Name: Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę hodowli mysich embrionalnych kości śródstopia jako fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego. Technika umożliwia badanie mechanizmów mineralizacji szkieletowej w warunkach zbliżonych do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Radzie ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC) za finansowanie DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). Dziękujemy również Arthritis Research UK za finansowanie dla KAS (20413). Dziękujemy Pani Elaine Seawright za jej pomoc w szczegółowo opisanych eksperymentach, dr Neilowi Mackenzie za pomoc w technikach lentiwirusowych oraz Panu Darrenowi Smithowi i Panu Alexowi Robertsonowi (Roslin Institute BRF) za ich pomoc w badaniach na zwierzętach.

Procedury z udziałem zwierząt były przeprowadzane zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r., a zwierzęta były utrzymywane zgodnie z opublikowanym przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych Kodeksem postępowania w zakresie trzymania i opieki nad zwierzętami hodowanymi, dostarczanymi lub wykorzystywanymi do celów naukowych.
UWAGA: Eksperymenty przeprowadzone na myszach C57Bl/6J typu dzikiego są dobrze znane i opisane poniżej. Embrionalne kości śródstopia z różnych szczepów myszy mogą być podobnie hodowane in vitro, chociaż ich tempo wzrostu i mineralizacji może różnić się od opisanych w niniejszym dokumencie.
1. Warunki sekcji i przygotowanie narzędzi
<ol>
	<li>Wszystkie prace związane z przygotowaniem pożywki, sekcjami tkanek i hodowlą należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylność pożywki i zaczątków zarodka.</li>
	<li>Przed użyciem pozostawić pożywkę do zrównoważenia pożywek i pożywek preparacyjnych przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Wysterylizuj nożyczki do rozwarstwiania, pęsety Dumont #5 i Dumont #4 wraz z parą mikronożyczek superFine Vannas (8 cm proste, ostrza 3 mm) przez autoklawowanie. Po autoklawowaniu przed użyciem zanurz sprzęt do preparacji w 70% etanolu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywek preparacyjnych i hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować podłoże preparacyjne
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć α-Minimum Essential (bez nukleozydów, αMEM) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1:13) i ponownie zawiesić albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml przed sterylizacją filtracyjną przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm i średnicy 33 mm. 
		UWAGA: Pożywkę preparacyjną można przygotować, wysterylizować filtrem i przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną
	<ol>
		<li>Wyhodować zarodkowe kości śródstopia w 300 μl pożywki hodowlanej (w każdym dołku na 24-dołkowej płytce hodowlanej). Przygotować pożywkę, dodając 0,2% w/v BSA; 5 μg/ml fosforanu kwasu L-askorbinowego; 1 mM β-glicerofosforan (βGP; opcjonalnie – patrz sekcja wyników); 0,05 mg/ml gentamycyny i 1,25 μg amfoterycyny B do αMEM i filtra sterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm o średnicy 33 mm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mysia embrionalna sekcja śródstopia i hodowla
<ol>
	<li>Ubój ciężarnej myszy, w której znajdują się 15-dniowe zarodki, poprzez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w Wielkiej Brytanii.</li>
	<li>Ułóż zwierzę na wznak i zdezynfekuj skórę, spryskując ją 70% etanolem. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj duże nacięcie w linii środkowej, penetrując zarówno skórę, jak i otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Zlokalizuj dwa rogi macicy zwierzęcia w grzbietowej części jamy ciała. Usuń rogi macicy, najpierw uwalniając każdą macicę z mezometrium poprzez ostrożne nacięcia nożyczkami preparacyjnymi, a następnie na koniec odcinając rogi macicy u ich podstawy. Umieść rogi macicy w podłożu preparacyjnym.</li>
	<li>Oddziel każdy zarodek, przecinając miejsca zagnieżdżenia się wzdłuż rogu macicy i usuń zarodki z ich indywidualnych woreczków za pomocą kleszczy. Usuwanie zarodków przez dekapitację zgodnie z wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w Wielkiej Brytanii.</li>
	<li>Po zdezynfekowaniu skóry poprzez spryskanie 70% etanolem, za pomocą mikronożyczek Vannas usuń tylne kończyny z zarodków poprzez nacięcie wokół bliższej części kości udowej. Zapewnia to usunięcie jak największej części tylnej kończyny. Umieść tylne kończyny na szalce Petriego zanurzonej w pożywce preparacyjnej przed wycięciem śródstopia.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym zacznij usuwać skórę otaczającą stopę zarodkową, ściskając ją i ściągając za pomocą pęsety #5, jednocześnie przytrzymując tylną kończynę stabilnie za pomocą pęsety #4. Najskuteczniej wykonuje się to poprzez chwycenie skóry mniej więcej na poziomie kości piszczelowej i pociągnięcie w kierunku paliczków. Użycie nożyczek na tym etapie do cięcia bardzo cienkiej skóry nie jest wymagane.</li>
	<li>Ostrożnie przytrzymaj stęp stopy embrionalnej pęsetą #4 i usuń pierwszą i piątą kość śródstopia, ściskając w pobliżu stępu za pomocą pęsety #5 i wyrzuć.</li>
	<li>Trzymając stopę w tej samej pozycji, użyj pęsety #5, aby rozbić tkanki łączne między trzema pozostałymi paliczkami i śródstopiem. Włóż końcówkę pęsety #5 do stawu między paliczkami a śródstopiem, aby usunąć paliczki z kości śródstopia.</li>
	<li>Na koniec użyj pęsety #5, aby przerwać tkanki łączne między stępem a śródstopiem. Ponownie umieść końcówkę pęsety #5 w przestrzeni stawowej między stępem a śródstopiem i delikatnie uwolnij kości śródstopia od stępu.</li>
	<li>Delikatnie podnieś wolne kości śródstopia pęsetą #4 i umieść w świeżym podłożu preparacyjnym. 
