Name: Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji naturalnych produktów o aktywności antybiotycznej i wyznaczania klastrów genów biosyntezy poprzez górnictwo genomowe u szczepów Streptomyces. Ta procedura przyspiesza odkrywanie nowych antybiotyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. Zhang jest finansowany przez Chińską Radę Stypendialną. Autorzy są bardzo wdzięczni byłym osobom pracującym nad projektem poliketomycyny w tym laboratorium oraz prof. dr Hans-Peter Fiedler z Uniwersytetu w Tybindze za dostarczenie producenta poliketomycyny. Badania były wspierane przez DFG (RTG 1976).

<ol><li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+antibacterial+action+of+cultures+of+a+penicillin%2C+with+special+reference+to+their+use+in+isolation+of+B.+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">On the antibacterial action of cultures of a penicillin, with special reference to their use in isolation of B. influenzae.</a> Br J Exp Pathol. 10 (3), 226-236 (1929).</li>
<li>Lemke, A., Kiderlen, A. F., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Amphotericin B.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2), 151-162 (2005).</li>
<li>Kirkpatrick, P., Raja, A., LaBonte, J., Lebbos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daptomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Daptomycin.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 2 (12), 943-944 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+of+tetracycline+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology of tetracycline antibiotics.</a> Biochem. cell Biol. 86 (2), 124-136 (2008).</li>
<li>Schatz, A., Bugle, E., Waksman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomycin%2C+a+Substance+Exhibiting+Antibiotic+Activity+Against+Gram-Positive+and+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.</a> Exp. Biol. Med. 55 (1), 66-69 (1944).</li>
<li>Burg, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avermectins%2C+new+family+of+potent+anthelmintic+agents%3A+producing+organism+and+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 361-367 (1979).</li>
<li>Egerton, J. R., Ostlind, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avermectins%2C+new+family+of+potent+anthelmintic+agents%3A+efficacy+of+the+B1a+component%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the B1a component.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 372-378 (1979).</li>
<li>Walsh, C. T., Fischbach, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+version+2.0%3A+connecting+genes+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Natural products version 2.0: connecting genes to molecules.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (8), 2469-2493 (2010).</li>
<li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketomycin%2C+a+new+antibiotic+from+Streptomyces+sp.+MK277-AF1.+II.+Structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1. II. Structure determination.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 26-32 (1998).</li>
<li>Paululat, T., Zeeck, A., Gutterer, J. M., Fiedler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+polyketomycin+produced+by+Streptomyces+diastatochromogenes.T%C3%BC6028%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes.Tü6028.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 52 (2), 96-101 (1999).</li>
<li>Momose, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketomycin%2C+a+new+antibiotic+from+Streptomyces.+sp.+MK277-AF1.+I.+Taxonomy%2C+production%2C+isolation%2C+physico-chemical+properties+and+biological+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces. sp. MK277-AF1. I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities.</a> J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 21-25 (1998).</li>
<li>Daum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+biosynthetic+gene+cluster+and+tailoring+enzymes+in+the+biosynthesis+of+the+tetracyclic+quinone+glycoside+antibiotic+polyketomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin.</a> Chembiochem. 10 (6), 1073-1083 (2009).</li>
<li>Bode, H. B., Bethe, B., Höfs, R., Zeeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+effects+from+small+changes%3A+possible+ways+to+explore+nature%27s+chemical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity.</a> Chembiochem. 3 (7), 619-627 (2002).</li>
<li>Wolfender, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+in+Natural+Product+Analysis%3A+The+Detection+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue.</a> Planta Med. 75 (07), 719-734 (2009).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStahl%2C+E+%22Thin-layer+chromatography.+A+laboratory+handbook%22">Thin-layer chromatography. A laboratory handbook</a>. , 2nd edition (1967).</li>
<li>Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+HPLC+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Pract.+HPLC+Method+Dev%22%5BJournal%5D)">Preparative HPLC Separation.</a> Pract. HPLC Method Dev. , 616-642 (2012).</li>
<li>Granath, K. A., Kvist, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+distribution+analysis+by+gel+chromatography+on+sephadex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular weight distribution analysis by gel chromatography on sephadex.</a> J. Chromatogr. A. 28, 69-81 (1967).</li>
