Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ogólnym celem tej techniki jest wytworzenie szeregu nanoklastrów białkowych w dwuwarstwie lipidowej, która jest kompatybilna z czułymi technikami mikroskopii powierzchniowej do zastosowań w biologii komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biofizyki komórki, w szczególności w jaki sposób nanogrupowanie ligandów wpływa na aktywację i adhezję limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona łatwo odtwarzalna w standardowym laboratorium biofizycznym i jest kompatybilna z zaawansowanymi technikami mikroskopii wrażliwej na powierzchnię, takimi jak TIRF i RICM.

Chociaż technika ta ma na celu zapewnienie wglądu w immunologię, może być stosowana do innych typów komórek z potencjalnymi zastosowaniami w biologii komórki, onkologii i inżynierii tkankowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyczyścić szkiełka szklanej pokrywy i komory obserwacyjne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie nałóż 70 mikrolitrów zawiesiny 2% kulek krzemionki kropla po kropli na szkiełko przykrywające utrzymywane pod kątem 15 stopni.

Obracaj szklankę o 90 stopni co 15 sekund przez jedną minutę, aż zawiesiny wyschną. Bardzo ważne jest, aby stworzyć gęsto upakowaną monowarstwę kulek i uniknąć tworzenia się wielowarstw i klastrów oleju. Dlatego należy zoptymalizować stężenie i objętość roztworu kulki, a także hydrofilowość szkiełka.

Po odparowaniu cieczy umieść szkiełko w urządzeniu do rozpylania magnatronu o częstotliwości radiowej na obrotowym stole umieszczonym w odległości 105 milimetrów od aluminiowo-krzemowego celu. Następnie użyj pompy turbomolekularnej, aby obniżyć ciśnienie w komorze osadzania do 2,6 razy 10 do ujemnych czwartych paskalów. Wprowadź atmosferę czystego argonu o strumieniu 10 standardowych centymetrów sześciennych na minutę i ciśnieniu 0,8 paskala.

Następnie włącz generator prądu o częstotliwości radiowej. Po ustabilizowaniu plazmy napylaj przez dwie minuty, trzymając zamkniętą migawkę, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia z powierzchni docelowej. Otwórz migawkę i pozwól, aby napylanie trwało przez 60 minut, aby osadzić warstwę aluminium o grubości 200 nanometrów na szkiełku.

Następnie odetnij przepływ argonu. Zamknąć zasuwę, aby odizolować pompę turbomolekularną od komory osadzania. Następnie odpowietrz komorę czystym azotem, aby osiągnąć ciśnienie otoczenia.

Odzyskaj zamek pokryty aluminium z komory. Zanurz odzyskane szkiełko w ultraczystej wodzie o temperaturze pokojowej i ultra-sonikuj przy 50 watach i 50 hercach przez 30 sekund. Następnie umieść 0,5 mililitra APTES na dnie eksykatora.

Umieść szkiełko na ceramicznej siatce. Umieść siatkę w eksykatorze. Podłączyć eksykator do pompy membranowej.

Następnie uruchom pompę z maksymalną mocą na 30 minut, aby wytworzyć niskie podciśnienie. Zamknąć zawór eksykatora i wyłączyć pompę. Podgrzewać do 50 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie otworzyć eksykator i zebrać szkiełko. Umieść zebrany szkiełko na wsporniku z PTFE. Zdeponuj 2 mililitry po 25 mikrogramów na mililitr biotyny rozpuszczonej w PBS.

Pozostaw szkiełko na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz 10 razy PBS. Inkubować szkiełko w roztworze wodorotlenku sodu i PBS w temperaturze pokojowej przez noc.

Następnie spłucz szkiełko 10 razy ultraczystą wodą. Po oczyszczeniu koryta Langmuir umieść tacki z PTFE w obudowie koryta z PTFE. Następnie napełnij go ultraczystą wodą.

Ustaw zmierzone ciśnienie na zero miliniutonów na metr. Za pomocą gazoszczelnej szklano-metalowej strzykawki nanieś 30 mikrolitrów 1 miligrama na milimetr roztworu DOPC i chloroformu na powierzchnię wody. Zamknij barierę PTFE, aż zostanie osiągnięte pożądane ciśnienie 27 miliniutonów na metr, aby ścisnąć monowarstwę lipidową.