	UWAGA: Staranna sekcja powinna dostarczyć 6 kości śródstopia z każdego zarodka.</li>
	<li>Po wypreparowaniu wszystkich wymaganych kości śródstopia ostrożnie umieścić kości śródstopia pojedynczo w wstępnie podgrzanych 24-dołkowych płytkach zawierających 300 μl pożywki hodowlanej. Hodowla kości śródstopia w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO2 przez okres do 14 dni. 
	UWAGA: Nie zmieniaj pożywki kultur E15 do co najmniej 5 dnia hodowli, ponieważ wpływa to na ich zdolność mineralizacji 26. Przyczyny tego są niejasne, ale liniowy wzrost i mineralizacja macierzy mogą być zależne od stymulacji przez czynniki wzrostu uwalniane z kości śródstopia.</li>
</ol>
4. Analiza i manipulacja posiewami śródstopia
<ol>
	<li>W dniu sekcji (dzień 0) należy wykonać wstępne pomiary podłużne za pomocą mikroskopu z dołączoną kamerą cyfrową i oprogramowaniem do analizy obrazu. Zmierz długość centralnej strefy mineralizacji, gdy pojawi się ona po kilku dniach hodowli.</li>
	<li>Okresowo, w razie potrzeby, wykonuj dalsze pomiary (zwykle co 2dni) aż do ostatniego dnia posiewu, w którym to momencie kości śródstopia są przetwarzane w zależności od wymaganych wyników (omówionych we wprowadzeniu).</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę hodowli narządów śródstopia różnymi czynnikami egzogennymi, np. czynnikami wzrostu, hormonami i środkami farmakologicznymi od 0 dnia hodowli 22,24. We wszystkich badaniach tego rodzaju wymagane jest kontrolowanie nieleczonych kości śródstopia. 
	UWAGA: Chociaż zaleca się, aby kości kontrolne były równoważne z odnogą przeciwległą, nie stwierdzono żadnych różnic w liniowym wzroście lub potencjale mineralizacji hodowanych E15 2, 3 i 4 kości śródstopia (patrz poniżej, ryc. 2).</li>
</ol>

<ol><li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeleton%3A+no+bones+about+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li>
<li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li>
<li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li>
<li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li>
<li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+BK+%22Bones+and+Cartilage%3A+Developmental+and+Evolutionary+Skeletal+Biology%22">Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology</a>. , Elsevier Academic Press. (2005).</li>
<li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth%3A+The+development+of+tibial+dyschondroplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Poult.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li>
<li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li>
<li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles%3A+structure%2C+composition%2C+formation+and+function+in+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812(2011).</li>
<li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li>
<li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li>
<li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Growth+Plate%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li>
<li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+pediatric+endocrinology+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).</li>
<li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li>
<li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery-American%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li>
<li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li>
<li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li>
<li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+bone+growth+in+vitro%3A+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+endocrinologica%22%5BJournal%5D)">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li>
<li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+physiology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li>
<li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+cartilage+and+bone+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li>
<li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li>
<li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator%2C+AL-438%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li>
<li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li>
<li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li>
<li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+%28OP-1%29+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li>
<li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OP-1+%28BMP-7%29+affects+mRNA+expression+of+type+1%2C+II%2C+X+collagen%2C+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li>
<li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+M+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 3, Academic Press. (1992).</li>
<li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li>
<li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Miner%22%5BJournal%5D)">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li>
<li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li>
<li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li>
<li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li>
<li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+receptor+%28IGF1R%29+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li>
<li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+%28TNAP%29+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li>
<li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C%2C+collagen%2C+and+cracks+in+the+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li>
<li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li>
<li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia zapewnia wysoce fizjologiczny model wzrostu i mineralizacji endochrzęstnej. Wczesne badania potwierdziły, że śródstopie myszy E15 podlega normalnemu wzorcowi wzrostu i różnicowania szkieletu. Komórki chrząstki (chondrocyty) i kości (osteoblasty i osteoklasty) oraz ich odpowiednie matryce kolagenowe są nie do odróżnienia od tych obserwowanych in vivo. Istnieją jednak pewne uznane ograniczenia tego modelu. Szybkość różnicowania osteoklastów jest upośledzona, podobnie jak wzrost kości (ale nie różnicowanie chrząstki). Wzrost kości jest o około 50% wolniejszy niż obserwowany in vivo i może być spowodowany niedoborem czynników ogólnoustrojowych, które wpływają na wytwarzanie czynników miejscowych (np. IGF-1, BMP itp.) 31. Wiadomo również, że kość jest wrażliwa na środowisko mechaniczne i dotyczy to również hodowanych kości śródstopia, które reagują na zmiany obciążenia mechanicznego 32,33. Dlatego w sytuacjach bez obciążenia, jak opisano w niniejszym protokole, mineralizacja i resorpcja minerałów mogą być zagrożone. Niemniej jednak model śródstopia oferuje możliwość bezpośredniego pomiaru liniowego wzrostu kości, co nie jest możliwe za pomocą systemów hodowli in vitro 2D i 3D.
