrosty pozostałe po poprzednim zabiegu (podwiązanie LAD). Przetnij aortę i usuń serce. Umieść chusteczkę w 1 M KCl (w PBS), a następnie umyj ją PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Umieść serce z zawałem wzdłużnie w akrylowej matrycy serca szczura. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wytnij serce bezpośrednio w matrycy za pomocą żyletki z poprzecznym otworem. Upewnij się, że każdy plasterek ma grubość 2 mm. Wytnij około 5-7 slajdów na każde serce (w zależności od poziomu przebudowy); Nazywa się to systematycznym pobieraniem próbek.</li>
	<li>Na tym etapie barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) jest opcjonalne (należy zachować orientację plastrów serca od podstawy do wierzchołka).
	<ol>
		<li>Inkubować w 1% TTC w PBS przez 50 minut w temperaturze 37 °C. Inkubować w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut do 1 godziny. Umieścić skrawki między dwiema szklanymi płytkami z 2-milimetrowymi przekładkami i robić zdjęcia za pomocą mikroskopu stereologicznego sprzężonego z kamerą przy 15-krotnym powiększeniu. 
		ostrożność! Paraformaldehyd jest toksyczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie szkiełka (1. opcja)
	<ol>
		<li>Umieść każde szkiełko w plastikowej formie (10 x 10 x 5 mm) z podłożem montażowym do kriotomii (optymalna temperatura cięcia, OCT), zachowaj orientację (umieść wierzchołkową stronę sekcji w dół na dnie formy). Zamrozić bloki z oparami 2-metylobutanu pod chłodzeniem ciekłym azotem przez 10 - 15 min. Na koniec należy przechowywać tkankę w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parafinizacja (2. opcja)
	<ol>
		<li>Umieść każdy szkiełko w kasetach do zatapiania (zachowaj orientację, umieszczając stronę sekcji zorientowaną wierzchołkowo na dole kasety), a następnie w 4% PFA na 24 godziny. Włóż go na noc do procesora tkanek.
		<ol>
			<li>Inkubować w etanolu 70% przez 2 godziny. Inkubować w etanolu 95% przez 2 godziny. Inkubować w etanolu 100% przez 3 godziny. Inkubować w ksylolu przez 4 godziny. Inkubować w parafinie (stopionej w temperaturze 60 °C w piecu) przez 5 godzin. Na koniec uformuj bloki, zatapiając każdy szkiełko serca w parafinie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie trichromowe Massona-Goldnera
<ol>
	<li>Wykonać skrawki tkanek z bloków parafinowych za pomocą mikrotomu ręcznego (grubość: 5 μm) lub z bloczków OCT z kriostatem ustawionym na -18 °C (grubość: 7 μm).</li>
	<li>Wybarwić jedno szkiełko z każdej części serca dla każdego szczura (3 - 4 przekroje poprzeczne na szkiełko) barwieniem trichromowym Massona-Goldnera (patrz załącznik). 
	UWAGA: Zacznij od tego kroku dla sekcji parafinowych.
	<ol>
		<li>Stopić szkiełka w temperaturze 60 °C w piekarniku. Pod wyciągiem odparafinować je w ksylolu dwukrotnie przez 10 minut każdy. Nawadniaj je w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej przez 3 minuty każde. 
		UWAGA: Zacznij od tego kroku w przypadku kriosekcji.</li>
		<li>Napraw je w roztworze Bouina na noc. Następnie płucz je pod bieżącą wodą z kranu przez 10 - 15 minut. Opłucz je w wodzie destylowanej. Inkubuj je w hematoksynie Mayera przez 3 minuty.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka i pozostaw je w wodzie destylowanej na 5 minut. Następnie inkubuj je w kwasie Fuchsin-Ponceau przez 5 minut. Opłucz je w 1% kwasie octowym przez 1 min.</li>
		<li>Następnie inkubuj je w kwasie fosfomolibdenowym Orange G przez 1 min. Opłucz je w 1% kwasie octowym przez 1 min, inkubuj w jasnozielonym barwniku przez 10 min i płucz w 1% kwasie octowym przez 1 min.</li>
		<li>Odwodnić je w 70% etanolu (30 sekund), 95% etanolu (30 sekund) i 100% etanolu (5 minut). Nałóż jedną kroplę żywicznego podłoża mocującego na skrawki tkanki, przykryj je szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza wielkości zawału
<ol>
	<li>Uzyskaj jeden obraz z każdego szkiełka na mikroskopie stereoskopowym (powiększenie 15x) w połączeniu z kamerą. Sfotografuj linijkę z tymi samymi ustawieniami.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć grubość blizny w środku zawału, grubość przegrody, obszar jamy lewej komory (LV), obszar zawału i obszar tkanki lewej komory za pomocą.
	<ol>
		<li>Ustaw skalę za pomocą obrazu linijki (Rysunek 1A).
		<ol>
			<li>Kliknij Pomiary, a następnie wybierz Ustaw współczynnik konwersji. Narysuj linię na pasku kalibracji. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazku i kliknij Zakończ kalibrację. Zanotuj wartość słupka, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz LV z poplamionego obrazu serca (Rysunek 1B). Użyj narzędzia Wiele segmentów. Wybierz LV punkt po punkcie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Kopiuj/Wklej w dowolnym miejscu.</li>
		<li>Zmierz grubość blizny i przegrody za pomocą jednosegmentowego narzędzia pomiarowego (Rysunek 1C).</li>
		<li>Automatycznie wykrywaj wnękę niskiego napięcia, zawał i obszary niskiego napięcia za pomocą narzędzia do automatycznego pomiaru obszaru w trybie RGB (rysunek 1D).
		<ol>
			<li>Kliknij narzędzie. Aktywuj tylko obramowania i ciągłe w trybie RGB. Na koniec kliknij wewnątrz obszaru zainteresowania, aby go wykryć. W razie potrzeby użyj precyzyjnych narzędzi.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz rozmiar zawału jako stosunek powierzchni zawału do obszaru LV.</li>
	<li>Obliczyć wskaźnik rozszerzalności w następujący sposób: [powierzchnia lewej komory / cała powierzchnia lewej komory] / [grubość zawału / grubość przegrody], przy czym cały obszar lewej komory obejmuje zarówno jamę lewej komory, jak i obszar tkanki lewej komory.</li>
	<li>Na koniec oblicz "średnią" dla każdego serca w następujący sposób: [średnia wskaźnika ekspansji ze szkiełek z zawału] * [Liczba szkiełek z zawałem / Całkowita liczba szkiełek].</li>
</ol>