<li>Jackman, L. M., Sternhell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+in+Organic+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Ser.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Organic Chemistry.</a> Int. Ser. Org. Chem. , (1969).</li>
<li>Xian, F., Hendrickson, C. L., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (2), 708-719 (2012).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+technologies+-+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing technologies - the next generation.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (1), 31-46 (2010).</li>
<li>Tatusova, T., et al. Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatusova%2C+T+%22NCBI+Handb.+2nd+Ed%22">NCBI Handb. 2nd Ed</a>. , (2013).</li>
<li>Angiuoli, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+online+repository+of+Standard+Operating+Procedures+%28SOPs%29+for+%28meta%29genomic+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation.</a> OMICS. 12 (2), 137-141 (2008).</li>
<li>Aziz, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAST+Server%3A+rapid+annotations+using+subsystems+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology.</a> BMC Genomics. 9, 75(2008).</li>
<li>Overbeek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SEED+and+the+Rapid+Annotation+of+microbial+genomes+using+Subsystems+Technology+%28RAST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST).</a> Nucleic Acids Res. 42, 206-214 (2014).</li>
<li>Brettin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RASTtk%3A+a+modular+and+extensible+implementation+of+the+RAST+algorithm+for+building+custom+annotation+pipelines+and+annotating+batches+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes.</a> Sci. Rep. 5, 8365(2015).</li>
<li>Seemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokka%3A+rapid+prokaryotic+genome+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prokka: rapid prokaryotic genome annotation.</a> Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenDB--an+open+source+genome+annotation+system+for+prokaryote+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GenDB--an open source genome annotation system for prokaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 31 (8), 2187-2195 (2003).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadden%2C+T+%22NCBI+Handb.+2nd+Ed%22">NCBI Handb. 2nd Ed</a>. , Chapter 16 (2003).</li>
<li>Marchler-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDD%3A+NCBI%27s+conserved+domain+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CDD: NCBI's conserved domain database.</a> Nucleic Acids Res. 43, (Database issue) 222-226 (2014).</li>
<li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH%3A+rapid+identification%2C+annotation+and+analysis+of+secondary+metabolite+biosynthesis+gene+clusters+in+bacterial+and+fungal+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences.</a> Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 339-346 (2011).</li>
<li>Blin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH+2.0--a+versatile+platform+for+genome+mining+of+secondary+metabolite+producers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH 2.0--a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers.</a> Nucleic Acids Res. 41, (Web Server issue) 204-212 (2013).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((antiSMASH+3.0+-+a+comprehensive+resource+for+the+genome+mining+of+biosynthetic+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">antiSMASH 3.0 - a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters.</a> Nucleic Acids Res. 43, (W1) 237-243 (2015).</li>
<li>Ziemert, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+product+domain+seeker+NaPDoS%3A+a+phylogeny+based+bioinformatic+tool+to+classify+secondary+metabolite+gene+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity.</a> PLoS One. 7 (3), 34064(2012).</li>
<li>Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W., Huson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+prediction+of+adenylation+domains+in+nonribosomal+peptide+synthetases+%28NRPS%29+using+transductive+support+vector+machines+%28TSVMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specificity prediction of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs).</a> Nucleic Acids Res. 33 (18), 5799-5808 (2005).</li>
<li>Röttig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRPSSpredictor2--a+web+server+for+predicting+NRPS+adenylation+domain+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NRPSSpredictor2--a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 362-367 (2011).</li>
<li>Medema, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+Information+about+a+Biosynthetic+Gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster.</a> Nat. Chem. Biol. 11 (9), 625-631 (2015).</li>
<li>Mullis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+enzymatic+amplification+of+DNA+in+vitro%3A+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51, Pt 1 263-273 (1986).</li>