Przedstawiliśmy wyczerpujący opis protokołu zaangażowanego w sekcję i hodowlę mysich kości śródstopia E15 i rzeczywiście, po raz pierwszy potwierdzamy zasadność łączenia2., 3. i 4. kości śródstopia do eksperymentów.
Kości śródstopia z grupy E17/E18 są powszechnie wykorzystywane do badania mechanizmów wzrostu kości ze względu na ich niezwykły potencjał do wzrostu ex vivo przez długi czas (tj. powyżej 14 dni w hodowli). Są one dobrze ugruntowanym modelem do badania roli czynników wzrostu we wzroście podłużnym zarodka. Ponadto preparacja i hodowla śródstopia po urodzeniu jest powszechnie stosowana w celu nakreślenia mechanizmów otaczających wzrost kości po urodzeniu, ponieważ rozumie się, że wzrost kości po urodzeniu i wzrost kości płodu są regulowane w różny sposób 21. Wzrost kości obserwowany w hodowanych śródstopiu po urodzeniu jest jednak znacznie mniejszy niż obserwowany w zaczątkach embrionalnych 25,34, co ogranicza ich potencjał w badaniach długoterminowych i podkreśla bardziej ogólnoustrojowy wpływ na wzrost kości na tym etapie pourodzeniowym. Rzeczywiście, 3-dniowe śródstopie po urodzeniu myszy jest zazwyczaj najnowszym etapem, który można wykorzystać do uzyskania mierzalnego wzrostu 34.
Tutaj opisujemy nasz protokół izolacji zarodkowych kości śródstopia w E15. Brak minerału hydroksyapaptytu w kościach śródstopia E15 oznacza, że stanowią one bezkonkurencyjny model do badania nie tylko mechanizmów otaczających wzrost kości podłużnej, ale także inicjacji mineralizacji szkieletu. Zmineralizowana macierz końcowej strefy chondrocytów przerostowych stanowi rusztowanie dla atakujących osteoblastów w celu wytworzenia specyficznej dla kości macierzy (osteoidu), która jest następnie mineralizowana, a zatem ta początkowa mineralizacja jest niezbędna do pomyślnego i funkcjonalnego tworzenia kości 35. Rzeczywiście, wiele ostatnich doniesień wykorzystujących kości śródstopia E15 potwierdziło ich unikalną zdolność do badania procesu mineralizacji 28,36,37. Ponadto naukowcy opisali zastosowanie kości śródstopia E15 jako modelu angiogenezy 38, podkreślając potencjał embrionalnych kości śródstopia jako modelu poza środowiskiem wzrostu/mineralizacji kości.
Opisany przez nas protokół wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, w tym okapu z przepływem laminarnym, mikroskopu preparacyjnego do przeprowadzenia sekcji oraz inkubatora CO2 do hodowli wyciętych rudymentów. Co więcej, bardzo podstawowa pożywka hodowlana zawierająca αMEM, BSA, antybiotyki, leki przeciwgrzybicze i kwas L-askorbinowy (kofaktor w syntezie hydroksyproliny i hydroksylizyny, dwóch niezbędnych aminokwasów do produkcji kolagenu 39) pozwala uniknąć stosowania nieokreślonych dodatków, takich jak surowice zwierzęce. Tradycyjnie, badacze dodawali βGP do pożywki używanej do hodowli embrionalnych kości śródstopia, ale jak ujawniono w naszych wynikach, użycie dodatkowego źródła fosforanów nie jest wymagane do pomyślnej mineralizacji w tym systemie hodowli. Jest to ważne odkrycie w naszym dążeniu do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw mineralizacji ECM.
Śródstopie zostało wcześniej zakażone adenowirusami zawierającymi dominująco-ujemne formy Smad2 w celu zbadania roli przekształcającego czynnika wzrostu β w regulacji rozwoju kości długich 40. W tym miejscu ujawniamy również udaną transfekcję kości śródstopia typu dzikiego E15 z cząsteczkami wirusa GFP, co wskazuje, że techniki lentiwirusowe można łatwo zastosować do manipulowania ekspresją genów w kulturach śródstopia. Podobnie, system hodowli narządów śródstopia jest doskonałym modelem, w którym można porównać wzrost kości genetycznie zmienionych myszy, aby lepiej zrozumieć rolę konkretnego genu w procesie wzrostu kości. W naszych poprzednich badaniach wykorzystaliśmy system hodowli narządów śródstopia w celu określenia roli supresora sygnalizacji cytokin-2 (SOCS2) we wzroście kości śródchrzęstnej. Wykorzystując kości śródstopia myszy z niedoborem SOCS2, wykazaliśmy, że hormon wzrostu jest w stanie symulować ich wzrost podłużny niezależnie od insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1), w przeciwieństwie do kości śródstopia typu dzikiego, które nie reagują na leczenie hormonem wzrostu 34,41. Podkreśla to stopień, w jakim można manipulować posiewami śródstopia w celu zbadania wpływu różnych genów i/lub czynników egzogennych na wzrost kości śródchrzęstnej.