<ol><li>Amsterdam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+Guideline+for+the+Management+of+Patients+with+Non-ST-Elevation+Acute+Coronary+Syndromes%3A+a+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Practice+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines.</a> J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).</li>
<li>Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+in+heart+failure%3A+current+concepts+in+clinical+significance+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).</li>
<li>Frobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Troponin+I+for+Infarct+Size+to+Improve+Preclinical+Myocardial+Infarction+Small+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models.</a> Front Physiol. 6, 353(2015).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).</li>
<li>Guex, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-functionalized+electrospun+matrix+for+biograft+development+and+cardiac+function+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization.</a> Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117, 1388-1396 (2008).</li>
<li>Valente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heart+sampling+and+systematic+evaluation+of+cardiac+therapies+inmouse+models+of+ischemic+injury%3A+Assessment+of+cardiacremodeling+and+semi-automated+quantification+of+myocardial+infarctsize%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize.</a> Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).</li>
<li>Csonka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+myocardial+infarct+size+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).</li>
<li>Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myocardium+infarction+in+rats%3A+Analysis+of+the+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arq.+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model.</a> Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).</li>
<li>Lichtenauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+using+geometric+angle+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation.</a> Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).</li>
<li>Lutgens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myocardial+infarction+in+the+mouse%3A+cardiac+structural+and+functional+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes.</a> Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+heart+failure+in+rat%3A+double+thoracotomy+for+myocardial+infarction+and+epicardial+implantation+of+cells+and+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix.</a> J Vis Exp. , e51390(2014).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> Am Heart J. 101, 593-600 (1981).</li>
<li>Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+myocardial+infarct+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion.</a> Circulation. 78, 186-201 (1988).</li>
<li>Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+administration+after+myocardial+infarction+promotes+early+infarct+expansion.+A+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat.</a> J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Tkankę zwłóknieniową można dokładnie ocenić w modelu szczura z przewlekłym zawałem mięśnia sercowego przy użyciu systematycznego pobierania próbek serca i analiz obrazów trójbarwnych wycinków histologicznych uzyskanych od podstawy do wierzchołka. Dwa kroki są szczególnie ważne dla pomyślnego wdrożenia protokołu. Po pierwsze, zastosowanie KCl do pobierania serca pozwala na utrzymanie mięśnia sercowego w stanie zrelaksowanym. Ten krok jest ważny...