<li>Bierman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+cloning+vectors+for+the+conjugal+transfer+of+DNA+from+Escherichia+coli+to+Streptomyces+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.</a> Gene. 116 (1), 43-49 (1992).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli.using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli.using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Bimboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>MacNeil, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Streptomyces+avermitilis.+genes+required+for+avermectin+biosynthesis+utilizing+a+novel+integration+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of Streptomyces avermitilis. genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.</a> Gene. 111 (1), 61-68 (1992).</li>
<li>Pospiech, A., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+quick-prep+of+genomic+DNA+from+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria.</a> Trends Genet. 11 (6), 217-218 (1995).</li>
<li>Makitrynskyy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+regulatory+genes+bldA%2C+adpA+and+absB+are+implicated+in+production+of+phosphoglycolipid+antibiotic+moenomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic regulatory genes bldA, adpA and absB are implicated in production of phosphoglycolipid antibiotic moenomycin.</a> Open Biol. 3 (10), 130121(2013).</li>
<li>Kalan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryptic+polyene+biosynthetic+gene+cluster+in+Streptomyces+calvus+is+expressed+upon+complementation+with+a+functional+bldA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene.</a> Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).</li>
<li>Gessner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+Biosynthetic+Profiles+by+Expressing+bldA+in+Streptomyces+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains.</a> ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym laboratorium wiele lat temu stworzono i przebadano genomową bibliotekę kosmidową Streptomyces diastatochromogenes , co zaowocowało identyfikacją klastra genów poliketomycyny w niezwykle czasochłonnym procesie. Charakterystyka pojedynczych genów była możliwa przy użyciu celowanych delecji genów i analizy powstałych mutantów12. Niedawno uzyskano wstępną sekwencję genomu S. diastatochromogenes , która pozwoliła na szybką identyfikację klastra genów biosyntezy poliketomycyny. Mogliśmy łatwo wykryć geny biosyntezy, chociaż szkic sekwencji genomu zawiera nadal wiele kontigów. Opisany proces można osiągnąć w ciągu kilku miesięcy. Procedura składa się jednak z wielu etapów. Pojedyncze kroki mogą zakończyć się niepowodzeniem kilka razy, uniemożliwiając przejście do kolejnych kroków:
Rodzaj Streptomyces znany jest ze swojej zdolności do wytwarzania związków bioaktywnych. Chociaż często zawierają więcej niż 20 klastrów genów biosyntetycznych, zwykle tylko jeden lub dwa związki są wytwarzane w warunkach laboratoryjnych. Zastosowanie podejścia OSMAC (hodowla jednego szczepu w różnych warunkach) w celu wybudzenia cichych klastrów genów może czasami nie wystarczyć. Genetyczna manipulacja genami regulatorowymi, takimi jak plejotropowe geny regulatorowe adpA44 i bldA45,46, jest również skuteczną metodą aktywacji produkcji innych metabolitów wtórnych.
Do wyjaśnienia struktury związku, np. za pomocą analizy NMR, zwykle konieczne jest więcej niż 2 mg oczyszczonego związku. Dlatego często wymagana jest fermentacja więcej niż 10 litrów kultury. Bez fermentora, który jest w stanie utrzymać tlen, pH i temperaturę, w małym laboratorium może być trudno poradzić sobie z taką ilością kultury i późniejszą ekstrakcją. Podczas oczyszczania związek może ulec zmianie pod wpływem utleniania, promieniowania lub temperatury. Ponadto, im więcej etapów oczyszczania zostanie zastosowanych, tym większa szansa na degradację.
Analizując strukturę produktu naturalnego i klastry w genomie, czasami nie jest tak łatwo zidentyfikować odpowiedni klaster. Po pierwsze, jeśli istnieje tylko szkic sekwencji genomu, może brakować jakiejś części klastra. Po drugie, nie wszystkie geny, które są niezbędne do biosyntezy, znajdują się w klastrze. Po trzecie, czasami klaster jest podzielony na dwie części oddzielone od siebie wieloma kilozasadami. Po czwarte, może być trudno zdecydować, który z nich jest odpowiednim klastrem genów. W przypadku dużych systemów PKS typu I lub NRPS, gdzie możliwe jest obliczenie liczby jednostek przedłużacza na podstawie liczby modułów, a nawet identyfikacja pojedynczych jednostek przedłużacza na podstawie analizy wybranych domen, łatwo się to sprawdza. Jednak w przypadku iteracyjnie działających enzymów przewidywanie zsyntetyzowanych związków często nie jest możliwe, zwłaszcza jeśli szczep ma więcej niż 40 klastrów genów. Po piąte, natura jest bardzo złożona i pełna nieznanych jeszcze związków. Często biosynteza jest mieszaniną różnych szlaków. Jeśli nowy związek nie został jeszcze zidentyfikowany lub nie jest spokrewniony z innym związkiem, może być trudno zidentyfikować klaster, zaproponować model biosyntezy i go udowodnić.
Po zidentyfikowaniu klastra technika pojedynczego skrzyżowania jest dobrą i szybką metodą weryfikacji hipotezy. PCR, klonowanie do wektora samobójczego, koniugacja, selekcja pozytywnych klonów i test produkcyjny to jedyne wymagane kroki. Jedną z wad tej techniki jest to, że integracja wektora z chromosomem nie jest stabilna z powodu dalszych zdarzeń rekombinacji. Dlatego, aby dalej analizować pojedyncze geny, wymagane są precyzyjne delecje genów. Również manipulowanie szczepami Streptomyces na poziomie genetycznym może być trudne.