Podsumowując, szczegółowo opisaliśmy metodę udanej ekstrakcji i hodowli embrionalnych kości śródstopia, którą można manipulować i badać za pomocą różnych analiz. Ten model ex vivo utrzymuje interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, a także zawiera chondrocyty w różnych fazach chondrogenezy, zapewniając w ten sposób bardziej fizjologiczny model niż komórki w hodowli jednowarstwowej lub 3D. Posiewy narządów śródstopia są zatem unikalnym modelem do badania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za kostnienie śródchrzęstne i mają zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia zarówno fizjologii, jak i patofizjologii kości

Szkielet jest bardzo skomplikowanym, dynamicznym i złożonym organem, który ma szereg funkcji od lokomocji po homeostazę jonów. Szkielet, składający się z kości i chrząstki, składa się z funkcjonalnie odrębnych populacji komórek, które działają w celu utrzymania jego strukturalnej, biochemicznej i mechanicznej integralności 1. Jedną z podstawowych funkcji szkieletu jest jego rola w rozwoju i wzroście. Procesy te wymagają orkiestracji wielu populacji komórkowych, które są regulowane przez ścisłą kontrolę hormonalną i genetyczną.
Z wyjątkiem płaskich kości, np. łopatki, czaszki i mostka, szkielet ssaków powstaje w procesie znanym jako kostnienie śródchrzęstne. Proces ten, regulowany zarówno molekularnie, jak i przestrzennie, rozpoczyna się od kondensacji komórek mezenchymalnych pochodzących głównie z mezodermy 2. Pod wpływem czynnika transkrypcyjnego SOX9 komórki we wnętrzu kondensacji różnicują się w chondrocyty, wyrażając i wydzielając składniki macierzy zewnątrzkomórkowej specyficzne dla chrząstki (ECM), takie jak kolagen typu II i agrekan. Komórki na obrzeżach kondensacji wyrażają kolagen typu I i tworzą okołochrzęstne, wyznaczając perspektywiczną kość 3. Później osteoprogenitory okołochrzęstne różnicują się w osteoblasty, kierowane przez ekspresję czynników transkrypcyjnych, Runx2 i osterix 4. Prowadzi to do przewagi osteoblastów, a warstwa ta zostaje przemianowana na okostną, która tworzy zmineralizowany kołnierz kostny wokół środkowej części kości. Penetracja naczyniowa okostnej i inwazja rusztowania chrzęstnego następuje ze sobą, przynosząc ze sobą hematopoetycznie pochodzące komórki resorpcji kości, osteoklasty, które resorpują resztki chondrocytów i znaczną część macierzy chrzęstnej 5. Powstałe przestrzenie są wypełniane przez osteoprogenitory, dając początek pierwotnemu ośrodkowi kostnienia, który stopniowo zajmuje rdzeń trzonu i łączy się z okostną. Inne komórki dają początek szpikowi kostnemu. Około narodzin naczynia krwionośne i osteoprogenitorzy przenikają do bogatej w chrząstki macierzy po obu stronach (nasady) rozwijającego się trzonu, tworząc wtórne centrum kostnienia. Pomiędzy nasadą a trzonem na obu końcach kości długich znajduje się pasmo chrząstki - płytka wzrostu nasady - która jest odpowiedzialna za koordynację liniowego wzrostu wszystkich kości długich 6.
Chondrocyty na płytce wzrostu początkowo się rozprzestrzeniają, a następnie przechodzą przez morfologicznie odrębne strefy, koordynowane przez sekwencyjną ekspresję czynników transkrypcyjnych i wzrostu. Kulminacją tej sekwencji zdarzeń jest wyjście z cyklu komórkowego i przerost chondrocytów w centrum tego prekursora chrząstki. Przerostowe chondrocyty wykazują silną ekspresję kolagenu typu X i metaloproteinazy macierzy-13 (MMP13), a ich znaczne zwiększenie objętości w kierunku wzrostu podłużnego zapewnia największy wkład we wzrost kości u ssaków 7,8. Ponadto przerostowe chondrocyty mineralizują otaczające je ECM poprzez uwalnianie pęcherzyków macierzy, struktur ograniczonych błoną wyspecjalizowanych do produkcji amorficznego fosforanu wapnia poprzez włączenie fosfataz (tkankowej niespecyficznej fosfatazy alkalicznej (TNAP) i PHOSPHO1) oraz białek kanałujących wapń (aneksyny) 9-11. Ta zwapniała chrząstka jest atakowana przez naczynia krwionośne z leżącego poniżej szpiku, co powoduje rekrutację osteoklastów i resorpcję macierzy. Następnie następuje migracja osteoblastów i wyrównanie do powierzchni zwapniałych resztek chrząstki, gdzie tworzą one warstwę osteoidu, która ulega szybkiej mineralizacji. Tkana kość pierwotnej gąbczastej jest później przebudowywana na kość blaszkowatą wtórnej gąbczastej 12. Zespolenie nasadowe powoduje ustanie kostnienia śródchrzęstnego 13.