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Główną przyczyną jest choroba niedokrwienna serca; Zawał mięśnia sercowego wynika z niedokrwienia następującego po zdarzeniach wieńcowych, takich jak niedrożność. Gdy reperfuzja nie zostanie wykonana w ciągu pierwszych 6 godzin, niedokrwienie wywołuje nieodwracalną martwicę mięśnia sercowego. U pacjentów charakterystyka zawału mięśnia sercowego opiera się na różnych narzędziach diagnostycznych, w tym objawach klinicznych, elektrokardiografii, ocenie poziomów biomarkerów w osoczu, echokardiografii, obrazowaniu MRI i analizach histologicznych1. Ostra i przewlekła zawała mięśnia sercowego jest klasyfikowana jako dwie różne fazy urazu w zależności od czasu martwicy mięśnia sercowego w stosunku do czasu niedrożności naczyń wieńcowych. Ostra faza, występująca w ciągu pierwszych 7 dni, wiąże się z utratą kardiomiocytów, rozległym stanem zapalnym i rekrutacją fibroblastów. Faza podostra, charakteryzująca się gojeniem się tkanki serca i powstawaniem blizny, występuje od 1 do 4 - 6 tygodni. Rozszerzenie zawału, ścieńczenie ściany komory i poszerzenie komory charakteryzują fazę przewlekłą. Rozległa przebudowa lewej komory stopniowo prowadzi do ciężkiej niewydolności serca2.
MI wywołane stałym podwiązaniem lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) reprezentuje standardowy model przewlekłego zawału mięśnia sercowego u gryzoni. Więzadło wieńcowe naśladuje niedrożność naczyń wieńcowych. Wielkość zawału zależy od miejsca ligatury. Charakterystyka uszkodzenia niedokrwiennego mięśnia sercowego w modelu gryzoni jest klasycznie przeprowadzana przy użyciu poziomów biomarkerów w osoczu, takich jak troponina I i T3, echokardiografia, rezonans magnetyczny i histologia4,5. Poziomy biomarkerów są skorelowane ze stopniem śmierci kardiomiocytów. Echokardiografia ocenia upośledzenie funkcji lewej komory wynikające z nieprawidłowości ruchomości regionalnej ściany. Ponadto nieinwazyjne techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny lub echokardiografia o wysokiej rozdzielczości, pozwalają na ocenę zmniejszenia ruchomości ściany, objętości obszaru blizny ze zmniejszoną perfuzją i żywotną mięśniem sercowym oraz ścieńczenia ściany. Wymiary LV pozwalają na dokładną ocenę wielkości zawału. Wreszcie, oznaczanie ilościowe żywotnego i martwego mięśnia sercowego można przeprowadzić post mortem przy użyciu specyficznych barwień histologicznych skrawków pobranych serc i umożliwia weryfikację wielkości zawału (IS). Kolejną ważną funkcją jest ocena wskaźnika rozszerzalności zawału (EI)6. EI jest związany z zawałem przezściennym i rozpoczyna się w ciągu pierwszych 3 dni. EI charakteryzuje się postępującym zmniejszaniem grubości ścianek, wzrostem wielkości wnęki nn, a co za tym idzie zmianami kształtu lewej kominy.
Aby ocenić skuteczność terapeutyczną nowych metod leczenia - w szczególności strategii regeneracyjnych opartych na komórkach, matrycach i dostarczaniu genów - dokładna ocena MI u gryzoni ma ogromne znaczenie. Przy pomiarze na pojedynczym przekroju poprzecznym uzyskanym na poziomie mięśnia brodawkowatego, rozmiar IS może być obciążony ze względu na dużą zmienność, która występuje w rozwoju zawału po podwiązaniu LAD; Zawał wierzchołka może być wtedy zakryty. Co ważne, dokładniejsze metodologie określania wielkości MI opisano dla myszy7-9 lub szczurów10. Niemniej jednak IS jest niewystarczające do dokładnego ilościowego określenia przebudowy lewej komory lub terapeutycznie wywołanych redukcji (lub zapobiegania) przebudowy. Rzeczywiście, IS jest zwykle wyrażany jako procent całkowitej objętości lewej komory oceniany na przekrojach serca. Chociaż metoda ta jest ważna w przypadku ostrego zawału mięśnia sercowego, ścieńczenie ściany lewej komory zachodzące podczas przebudowy pozostaje niedostatecznie ocenione11,12. Pełna morfometryczna kwantyfikacja wielkości zawału i zmian strukturalnych powinna określić ilościowo kilka parametrów, takich jak długości i średnice wsierdzia i nasierdzia, a także zawał i zdrowe obszary. Opisujemy podejście metodologiczne do dokładnej oceny zawału mięśnia sercowego i przebudowy w przewlekłym modelu szczura.