Opisaną procedurę można przypisać do dowolnego innego związku wytwarzanego przez szczep Streptomyces lub inny mikroorganizm. Wiedza na temat biosyntetycznego klastra genów i jego syntetyzowanego związku daje nam kolejne możliwości modyfikacji już istniejących cząsteczek w celu ich udoskonalenia do walki z patogenami wielolekoopornymi.

Naturalne produkty z roślin i mikroorganizmów zawsze były ważnym źródłem dla rozwoju klinicznego leków i badań. Pierwszy antybiotyk penicylina został odkryty w 1928 roku z grzyba przez Alexandra Fleminga1. Obecnie w leczeniu klinicznym stosuje się o wiele więcej naturalnych produktów.
Jednym z rodzajów znanych ze swojej zdolności do wytwarzania różnego rodzaju metabolitów wtórnych o różnej bioaktywności jest Streptomyces. Streptomyces są bakteriami Gram-dodatnimi i należą do klasy Actinobacteria i rzędu Actinomycetales. Prawie dwie trzecie klinicznie stosowanych antybiotyków pochodzi z promieniowców, głównie ze Streptomyces, takich jak amfoterycyna2, daptomycyna3 lub tetracyklina4. Przyznano dwie Nagrody Nobla w dziedzinie badań nad antybiotykami Streptomyces. Pierwsza z nich trafiła do Selmana Waksmana za odkrycie Streptomycyny, pierwszego antybiotyku skutecznego przeciwko gruźlicy. 5 W 2015 r., w ramach Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny, nagrodzono również odkrycie awermektyny z S. avermittilis. Awermektyna jest stosowana w leczeniu chorób pasożytniczych6,7.
Tradycyjne podejście do odkrywania naturalnych produktów w mikroorganizmach, takich jak Streptomyces, zazwyczaj obejmuje hodowlę szczepu w różnych warunkach wzrostu, a także ekstrakcję i analizę metabolitów wtórnych. Testy bioaktywności (np. testy aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwnowotworowej) wykonuje się w celu wykrycia aktywności związku. Na koniec izoluje się interesujący związek i wyjaśnia strukturę chemiczną.
Struktury produktów naturalnych często składają się z pojedynczych ugrupowań, które tworzą złożone cząsteczki. Istnieje kilka, ale ograniczonych, głównych szlaków biosyntezy prowadzących do powstawania bloków budulcowych, które są wykorzystywane do biosyntezy produktów naturalnych. Głównymi szlakami biosyntezy są szlaki poliketydowe, szlaki prowadzące do terpenoidów i alkaloidów, szlaki wykorzystujące aminokwasy oraz szlaki prowadzące do ugrupowań cukrowych. Każdy szlak charakteryzuje się zestawem określonych enzymów8. Na podstawie struktury związku można przewidzieć te enzymy biosyntetyczne.
W dzisiejszych czasach szczegółowa analiza strukturalna związku w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji i analizą bioinformatyczną może pomóc w zidentyfikowaniu odpowiedzialnego klastra genów biosyntetycznych. Informacje uzyskane w klastrze otwierają nowe możliwości dalszych badań nad produktami naturalnymi. Obejmuje to ekspresję heterologiczną w celu zwiększenia wydajności produktu naturalnego, ukierunkowaną modyfikację związku poprzez delecję lub zmianę genów oraz biosyntezę kombinatoryczną z genami z innych szlaków.
Poliketomycyna została wyizolowana niezależnie od bulionu hodowlanego dwóch szczepów, Streptomyces sp. MK277-AF19 i Streptomyces diastatochromogenes Tü602810. Struktura została wyjaśniona za pomocą NMR i analizy rentgenowskiej. Poliketomycyna składa się z tetracyklicznego decaketidu i kwasu dimetylosalicylowego, połączonych dwoma ugrupowaniami deoksycukru β-D-amicetozą i α-L-aksenozą. Wykazuje aktywność cytotoksyczną i antybiotyczną, nawet wobec wielolekoopornych szczepów Gram-dodatnich, takich jak MRSA11.