Kostnienie śródchrzęstne jest ściśle regulowane przez wiele hormonów endokrynnych i parakrynnych oraz czynników wzrostu, aby zapobiec zaburzeniom rozwoju i/lub podłużnemu wzrostowi kości 14. Lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw tych procesów jest zatem niezbędne w naszym dążeniu do postępów klinicznych z korzyścią dla ludzi. Wcześniejsze badania nad podobieństwami i różnicami między płytkami wzrostowymi w różnym wieku, o różnych lokalizacjach i gatunkach znacznie poszerzyły nasze zrozumienie mechanizmów fizjologicznych otaczających dynamikę płytek wzrostu 15,16. Jednak badanie izolowanych chondrocytów jest trudne, ponieważ usunięcie chondrocytów z ich środowiska może prowadzić do odróżnicowania, któremu towarzyszy utrata ekspresji kluczowych markerów, takich jak Col2a117.
Hodowla eksplantatów narządów śródstopia myszy, zapoczątkowana przez prof. Elisabeth Burger i współpracowników w Holandii, jest wysoce fizjologicznym modelem ex vivo do badania kostnienia śródchrzęstnego i wzrostu kości jako tempa wzrostu kości w kulturze naśladującego obserwowane in vivo 18. Wyjątkowo, hodowla narządów śródstopia umożliwia badanie chondrocytów w różnych fazach chondrogenezy i utrzymuje interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, zapewniając w ten sposób warunki bliższe sytuacji in vivo niż komórki w hodowli 19-21. Co więcej, model ten pozwala na bezpośrednie badanie liniowego wzrostu kości, co nie jest możliwe w pierwotnych hodowlach chondrocytów. Pozwala również na oddzielenie czynników ogólnoustrojowych i lokalnych, co pozwala na szczegółową analizę lokalnych skutków na płytkę wzrostową.
Hodowla kości śródstopia pozwala na badanie wielu parametrów. Codzienne pomiary całkowitej długości i zmineralizowanych obszarów zaczątków można wykonywać za pomocą standardowej mikroskopii z kontrastem fazowym i oprogramowania do analizy obrazu. Histologiczne, hybrydyzacja in situ i barwienie immunohistologiczne mogą być łatwo wykonywane na odcinkach śródstopia, co pozwala na przestrzenną rozdzielczość zarówno jednostek komórkowych, jak i molekularnych, co stanowi główną zaletę w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowli komórkowych. Podejście immunohistochemiczne obejmuje wykrywanie i kwantyfikację wychwytu 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) przez proliferujące chondrocyty 22. Dodatkowo można przeprowadzić dalsze przetwarzanie tkanek śródstopia, aby umożliwić dalszą analizę ekspresji mRNA (RT-qPCR), analizę białek i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej (Western blotting) lub składu lipidów (spektrometria mas). W większości dotychczasowych badań wykorzystuje się zarodkowe kości śródstopia, a nie śródstopie zwierząt po urodzeniu. Chociaż oba modele mogą być pouczające, badanie kości embrionalnych ma kilka zalet: rosną one szybciej i mogą być wykorzystane do badania inicjacji i progresji procesu mineralizacji 23-25.
Ten protokół szczegółowo opisuje zawiłe rozbiory embrionalnych kości śródstopia z tylnej kończyny embrionalnych zarodków mysich w dniu 15 (E15). Ponadto wykazano wzrost i mineralizację anatomicznie odrębnych kości śródstopia.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoklaw sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoklaw sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #4</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>Autoklaw sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Nożyczki SuperFine Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>Rozcieńczony do 70% v/v w dH2O</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM bez nukleozydów</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>22561021</tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe (0,22 &mu; m) Czterowodny sól wapniowo-chlorek fosforoniny o średnicy 33 mm</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku fosfocholiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0378</td><td>Dodać bezpośrednio do pożywki przed eksperymentem</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy-2-fosforan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Uzupełnić zapas w dawce 5 mg / ml i podwielokrotność w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td>Uzupełnij zapas w 150 mM i podwielokrotność w -20 & deg; C</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan sól disodowa hydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>G9422</td><td>Uzupełnij zapas w 1mM i podwielokrotność w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe poddane hodowli komórkowych Nunc</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td>Zobacz materiał D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Podstawowy proces kostnienia śródchrzęstnego jest ściśle regulowany u zdrowego osobnika, aby zapobiec zaburzeniom rozwoju i/lub wzrostowi kości podłużnej. W związku z tym konieczne jest, abyśmy pogłębili naszą wiedzę na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw takich zaburzeń, aby zapewnić postępy w kierunku korzyści dla pacjentów ludzi i zwierząt. Posiew eksplantatów narządów śródstopia myszy jest wysoce fizjologicznym modelem ex vivo do badania kostnienia endochrzęstnego i wzrostu kości, ponieważ tempo wzrostu kości w hodowli naśladuje obserwowane in vivo. Wyjątkowo, hodowla narządów śródstopia umożliwia badanie chondrocytów w różnych fazach chondrogenezy i utrzymuje interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, zapewniając w ten sposób warunki bliższe sytuacji in vivo niż komórki w hodowli jednowarstwowej lub 3D. Protokół ten szczegółowo opisuje skomplikowane wypreparowanie zarodków śródstopia z tylnej kończyny mysich zarodków E15 oraz późniejsze analizy, które można wykonać w celu zbadania kostnienia śródchrzęstnego i podłużnego wzrostu kości.