Następnie, za pomocą zmotoryzowanego zacisku, zanurz przygotowany szkiełko w obudowie z PTFE. Przytrzymaj suwak w zacisku prostopadle do interfejsu powietrze-woda. Podnieś suwak przez interfejs z prędkością 15 milimetrów na minutę, utrzymując stałe ciśnienie 27 miliniutonów na metr.

Następnie umieść szkiełko poziomo na powierzchni wody nad tacką z PTFE. Następnie za pomocą metalowej pęsety wepchnij szkiełko do tacki z PTFE, zanurzając je w ultraczystej wodzie. Za pomocą pęsety przenieś tackę z PTFE zawierającą szkiełko do krystalizatora wypełnionego ultraczystą wodą.

Przenieś powlekaną szkiełko pod wodę do komory obserwacyjnej. Następnie zamknij komorę, upewniając się, że w środku uwięziony jest około 1 mililitr wody. Kolejnym delikatnym krokiem jest montaż komory na próbki pod wodą.

I należy bezwzględnie unikać kontaktu z powietrzem osadzonych dwuwarstw, więc aby to zapewnić, należy używać dużej ilości wody i upewnić się, że cały proces montażu może odbywać się pod wodą. Wyjmij zmontowaną komorę z wody, sprawdź, czy komora jest wodoszczelna i wolna od wycieków. Dodaj 500 mikrolitrów PBS, a następnie usuń 500 mikrolitrów płynu z komory.

Powtórz ten proces 10 razy, aby całkowicie zastąpić jeden mililitr ultraczystej wody w komorze PBS. Następnie wprowadzić 100 mikrogramów na mililitr białka surowicy bydlęcej do komory obserwacyjnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie spłucz dwuwarstwę, wyjmując i dodając 500 mikrolitrów z komory, 10 razy. Następnie funkcjonalizuj ligandami, odłóż komórki i obserwuj nanowzór proteolipidowy i płynność SLB, jak opisano w protokole tekstowym. W tym protokole maska koralikowa jest używana do tworzenia wtórnej metalowej maski poprzez kontrolowane osadzanie aluminium.

Następnie maska koralikowa jest usuwana, pozostawiając warstwę aluminium z otworami. Następnie w fazie gazowej osadza się organo-aminosilinę, zwaną APTES, a następnie osadza się BSA-Biotyna w fazie wodnej. Następnie aluminium jest usuwane, odsłaniając nanometryczne plamy białkowe.

Na koniec przestrzeń między punktami jest ponownie wypełniana podpartą dwuwarstwą lipidową. Następnie wykonywane są obrazy epifluorescencji nanokropek i podpartej dwuwarstwy lipidowej. Złożony obraz pokazuje doskonałą komplementarność z dwuwarstwą lipidową osadzoną w unikalny sposób wokół kropek białkowych, ale nie na nich.

Na obrazie epifluorescencji świeżo osadzonej podpartej dwuwarstwy lipidowej, kropki białkowe pojawiają się jako ciemne plamy w jasnym morzu lipidów. Jednak po ciągłym wybielaniu fotograficznym przez 50 sekund, obraz pokazuje halo wewnątrz obszaru ograniczonego przez membranę polową, co wskazuje, że lipidy są ruchome. Analiza średniego profilu intensywności wzdłuż krawędzi membrany pola oraz zaniku tej intensywności w czasie podczas procesu bielenia ujawnia, że stała dyfuzji wynosi pięć mikrometrów kwadratowych na sekundę.

Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby utrzymać bardzo czyste warunki podczas osadzania aluminium i dokładnie skalibrować krzywą osadzania. Po tej procedurze wzorzysty slajd może być dalej funkcjonalizowany.

Na przykład poprzez dodanie kolejnej biomolekuły w dwuwarstwie. Używamy tego do naśladowania antygenu roślinożernych komórek, w celu zbadania aktywacji limfocytów T. Tak więc po jej opracowaniu technika ta powinna zainteresować różnych odbiorców.

Na przykład, inżynierowie tkankowi mogą chcieć używać go jako rusztowania do hodowli sztucznych tkanek, a onkolodzy mogą używać go jako platformy do zadawania fundamentalnych pytań dotyczących dodawania komórek rakowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć obszar nanoklastrów białkowych w obsługiwanej dwuwarstwie lipidowej, która jest kompatybilna z zaawansowaną techniką mikroskopii. Chociaż używamy tego do badania limfocytów T, uważamy, że ten substrat ma potencjał, aby stać się platformą z wyboru do badania interakcji dowolnego rodzaju komórek z kontrolowaną błoną proteolipidową.