Biblioteka genomiczna kosmidu S. diastatochromogenes Tü6028 została wygenerowana i przebadana wiele lat temu. Za pomocą specyficznych sond genowych po kilku miesiącach intensywnych prac zidentyfikowano klaster genów poliketomycyny o wielkości 52,2 kb, zawierający 41 genów12. Niedawno uzyskano wstępną sekwencję genomu S. diastatochromogenes, co doprowadziło do szybkiej identyfikacji klastra genów biosyntezy poliketomycyny. W tym przeglądzie zostanie opisana metoda pomagająca zidentyfikować produkt naturalny i wyjaśnić jego biosyntetyczny klaster genów na przykładzie poliketomycyny.
Tutaj wyjaśniamy pojedyncze etapy, które prowadzą od produktu naturalnego do jego biosyntetycznego klastra genów, pokazanego dla poliketomycyny produkowanej przez Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Protokół obejmuje identyfikację i oczyszczenie naturalnego produktu o właściwościach antybiotycznych. Dalsza analiza strukturalna i porównanie z wynikami eksploracji genomu prowadzi do identyfikacji klastra genów biosyntetycznych. Procedurę tę można zastosować do każdego innego związku pochodzącego ze szczepu Streptomyces lub dowolnego innego mikroorganizmu.

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>glukoza&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt słodowy&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepton&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mąka sojowa&nbsp;</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Niemcy</td><td></td><td>Hensec-Vollsoja</td></tr><tr><td>tryptyczny bulion sojowy</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>X938.3</td> Ekstrakt drożdżowy <td>Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, Holandia</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorofrom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Niemcy</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (sulcotlenek dimetylu)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (dimetylosulfotlenek-d6) 99,9 atom% D</td><td>ARMAR Chemicals, D&ouml; ttingen, Szwajcaria</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt nad Menem, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polimeraza&nbsp;</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt nad Menem, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I Duży (Klenow) Fragment</td><td>Promega GmbH, Mannheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramycyna</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Niemcy&nbsp;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomycyna</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Niemcy</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer& nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td><td>Podkład do amplifikacji fragmentu zawierającego gen</td><td></td>pokPI</tr><tr><td>pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>Szczep testowy Gram-dodatni&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>szczep do koniugacji</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 Blue</td><td>Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td><td>Szczep testowy Gram-ujemny + gospodarz klonujący&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml; 6028</td><td>Paululat et al., 1999</td> Producent <td></td><td>poliketomycyny</td></tr><tr><td>Usługi online</td>antismash (Antybiotyki i Analiza Metabolitów Wtórnych)http://antismash.secondarymetabolites.org/ <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Wykrywanie klastra <td></td><td>genów metabolitów wtórnych</td></tr><tr><td>BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td><td>znajduje obszary podobieństwa między sekwencjami biologicznymi</td><td></td></tr><tr><td>GenDB</td><td>https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td><td>Adnotacja ORFów&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Baza danych biosyntetycznych klastrów genów</td><td></td></tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>Wykrywanie sekonarycznego klastra</td><td></td>genów metabolitów</tr><tr><td>NCBI Prokariotyczne Genom Annotation Pipeline</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td> <td>Adnotacja ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>Wykrywanie domen</td><td></td>NRPS</tr><tr><td>Prokka (szybka adnotacja genomu prokariotycznego)</td><td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>Adnotacja ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RAST (szybka adnotacja przy użyciu technologii podsystemów)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>Adnotacja ORFów&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inne programy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td>Program obsługi dla HPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>Oprogramowanie naukowe i edukacyjne, Cary, USA</td><td>Projektowanie eksperymentu klonowania&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Wyrównanie odczytów</td><td></td> sekwencjonowania</tr><tr><td>Machines&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-6000, Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler: G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre-kolumnowy: XBridge C18 (20 mm x 4,6 mm; Wielkość cząstek: 3,5 i mikro; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column:Xbridge C18 (100 mm i czas; 4,6 mm; Wielkość cząstek: 3,5 i mu; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi Kolumna wstępna: Zorbax B-C18 (9,4 x 150 mm; Wielkość cząstek: 5 i mikro; m)</td> <td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Kolumna: Zorbax B-C18 (9,4 x 20 mm; Wielkość cząstek: 5 i mikro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser: G1322A&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternary pompa: G1311A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diode detektor matrycowy (DAD )G1315B (&lambda; = 254 nm i 400 nm)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quadrupole detektor masowy (MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyparka obrotowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>_heating wannowa Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum system pompowy SC 920 G</td><td>KNF&nbsp; Strategie globalne&nbsp; AG, Sursee, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inne materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromafil PVDF-45/15MS (wielkość porów 0,45 &mikro; m; filtr & Oslash; 15 mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml; ren, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna SPE Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Medium: LB, Skład: LB, Ilość 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Podłoże: LB, Skład: LB, Ilość 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Podłoże: TSB, Skład: CASO Boullion, Ilość 1 L H2O: 30 g</td></tr><tr><td>grzyba&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Podłoże: YPD, Skład: Ekstrakt drożdżowy, Ilość 1 L H2O: 10 g</td></tr><tr><td>grzyba&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Podłoże: YPD, Skład: Pepton, Ilość 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>grzyba&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td>Podłoże: YPD, Skład: Glukoza, Ilość 1 l H2O: 20 g</td></tr><tr><td colspan="4">na płytki agarowe dodaj 2% agaru</td></tr></tbody></table>

od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze streptomyces diastatochromogenes tü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Szczepy Streptomyces są znane ze swojej zdolności do wytwarzania wielu różnych związków o różnej bioaktywności. Uprawa w różnych warunkach często prowadzi do produkcji nowych związków. W związku z tym kultury produkcyjne szczepów są ekstrahowane octanem etylu, a surowe ekstrakty są analizowane za pomocą HPLC. Ponadto ekstrakty są testowane pod kątem bioaktywności za pomocą różnych testów. W celu wyjaśnienia struktury interesujący nas związek jest oczyszczany przez kombinację różnych metod chromatograficznych.
Sekwencjonowanie genomu w połączeniu z eksploracją genomu pozwala na identyfikację klastra genów biosyntezy produktu naturalnego za pomocą różnych programów komputerowych. Aby potwierdzić, że zidentyfikowano właściwy klaster genów, należy przeprowadzić eksperymenty z inaktywacją genów. Powstałe mutanty są analizowane pod kątem produkcji konkretnego produktu naturalnego. Po inaktywacji prawidłowego klastra genów szczep powinien nie wytwarzać związku.
Przebieg pracy jest pokazany dla przeciwbakteryjnego związku poliketomycyny produkowanego przez Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Około dziesięć lat temu, kiedy sekwencjonowanie genomu było jeszcze bardzo drogie, klonowanie i identyfikacja klastra genów była bardzo czasochłonnym procesem. Szybkie sekwencjonowanie genomu w połączeniu z eksploracją genomu przyspiesza próby identyfikacji klastrów i otwiera nowe możliwości badania biosyntezy i generowania nowych produktów naturalnych metodami genetycznymi. Protokół opisany w tej pracy można przypisać do dowolnego innego związku pochodzącego ze szczepu Streptomyces lub innego mikroorganizmu.

W niniejszym przeglądzie opisujemy poszczególne etapy procesu prowadzącego od identyfikacji antybiotyku do jego biosyntetycznego klastra genów. Wiele lat temu klonowaliśmy bibliotekę kosmidów, pakowaliśmy je do fagów, transdukowaliśmy komórki gospodarza E. coli i musieliśmy przesiewać tysiące kolonii, aby zidentyfikować klony posiadające nakładające się regiony klastra poliketydowej syntezy. Sekwencjonowanie kosmidów było również procesem trudnym i kosztownym12.
W celu przeprowadzenia dalszych badań nad szczepem zsekwencjonowano cały genom Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Dzięki wstępnej sekwencji genomu łatwo zidentyfikowano biosyntetyczny klaster genów poliketomycyny oraz inne klastry kodujące obiecujące związki. Rysunek 7 porównuje „starą” metodę identyfikacji klastra biosyntetycznego poprzez klonowanie biblioteki kosmidów i szczegółowe przesiewanie z „nową” metodą polegającą na sekwencjonowaniu całego genomu i następnym przeszukiwaniu genomu (genome mining) w ujęciu czasowym. Nowe technologie sekwencjonowania oraz nowe programy do przeszukiwania genomu przyspieszają cały ten proces.