Celem opisanej metody była izolacja embrionalnych kości śródstopia oraz ich hodowla w celu zbadania podłużnego wzrostu kości i mineralizacji ECM. Zastosowanie przedstawionego tutaj protokołu pozwoliło na pomyślną dyssekcję embrionalnych kości śródstopia, co potwierdzono w badaniu mikroskopii świetlnej. Pomiary kości śródstopia, przeprowadzone zgodnie z instrukcją w Rysunku 1, wykazały ich zdolność do wzrostu wzdłużnego oraz mineralizacji ECM (Rysunki 2 i 3). Mineralizacja macierzy jest najpierw zauważalna w środkowej części trzonu zrębu kostnego i jest łatwo dostrzegalna w mikroskopii świetlnej. Barwienie nie jest wymagane, choć zastosowanie kalceiny może poprawić wizualizację nowo powstałego minerału.
Dotychczasowe badania z wykorzystaniem embrionalnych kości śródstopia 22,27,28 zebrano zpreparowane 2nd, 3rd oraz 4th (środkowe trzy) kości śródstopia, zakładając in vitro wzrost i mineralizacja powinny być porównywalne. In vivo rozwój kości śródstopia myszy ujawnia jednak, że 3B&R oraz 4th palce wykazują oznaki mineralizacji przed wszystkimi pozostałymi kośćmi śródstopia i paliczkami 29Ocena potencjału wzrostu i mineralizacji indywidualnie izolowanych i hodowlanych komórek E15 2nd, 3rd oraz 4th kości śródstopia nie wykazały istotnych różnic w wyglądzie ani zakresie mineralizacji po 7 dniach hodowli (Rysunek 2). W okresie hodowli nie stwierdzono różnic w procentowym wzroście względem wartości wyjściowej. Ponieważ nie odnotowano różnic w potencjale mineralizacji, zastosowano standardowy protokół łączenia 2nd 3rd i 4th kości śródstopia wydają się być odpowiednie do przyszłych badań.
Tradycyjnie badacze dodawali βGP do pożywek stosowanych do hodowli embrionalnych kości śródstopia w celu promowania mineralizacji ECM. Jednak w badaniach nad hodowlami komórkowymi wykazano, że jeśli do pożywek osteogennych zawierających βGP dodano enzym TNAP, dochodzi do egzogennego osadzania minerałów hydroksyapatytu nawet w obecności samych pożywek, bez udziału komórek 30. Aby zbadać wpływ różnych podłoży mineralizujących i agonistów na zdolność mineralizacji kości śródstopia, hodowano kości śródstopia E15 w pożywkach zawierających różne dodatki, a obrazy i pomiary długości rejestrowano codziennie. Wyniki wskazały, że kości śródstopia E15 nadal rosną i mineralizują swoją ECM w przypadku braku βGP. Kości śródstopia E15 hodowane wyłącznie w pożywkach z kwasem askorbinowym wykazały wzrost długości i stopień mineralizacji porównywalne do tych hodowanych w obecności βGP (Rycina 3).
Wykazaliśmy również, że lentiwirusy mogą być wykorzystywane do transfekcji egzogennego DNA do hodowlanych kości śródstopia. W niniejszej pracy pomyślnie przeprowadzono transfekcję kości śródstopia w 0. dniu hodowli (t. j. dzień sekcji) z 2 x 106 cząsteczek wirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na kostkę śródstopia. Aby umożliwić transdukcję wirusową, do kultur dodano jednocześnie polybrene w rozcieńczeniu 1:500. Kultury pozostawiono na 7 dni bez wymiany pożywki, co było niezbędne do zajścia mineralizacji kostek śródstopia w stadium E15, a następnie inkubowano z barwnikiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) przez 5 min i poddano bezpośredniej wizualizacji za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 4). Nasze eksperymenty typu proof-of-concept wyraźnie wykazują skuteczną transdukcję. Wskazane byłoby jednak zbadanie przekrojów z całej długości kości śródstopia w celu oceny poziomu transfekcji oraz skuteczności manipulacji genetycznej.