<table><tbody><tr><td>Akrylowa matryca serca szczura 2 mm</td><td>72-5015</td><td>Harvard Appartus</td><td></td></tr><tr><td>Inspira zaawansowany respirator z regulacją objętości</td><td>Harvard Aparat 557058</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cewnik Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoksylina</td><td>MHS32-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuchsin CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Xylidin CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Orange G CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Jasnozielony CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>10315083</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>10303990</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>M32631-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereogiczny</td><td>SM2800</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do zatapiania</td><td>K113.1</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>Bersoft Oprogramowanie</td><td></td> do pomiaru obrazu <td>Bersoft.com</td><td>Licencjonowane oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Zawał mięśnia sercowego definiowany jest jako śmierć kardiomiocytów z powodu przedłużającego się niedokrwienia; reakcja zapalna i powstawanie blizn (zwłóknienie) następują po urazie niedokrwiennym. Po początkowej ostrej fazie, przewlekła przebudowa lewej komory (LV) modyfikuje strukturę i funkcję serca. Stałe podwiązanie naczyń wieńcowych u małych zwierząt jest szeroko stosowane jako model referencyjny dla przewlekłego modelu zawału serca. Ścieńczenie ściany zawału stopniowo rozwija się do zwłóknienia przezściennego. Często przeprowadza się histologiczną ocenę wielkości zawału; Brakuje jednak standaryzacji metod oznaczania ilościowego. W rzeczywistości ważne aspekty metodologiczne, takie jak liczba analizowanych odcinków oraz metody pobierania próbek i kwantyfikacji, zwykle nie są opisane, a zatem uniemożliwiają porównanie między badaniami. Zbyt często kwantyfikacja jest wykonywana na pojedynczym odcinku uzyskanym na poziomie mięśni brodawkowatych. Ponieważ badane są nowe strategie mające na celu zmniejszenie ekspansji i przebudowy zawału, istnieje ważna potrzeba standaryzacji dokładnych protokołów pobierania próbek serca. Opisujemy dokładną metodę ilościowego określania wielkości zawału przy użyciu systematycznego pobierania próbek pobranego serca szczura i analiz obrazowych trójchromatycznych barwionych skrawków histologicznych uzyskanych od podstawy do wierzchołka. Przedstawiamy również dowody na to, że obliczenie wskaźnika ekspansji (EI) pozwoliło na ocenę wielkości zawału, biorąc pod uwagę zmiany lewej komory w trakcie przebudowy.