<img alt="Schemat metod sekwencjonowania genomicznego; porównanie starych i nowych technik oraz schematów pracy sekwencjonowania DNA." src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Porównanie „starej” i „nowej” metody przypisywania biosyntetycznego klastra genów. Metoda „stara” obejmuje klonowanie biblioteki kosmidów z selekcją klonów pozytywnych i sekwencjonowaniem odpowiedniego kosmidu lub kosmidów (powyżej); metoda „nowa” obejmuje sekwencjonowanie i analizę całego genomu (genome mining) w celu zidentyfikowania wszystkich klastrów genów metabolitów wtórnych zlokalizowanych w genomie szczepu (poniżej). Czas trwania poszczególnych etapów przedstawiono na przybliżonej skali czasowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół (A) identyfikacji naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, (B) oczyszczania związku, (C) pierwszego modelu jego biosyntezy, (D) sekwencjonowania/-eksploracji genomu oraz (E) weryfikacji klastra genów biosyntetycznych.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Ogólnym celem tego przepływu pracy jest zidentyfikowanie naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, oczyszczenie związku i określenie jego biosyntetycznego klastra genów poprzez eksplorację genomu. Nowe antybiotyki są pilnie potrzebne ze względu na rosnącą liczbę patogenów opornych na myto. Szczepy streptomycyny są znanymi producentami antybiotyków i powinniśmy wykorzystać ten potencjał.Dysponując wiedzą na temat klastra heterogenów biobiotycznych biobiogenów, możemy zaproponować szlak biosyntezy i dalej modyfikować związek. Procedury te pomagają zidentyfikować odpowiedni klaster genów. Radio jest demonstrowane ze szczepem streptomycyny.Ale można go zastosować do innych mikroorganizmów. Na początek wrzuć szczep streptomycyny w różnych warunkach, takich jak różne podłoża lub czas inkubacji. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 3 000 razy G. I przenieść supernatanty do nowej kolby.W celu ekstrakcji związków z bulionu hodowlanego, należy dostosować supernatant do PH4 przez dodanie jednego molowego kwasu solnego. I przenieś go do rozdzielacza. Następnie dodaj taką samą objętość octanu etalu i potrząsaj mieszaniną przez 30 minut z prędkością 180 obr./min.Następnie zebrać fazę octanu etalu i przenieść ją do kolby okrągłodennej przez bibułę filtracyjną. Odparować octan etalu przez odparowanie obrotowe w temperaturze 40 stopni Celsjusza i ciśnieniu 240 barów. W celu ekstrakcji związków z grzybni ponownie zawiesić komórki w podwójnej objętości acetonu.Potrząsaj komórkami w probówce z prędkością 180 obr./min przez 30 minut. Przefiltruj ciecz przez bibułę filtracyjną. Następnie odparuj aceton za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze 40 stopni Celsjusza i ciśnieniu 550 barów.Wysuszony ekstrakt rozpuścić w 20 mililitrach octanu etalu wody i kontynuować ekstrakcję związków jak poprzednio. Następnie wysuszone ekstrakty rozpuść w metanolu. Przefiltruj je przez filtr o wielkości porów 0,45 mikrometra.I przenieś ekstrakty do fiolek HPLC. Wstrzyknąć próbki do maszyny HPLC i przeanalizować surowy ekstrakt zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zidentyfikować aktywność antybiotykową za pomocą testu dyfuzji krążkowej, należy rozprowadzić różne prekultury szczepów testowych na odpowiednich płytkach agarowych.Następnie odpipetować od 20 do 50 mikrolitrów rozpuszczonego ekstraktu na sterylne krążki papierowe. Przygotuj również kontrolę ujemną z rozpuszczalnikiem i kontrolę pozytywną z odpowiednim antybiotykiem. Po wysuszeniu krążków papierowych przez 30 minut, przenieś je na płytki z kulturami testowymi.Inkubować płytki naprężeniowe w odpowiednich warunkach. Następnie należy określić pozorne strefy inhibicji dla każdego badanego szczepu. Jeśli istnieje strefa inhibicji, należy oczyścić odpowiedzialny związek z uprawy na dużą skalę i wyjaśnić strukturę zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Podczas oczyszczania związek może ulec zmianie pod wpływem utleniania, promieniowania lub temperatury. Im więcej użytych tabletek oczyszczających, tym większa szansa na degradację. Do pięciu miligramów związku, co jest minimum potrzebne do analizy powszechnego genogenu.Przeanalizuj strukturę chemiczną wyizolowanego związku i przewiduj enzymy, które mogą być zaangażowane w jego biosyntezę. Tutaj policydomycyna jest używana