<img alt="Analiza wzrostu kości, wzór: całkowita długość = a+b+c, strefa zmineralizowana, schemat mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Standardowa metodologia pomiaru długości i strefy mineralizacji kości śródstopia zarębowych. (A) Pomiary całkowitej długości kości śródstopia E15 w dniu 0 hodowli (dzień sekcji), wykonane przez środek kości śródstopia. (B) Pomiary całkowitej długości podłużnej kości śródstopia po siedmiu dniach hodowli. Zwróć uwagę na lekkie wygięcie kości śródstopia. (C) Pomiar długości strefy mineralizacji po siedmiu dniach hodowli. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost kości śródstopia w ciągu 6 dni; wykresy przedstawiają dzienny przyrost długości i zmianę długości mineralnej." src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zdolność do wzrostu i mineralizacji anatomicznie odmiennych kości śródstopia E15. Przeprowadzono obrazowanie i pomiary 2., 3. i 4. kości śródstopia z kończyny tylnej myszy E15. (A) Kolejne obrazy 2., 3. i 4. kości śródstopia w całym okresie hodowli. (B) Procentowy przyrost długości w stosunku do dnia 0 w każdym dniu hodowli. (C) Długość mineralna 2., 3. i 4. kości śródstopia w okresie hodowli wyrażona jako procent całkowitej długości kości śródstopia. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (S.E.M), (n = 6). (D) Długości kości śródstopia myszy C57Bl/6J w każdym dniu hodowli. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (n = 6). Czarny pasek = 1 mm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie wzrostu kości w kulturze; efekty mineralizacji; wykres progresji; wyniki analizy eksperymentalnej." src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Zdolność do wzrostu i mineralizacji kości śródstopia typu dzikiego w stadium E15 hodowanych w różnych mediach osteogennych. (A) Seria obrazów kości śródstopia hodowanych w mediach zawierających wyłącznie kwas askorbinowy, 1 mM βGP, 3 mM fosfocholinę, 1,5 mM chlorek wapnia lub 3 mM chlorek wapnia. (B) Procentowy przyrost długości od dnia 0 kości śródstopia hodowanych z różnymi suplementami. (C) Długość zmineralizowanej części kości śródstopia hodowanych w różnych mediach, wyrażona jako procent całkowitej długości kości śródstopia. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (S.E.M), (n = 6). Czarny pasek = 1 mm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej mikrostruktury wykazujące komórki zabarwione na zielono i niebiesko, skala 0,5 mm." src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Transfekcja kości śródstopia E15 cząsteczkami wirusa GFP. (A) Kości śródstopia E15 zostały poddane transfekcji cząsteczkami wirusa GFP w celu potwierdzenia koncepcji. (B) Kości zabarwiono DAPI w celu wizualizacji DNA. (C) Obrazy nałożone wskazały na pomyślną transfekcję wirusem GFP w całej objętości kości śródstopia. Białe paski = 0,5 mm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiamy protokół do preparowania i hodowli embrionalnych kości śródstopia z dnia 15 (E15). Ten wysoce fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego ex vivo zapewnia warunki bliższe sytuacji in vivo niż komórki w hodowli jednowarstwowej lub 3D i jest niezbędnym narzędziem do badania wzrostu i rozwoju kości.

Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wypreparowanie i hodowla kości śródstopia z myszy w stadium embrionalnym, aby stworzyć model ex vivo umożliwiający badanie wzrostu i mineralizacji kości endochondralnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące kostnienia endochondralnego, czyli procesu, w którym rosną kości długie. W szczególności jest ona odpowiednia do badania mechanizmów inicjacji mineralizacji szkieletu.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie, poprzez utrzymanie oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań komórek z macierzą, bardziej fizjologicznego modelu kostnienia endochondralnego w porównaniu do komórek w hodowli 2D lub 3D. Na początek przygotować medium do sekcji, rozcieńczając alpha minimum essential media w PBS w stosunku 1:13. Następnie ponownie zawiesić BSA w stężeniu 2 mg/mL, a następnie poddać sterylizacji przez filtr strzykawkowy.Następnie należy przygotować pożywkę hodowlaną i wysterylizować ją za pomocą filtra strzykawkowego tego samego typu, którego użyto do BSA. Po przefiltrowaniu pożywek należy nalać 300 µL pożywki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie płytkę 24-dołkową z pożywkami oraz pożywki do sekcji należy umieścić w inkubatorze co najmniej na jedną godzinę w celu wyrównania temperatury.Następnie zanurzyć wysterylizowany w autoklawie sprzęt do sekcji w 70% etanolu. Pozyskać zarodki typu dzikiego C57 black 6J w stadium E15 zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym i umieścić je w szalce Petri zawierającej medium do sekcji. Po dekapitacji przemyć skórę 70% etanolem i za pomocą mikronożyczek Vanas usunąć kończyny tylne z zarodków, wykonując nacięcie wokół bliższego odcinka kości udowej.Zapewnia to usunięcie jak największej części kończyny tylnej. Przed przystąpieniem do sekcji kości śródstopia należy umieścić kończyny tylne w szalce Petriego i zanurzyć je w medium do sekcji. Następnie należy umieścić je pod mikroskopem stereoskopowym.Użyj