Sześć tygodni po podwiązaniu LAD, pobrano serca szczurów szczepu Lewis. Uzyskano przekroje tkanki o grubości 2 mm, od wierzchołka do podstawy. Wykonano procedurę barwienia TTC w celu wizualizacji obszaru zawału, który barwi się na biało, oraz zdrowego mięśnia sercowego, który barwi się na czerwono (Rysunek 2). W zależności od miejsca podwiązania LAD wielkość zawału jest zmienna. W przypadku rozległego MI zaobserwowano zawały transmuralne od wierzchołka do podstawy (<stron...

Pośmiertna ocena zawału mięśnia sercowego (MI) u gryzoni opiera się na ilościowym określeniu zawału na barwionych odcinkach serca. Opisujemy dokładną metodę ilościowego określania wielkości zawału przy użyciu systematycznego pobierania próbek pobranych serc szczurów od podstawy do wierzchołka oraz analiz obrazowych skrawków histologicznych barwionych trichromem.

Histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Ogólnym celem tej procedury histologicznej jest przeprowadzenie ilościowej analizy morfometrycznej wskaźnika rozszerzenia zawału oraz parametrów strukturalnych serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u szczura, aby ocenić wielkość zawału i przebudowę lewej komory. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii, takie jak wpływ terapii regeneracyjnej po zawale mięśnia sercowego lub nowe strategie mające na celu ograniczenie rozszerzania się zawału. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie systematycznego próbkowania pobranego serca szczura, co pozwala na dokładną ocenę wielkości zawału oraz uwzględnienie zmian w lewej komorze w trakcie przebudowy.Zastosowanie tej metody pozwala na określenie wielkości obszaru zawału w przewlekłym szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego. Można ją również zastosować u myszy lub w innych modelach niedokrwiennych, takich jak ostry zawał mięśnia sercowego lub niedokrwienie i reperfuzja. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić sternotomię u zwierzęcia z zawałem mięśnia sercowego w znieczuleniu.Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry i mięśni wzdłuż mostka. Następnie przetnij żebra po lewej i prawej stronie, aby usunąć klatkę piersiową. Po tym zabiegu usuń zrosty pozostałe po ligacji LAD.Przeciąć aortę i usunąć serce, a następnie umieścić tkankę w PBS z 1 M chlorkiem potasu na mniej niż jedną minutę, po czym wypłukać ją za pomocą PBS. W celu zachowania tkanki należy ostrożnie usunąć PBS z wnętrza komór. Następnie przenieść zawałowate serce na akrylową matrycę do serca szczura i ustawić je wzdłużnie.Następnie przechowywać w temperaturze -20 °C przez jedną godzinę. W celu systematycznego pobierania próbek po godzinie, przeciąć serce bezpośrednio w matrycy za pomocą żylletki. Należy upewnić się, że każdy przekrój ma grubość 2 mm.Następnie przeprowadź barwienie TTC, inkubując przekroje w 1% TTC przez 15 minut w temperaturze 37 degrees celsius, a następnie inkubuj je w 4% PFA od 20 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie umieść przekroje pomiędzy dwiema szklanymi płytkami z dwumilimetrowymi dystansami i wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu stereologicznego sprzężonego z kamerą przy powiększeniu 15x. Procedurę barwienia TTC przeprowadzono w celu wizualizacji obszaru zawału, który pojawia się w kolorze białym, oraz zdrowego mięśnia sercowego, który pojawia się w kolorze czerwonym.W przypadku rozległego zawału mięśnia sercowego obserwowano zawały transmuralne od wierzchołka do podstawy. Mniejsze zawały objawiały się białą, martwiczą tkanką widoczną od wierzchołka do środkowej części serca. W przypadku małych zawałów nietransmuralnych tkankę włóknistą zaobserwowano tylko w jednym lub dwóch przekrojach od wierzchołka.Aby zamrozić skrawki, umieść każdy z nich w plastikowej formie z medium montażowym do kriotomii, kierując wierzchołek w dół formy. Zamrażaj bloki w oparach 2-metylobutanu przy chłodzeniu ciekłym azotem przez 10 do 15 minut. Następnie przechowuj tkanki w temperaturze -80 °C.W celu parafiniowania należy umieścić każdy przekrój w kasecie do zatapiania, kierując wierzchołkiem do dołu, a następnie przechowywać kasety w 4% PFA przez 24 godziny. Po tym czasie należy umieścić je w procesorze do tkanek na noc. Po zakończeniu procesu należy przygotować