jako przykład w celu zademonstrowania procedury. Najpierw podziel strukturę na oczywiste pojedyncze ugrupowania.Policydomycyna składa się z ugrupowania tetracyklicznego, dwóch cukrów prostych i kwasu dimetylosalicylowego. Następnie należy przewidzieć przypuszczalne geny w klastrze, z którego mogą pochodzić cząstki. W tym przypadku ugrupowanie tetracykliczne może pochodzić z synfazy typu poli klucza typu II, podczas gdy ugrupowanie dimetylosalicylowe może pochodzić z iteracyjnego typu synfazy poli klucza typu I. Podobnie dwie grupy cukrowe, które są 6 deoksycukrami, mogą być syntetyzowane z glukozy z udziałem dNDP-glukozy-4, 6-dehydratazy podczas biosyntezy i przyłączane przez dwie glikozylotransferazy.Sekwencjonowanie genomowego DNA za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji. W celu identyfikacji klastra genów metabolitów wtórnych uruchom programy, takie jak antiSMASH, Natural Product Domain seeker lub NRPS predicter. Prześlij sekwencję genomu w formacie fasta.Po kilku godzinach wyniki są wysyłane za pośrednictwem linku e-mail. W projekcie genomu streptimyoces diastatochromogenes antiSMASH zidentyfikował 22 domniemane klastry genów. Przeanalizuj przypuszczalne klastry genów pod kątem ich szlaków enzymatycznych.Szukaj klastrów zawierających geny, które mogą być zaangażowane w syntezę twojego związku. W astatochromogenach klaster II zawiera geny synfazy poli keytype typu II, trzy geny dla iteracyjnego PKS typu I oraz gen dTDP-glukozy-4, 6-dehydratazy i dwie glikozylotransferazy kodujące geny. Aby porównać klaster z innymi klastrami, antiSMASH udostępnia link do bazy danych MIBiG, która zawiera adnotacje i dalsze informacje o podobnych klastrach genów biosyntetycznych i ich produktach.Porównaj strukturę związku z innymi znanymi związkami, aby sprawdzić podobieństwa. Identyfikacja odpowiedzialnego klastra genów biosyntetycznych może być prosta. Ale w niektórych przypadkach może to być również bardzo trudne.W celu sprawdzenia, czy proponowany klaster genów jest odpowiedzialny za biosyntezę związku, należy poszukać genu w klastrze i kodować enzym o centralnej funkcji biosyntezy. Aby potwierdzić klaster genów policydomycyny, wybrano gen pokPI one kodujący ketosyntazę alfa z PKS typu II i inaktywowano go przez delecję poza ramką. Po sklonowaniu i koniugacji pojedynczego konstruktu zwrotnicy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Sprawdź pojedyncze mutanty crossover. Aby to zrobić, zaszczepij 100 mililitrów pożywki produkcyjnej pojedynczymi klonami zawierającymi zweryfikowane przerwanie genu. Inkubować komórki w tych samych warunkach, jakie stosowano poprzednio.Kontynuuj ekstrakcję surowego ekstraktu, jak pokazano wcześniej. Na koniec sprawdź produkcję za pomocą analizy HPLC MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odpowiadający im pik na chromatogramie HPLC i masa związku nie powinny być wykrywalne.Klaster genów biosyntezy policydomycyny zweryfikowano za pomocą eksperymentu delecji genu. Pokazano tutaj chromatogram HPLC surowego ekstraktu z dzikiego typu S.Diastatochromogenes i zmutowanego szczepu z przerywanym genem pokPI one. Zmutowany szczep nie wytwarza już policydomycyny.Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu kilku miesięcy. Wiele lat temu identyfikacja biosyntetycznego klastra genów zajęła dużo czasu. Obecnie sekwencjonowanie genomu i eksploracja genomu znacznie przyspieszają ten proces.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przejść od nowego związku do jego biosyntetycznego klastra genów. Pokazaliśmy całą procedurę w pojedynczych krokach, dzięki czemu możesz teraz przypisać je do dowolnego innego producenta produktów naturalnych. Wiedza o klastrze genów i jego syntetyzowanych związkach daje nam wgląd w szlaki biosyntezy.Daje nam to kolejne możliwości modyfikowania już istniejących cząsteczek w celu ich ulepszenia.

from-natural-product-to-its-biosynthetic-gene-cluster-demonstration

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Poznaj metodę identyfikacji naturalnych produktów o aktywności antybiotycznej i wyznaczania klastrów genów biosyntezy poprzez górnictwo genomowe u szczepów Streptomyces. Ta procedura przyspiesza odkrywanie nowych antybiotyków.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Wideo) | JoVE Journal

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Przeglądaj więcej filmów