pęsety nr 4, aby unieruchomić kończynę, a pęsety nr 5 do usunięcia skóry otaczającej embrionalną stopę. Najskuteczniej wykonuje się to, chwytając skórę mniej więcej na wysokości kości piszczelowej i naciągając ją w kierunku paliczków. Następnie za pomocą pęsety nr 4 ostrożnie przytrzymaj kości nadgarstka stopy embrionalnej, a pęsetą nr 5 usuń i odrzuć pierwszą i piątą kość śródstopia.Trzymając stopę w tej samej pozycji, należy użyć pęsety nr 5, aby przerwać tkanki łączną między trzema pozostałymi paliczkami a kośćmi śródstopia. Następnie należy wsunąć końcówkę pęsety nr 5 w staw między paliczkami a kośćmi śródstopia, aby oddzielić paliczki od kości śródstopia. Na koniec należy użyć pęsety nr 5, aby przerwać tkanki łączną między kośćmi nadgarstka a kośćmi śródstopia.Ponownie umieść końcówkę pęsety nr 5 w przestrzeni stawowej między kośćmi nadgarstka a śródstopia i delikatnie oddziel kości śródstopia od kości nadgarstka. Następnie ostrożnie chwyć uwolnione kości śródstopia pęsetą nr 4 i umieść je w świeżym medium do sekcji. Kluczowe jest, aby embrionalne kości śródstopia nie zostały uszkodzone i nie wyschły podczas etapów sekcji i manipulacji.Uszkodzenia kości śródstopia wpływają na ich wzrost i mineralizację. Wszelkie pozostałe tkanki miękkie oddzielą się od kości śródstopia podczas hodowli, dlatego nie należy nadmiernie przejmować się ich całkowitym usunięciem podczas sekcji. Po wypreparowaniu wszystkich wymaganych kości śródstopia, ostrożnie umieść je pojedynczo w uprzednio ogrzanej płytce 24-dołkowej zawierającej 300 µL pożywki hodowlanej.Następnie wykonaj wstępne pomiary podłużne, używając mikroskopu z dołączoną kamerą cyfrową oraz oprogramowania do analizy obrazu. Hoduj kości śródstopia przez maksymalnie 14 dni. Pamiętaj jednak, aby nie zmieniać pożywki w hodowlach E15 aż do co najmniej piątego dnia hodowli, ponieważ wpływa to na ich zdolność do mineralizacji.Po kilku dniach hodowli, po pojawieniu się centralnej strefy mineralizacji, zmierz jej długość. Po kilku dniach hodowli w środkowej części trzonu zalążka kości następuje mineralizacja macierzy, którą można łatwo zaobserwować pod mikroskopem świetlnym. Do badań embrionalnych często łączy się drugą, trzecią i czwartą kość śródstopia.W ciągu siedmiu dni hodowli w przypadku drugiej, trzeciej i czwartej kości śródstopia nie stwierdzono istotnych różnic w wyglądzie ani stopniu mineralizacji, co potwierdziło zasadność tej praktyki. Aby zbadać wpływ różnych podłoży mineralizacyjnych i agonistów na zdolność do mineralizacji kości śródstopia, kości śródstopia z zarodków E15 hodowano w mediach zawierających szereg suplementów, jak pokazano tutaj. Obrazy oraz pomiary długości rejestrowano codziennie.Spośród wszystkich przetestowanych substratów kwas askorbinowy w największym stopniu zwiększył długość minerałów, wykazując działanie najbardziej zbliżone do efektów beta-glicerolofosforanu. Transfekcja wektorem lentiwirusowym plazmidu GFP do kości śródstopia w dniu E15 doprowadziła do ekspresji GFP w obrębie całej kości śródstopia. Podkreśla to skuteczność zastosowania lentiwirusów do transfekcji embrionalnych kości śródstopia.Tę technikę można również wykorzystać do wyciszenia lub nadekspresji genów docelowych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że kości śródstopia w stadium E15 są niezwykle delikatne. Zachowanie integralności kości śródstopia jest kluczowe dla sukcesu późniejszej hodowli.Po sekcji i hodowli kości śródręcza w stadium E15 można przeprowadzić wiele analiz pochodnych. Na przykład ekspresję mRNA i białek można ocenić odpowiednio za pomocą RTQPCR oraz Western blottingu. Ponadto do lokalizacji białek w obrębie kości śródręcza można wykorzystać immunohistochemię.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak skutecznie wypreparować kości śródstopia z kończyn tylnych myszy w 15. dniu embrionalnym. Metodę tę można dostosować do kości śródstopia z 17. lub 18. dnia embrionalnego, które są bardziej użyteczne w badaniach nad wzrostem kości.

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Tutaj prezentujemy metodę hodowli ex vivo długich kości mysich zarówno na etapie płodowym, jak i noworodkowym, odpowiednią do analizy rozwoju i homeostazy kości i chrząstki w kontrolowanych warunkach, podczas rekapitulacji procesu in vivo.

Hodowla i pomiar kości długich myszy płodu i noworodka

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje ulepszony model myszy do urazów płytki wzrostu kości u nastolatków. Używając transgenicznych myszy z trójliniowymi fluorescencyjnymi reporterami dla kolagenu typu I, II i X, pierwotnych matryc związanych z trzema różnymi podłożami płytki wzrostowej, umieszczanie urazów jest kierowane przez natywną fluorescencję pod mikroskopem.

Trójkolorowy transgeniczny model myszy do badania uszkodzeń płytki wzrostowej

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj metodę hodowli mysich embrionalnych kości śródstopia jako fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego. Technika umożliwia badanie mechanizmów mineralizacji szkieletowej w warunkach zbliżonych do in vivo.

Hodowla mysich embrionalnych kości śródstopia: fizjologiczny model kostnienia śródchrzęstnego

Przeglądaj więcej filmów