bloki, zatapiając każdy przekrój serca w parafinie.W tej procedurze przygotuj 5-mikronowe skrawki tkanek z bloków parafinowych za pomocą manualnego mikrotomu. Następnie zabarw jeden preparat z każdego przekroju serca każdego szczura metodą barwienia trichromowego Massona-Goldnera. W przypadku skrawków parafinowych rozpuść parafinę w tkankach w temperaturze 60 °C w piecu.W komorze wyciągowej odparafinizować preparaty w ksylolu dwukrotnie, po dziesięć minut każde z myć. Następnie nawodnić je kolejno w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu, a następnie w wodzie destylowanej, przez trzy minuty na każdym etapie. Odparafinizowane oraz mrożone skrawki utrwalić w roztworze Bouina przez noc.Następnego dnia płukać je w bieżącej wodzie z kranu przez 10 do 15 minut, a następnie ponownie wypłukać wodą destylowaną. Fixacja w płynie Bouina jest najważniejszym etapem zapewniającym doskonałe barwienie metodą Goldnera. Inkubować je w hematoksylinie Mayera przez trzy minuty.Po trzech minutach wyjąć preparaty i pozostawić je w wodzie destylowanej na pięć minut. Następnie inkubować je w barwniku ponceau acid fuchsin przez pięć minut, a potem płukać 1% kwasem octowym przez jedną minutę. Kolejno inkubować skrawki w kwasie fosfomolibdenowym z pomarańczem G (phosphomolybdic acid orange g) przez jedną minutę, a następnie płukać je 1% kwasem octowym przez jedną minutę.Inkubować w barwniku zielonym jasnym (light green) przez dziesięć minut, a następnie płukać w 1% kwasie octowym przez jedną minutę. Na koniec sekcje odwodnić kolejno w 70% etanolu przez 30 sekund, 95% etanolu przez 30 sekund oraz 100% etanolu przez pięć minut. Nanieść jedną kroplę żywicznego medium montażowego na sekcje tkanek, przykryć je szkiełkami podstawkowymi i odstawić do wyschnięcia.Na tym etapie należy wykonać jedno zdjęcie z każdego preparatu, używając stereomikroskopu z kamerą przy 10-krotnym powiększeniu. Należy sfotografować linijkę przy tych samych ustawieniach. Z każdego przekroju serca wycięto cienkie sekcje o grubości 5 µm, które następnie zabarwiono metodą trichromu Massona-Goldnera.Zdrowe tkanki pojawiły się na czerwono, a tkanka łączna na zielono. Następnie należy użyć oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć grubość blizny w środku obszaru zawału, grubość przegrody, powierzchnię jam lewej komory, powierzchnię zawału oraz powierzchnię tkanki LV. W tym celu należy ustawić skalę na podstawie zdjęcia linijki.Kliknij w pomiary i wybierz ustawienie współczynnika konwersji. Narysuj linię na pasku kalibracyjnym. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie i wybierz zakończ kalibrację.Zanotuj wartość paska, a następnie kliknij OK. Użyj narzędzia do wieloodcinkowego pomiaru, aby zaznaczyć LV punkt po punkcie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skopiować i wkleić w dowolnym miejscu. Po tym zmierz grubość blizny i przegrody, używając narzędzia do pomiaru pojedynczego odcinka. Następnie automatycznie wykryj jamę LV, obszar zawału oraz obszary LV, używając narzędzia do automatycznego pomiaru obszarów w trybie RGB.W trybie RGB aktywuj wyłącznie opcje borders oraz contiguous. Na koniec kliknij wewnątrz obszaru zainteresowania, aby go wykryć. Następnie oblicz wielkość zawału jako stosunek powierzchni zawału do powierzchni LV.Następnie oblicz indeks ekspansji, korzystając z poniższego wzoru. Na koniec oblicz średnią dla każdego serca zgodnie z przedstawionym wzorem. Indeks ekspansji obliczony na podstawie barwienia metodą Goldnera jest dobrym wskaźnikiem do oceny rozwoju zawału.Jak pokazano na rysunku, koreluje on z wielkością zawału wyrażoną jako procent lewej komory oraz z frakcją wyrzutową mierzoną za pomocą echokardiografii. Na wykresach przedstawiono regresję liniową oraz 95% przedziały ufności. Wskaźnik rozszerzenia zawału obliczono zgodnie z opisem w poniższym wzorze.Całkowity obszar LV zmierzono jako sumę obszaru jamy LV oraz obszaru tkanki LV. Procent zawału obliczono zgodnie z przedstawionym wzorem. Funkcję oceniono w szóstym tygodniu po podwiązaniu LAD przy użyciu echokardiografii o wysokiej rozdzielczości.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić systematyczne pobieranie próbek z serca oraz jak ocenić wielkość zawału na podstawie analizy obrazowej barwionych przekrojów.

histological-quantification-of-chronic-myocardial-infarct-in-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Ten protokół opisuje model zawału mięśnia sercowego (MI) świni za pomocą 90-minutowej zamkniętej klatki piersiowej zamknięcia balonu wieńcowego lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD), po której następuje reperfuzja. Ponadto przedstawiono również protokół dla kilku parametrów końcowych, takich jak czynność serca, hemodynamika, opór mikronaczyniowy i wielkość zawału.

Zawał mięśnia sercowego i ocena wyników funkcjonalnych u świń

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Rzetelna i dokładna ocena wyników jest kluczem do przełożenia terapii przedklinicznych na leczenie kliniczne. W niniejszej pracy opisano, w jaki sposób można ocenić trzy klinicznie istotne pierwszorzędowe parametry końcowe dotyczące wydolności i uszkodzenia serca w modelu ostrego zawału mięśnia sercowego u świni.

Pierwszorzędowa ocena wyniku w świńskim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego

Tutaj demonstrujemy protokół standaryzacji procedur pobierania próbek z ustalonego modelu ostrego zawału mięśnia sercowego u świń, aby zwiększyć jego wartość translacyjną w zrozumieniu patofizjologii niedokrwienia mięśnia sercowego/uszkodzenia reperfuzyjnego i przetestować nowych kandydatów na leki.

Udoskonalenie modelu zawału mięśnia sercowego u świń w zamkniętej klatce piersiowej poprzez standaryzację procedur pobierania próbek tkanek i krwi

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Pod odpowiednim znieczuleniem, serce myszy zostało uzewnętrznione przez przestrzeń międzyżebrową, a zawał mięśnia sercowego został skutecznie wywołany przez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) przy użyciu materiałów łatwo dostępnych w większości laboratoriów.

Zmodyfikowana prosta metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Obecny test chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) wprowadza udoskonalony protokół barwienia TTC, który umożliwia analizę uszkodzeń mięśnia sercowego w mikroskopijnej rozdzielczości, tworząc wysokiej jakości obrazy pozwalające na dokładną i wiarygodną ocenę wielkości zawału oraz żywotności kardiomiocytów na poziomie komórkowym.

Mikroskopowy test chlorku 2,3,5-trifenyltetrazolu do dokładnej i wiarygodnej analizy uszkodzeń mięśnia sercowego

Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

Poznaj metodę histologiczną do ilościowej oceny zawału mięśnia sercowego u szczurów z wykorzystaniem systematycznego pobierania próbek i analizy obrazu. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie rozmiaru zawału oraz zmian w lewej komorze serca.

Histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów

Przeglądaj więcej filmów