Name: Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę tworzenia nanoklastrów białkowych w podpartej dwuwarstwie lipidowej do badań aktywacji limfocytów T. Technika jest kompatybilna z zaawansowaną mikroskopią optyczną i łatwo powtarzalna w standardowych laboratoriach biofizycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Laurentowi Limozinowi, Pierre'owi Dillardowi i Astrid Wahl za kontynuowanie owocnych dyskusji na temat zastosowań komórkowych. Dziękujemy również Fredericowi Bedu z zakładu PLANETE cleanroom za pomoc w obserwacjach SEM. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu nr 307104 FP/2007-2013/ERC.

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych i komór obserwacyjnych
<ol>
	<li>Ułożyć szklane laminki na tacy wielomiejscowej wykonanej z materiału obojętnego, np. z politetrafluoroetylenu (PTFE).</li>
	<li>Zanurzyć tacę z laminkami oraz komorę obserwacyjną w roztworze surfaktantu (odpowiedni będzie dowolny produkt zalecany do czyszczenia kuwet kwarcowych).</li>
	<li>Poddać działaniu kąpieli ultradźwiękowej w roztworze surfaktantu przez 30 min w temperaturze pokojowej (od 20 do 30 °C).</li>
	<li>Płukać 5 razy wodą ultraczystą (18.2 MΩ.cm, 0.059 µS/cm).</li>
	<li>Poddać działaniu ultradźwięków w roztworze surfaktantu przez 30 min w temperaturze pokojowej (od 20 do 30 °C).</li>
	<li>Płukać 10 razy wodą ultraczystą.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 1.5 i 1.6 dwukrotnie.</li>
	<li>Przechowywać w wodzie w temperaturze pokojowej (od 20 do 30 °C) przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie białkowych nanokropek
<ol>
	<li>Osadzanie kulek
	<ol>
		<li>Nanieść zawiesinę kulek krzemionkowych (2% v/v, 70 µL) kropla po kropli na szkiełko podstawowe (24 x 24 mm, grubość 170 µm) utrzymywane pod kątem 15 stopni.</li>
		<li>Pozostawić zawiesinę do rozprowadzenia przez około 1 min, obracając szkło o 90° co 15 s.</li>
		<li>Pozwolić cieczy odparować w warunkach otoczenia.</li>
		<li>Przechowywać w czystej komorze szklanej lub PTFE w warunkach otoczenia do 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie aluminium
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełka (przygotowane w sekcji 2.1) wewnątrz urządzenia do rozpylania magnetronowego o wysokiej częstotliwości (RF) 8, na stole obrotowym w odległości około 105 mm od tarczy aluminium (99%) : krzem (1%).</li>
		<li>Odpompować komorę osadzania do ciśnienia 2,6 x 10-4 Pa za pomocą pompy turbomolekularnej. Krok ten jest istotny dla usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń gazowych.</li>
		<li>Wprowadzić atmosferę czystego argonu (5N, 99,999%) ze strumieniem 10 s.c.c.m. przy ciśnieniu 0,8 Pa (6,6 mTorr). 
		UWAGA: Wprowadzany strumień argonu jest kontrolowany przez kontroler przepływu masowego, a ciśnienie procesu jest monitorowane za pomocą manometru. Przepływ gazu argon jest ciągły i kontrolowany przez równowagę między zaworami wlotowymi a wylotowymi.</li>
		<li>Włączyć generator mocy RF. 
		UWAGA: Tutaj zastosowano typowy zakres mocy wysokiej częstotliwości 400-600 W przy częstotliwości 13,56 MHz. Generator RF jest używany z siecią dopasowującą w trybie pojemnościowego sprzężenia plazmy. Moc odbita jest monitorowana i minimalizowana za pomocą adaptacji sieci.</li>
		<li>Po ustabilizowaniu plazmy przeprowadzić rozpylanie przez 2 min przy zamkniętej przesłonie, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia z powierzchni tarczy.</li>
		<li>Otworzyć przesłonę i kontynuować rozpylanie przez 60 min, aby osadzić aluminium na szkiełku szklanym do grubości 200 nm.</li>
		<li>Odciąć dopływ argonu, zamknąć zawór odcinający, aby odizolować pompę turbomolekularną od komory osadzania, i odpowietrzyć komorę czystym azotem do uzyskania ciśnienia pokojowego. Wyjąć szkiełka pokryte aluminium. Przechowywać do miesiąca w czystym i hermetycznie zamkniętym pudełku szklanym lub PTFE w warunkach otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie z fazy gazowej organosilanu
	<ol>
		<li>Zanurzyć szkiełko pokryte aluminium przygotowane w kroku 2.2.6 w wodzie ultraczystej w temperaturze pokojowej i poddać ultradźwiękom przez 30 s w kąpieli ultradźwiękowej (50 W, 50/60 Hz, między 20 a 30 °C).</li>
		<li>Nanieść 0,5 mL (3-aminopropyl)-trietoksysilanu (APTES) na dno eksykatora. 
		OSTROŻNIE: APTES jest organosilanem, który łatwo paruje i jest toksyczny. Z APTES należy pracować wyłącznie pod dygestorium i w rękawiczkach.</li>
		<li>Umieścić szkiełka szklane (przygotowane w 2.3.1) na kratce ceramicznej i umieścić wewnątrz eksykatora.</li>
		<li>Podłączyć eksykator do pompy membranowej i uruchomić z maksymalną mocą przez 30 min, aby wytworzyć niską próżnię.</li>
		<li>Zamknąć zawór eksykatora i wyłączyć pompę.</li>
		<li>Ogrzewać eksykator do temperatury około 50 °C przez 1 h.</li>
		<li>Otworzyć eksykator i wyjąć szkiełka.</li>
		<li>Przenieść do innego czystego eksykatora w celu przechowywania do 48 h w temperaturze pokojowej (20 do 30 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie pierwszej warstwy białka – albuminy surowicy bydlęcej znakowanej biotyną (BSA-biotyna)
	<ol>
		<li>Umieścić jedno z szkiełek przygotowanych w sekcji 2.3 na podkładce PTFE.</li>
		<li>Nanieść 1 mL roztworu BSA-biotyny o stężeniu 25 µg/mL rozpuszczonej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej (20 do 30 °C).</li>
		<li>Przepłukać 10 razy PBS. Przechowywać próbkę do 24 h w temperaturze 4 °C, z dala od źródła światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunięcie maski aluminiowej
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w roztworze NaOH w PBS (przygotowanym przez kroplowe dodawanie 1 M NaOH do około 100 mL PBS do uzyskania pH≈12) przez noc w temperaturze pokojowej (między 20 a 30 °C). 
		OSTROŻNIE: NaOH jest żrący i należy z nim pracować w rękawiczkach.</li>
		<li>Przepłukać 10 razy w wodzie ultraczystej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Osadzanie wspieranej dwuwarstwy lipidowej (SLB)
<ol>
	<li>Czyszczenie koryta Langmuira
	<ol>
		<li>Usuń wodę z obudowy z PTFE koryta Langmuira za pomocą pompy.</li>
		<li>Wyczyść powierzchnię beztkaninową jednorazową ściereczką nasączoną chloroformem. 
		UWAGA. Chloroform jest toksyczny i należy z nim pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, w masce (lub pod dygestorium) i w odpowiednich rękawiczkach.</li>
		<li>Przemyj 4 razy letnią wodą ultrapure (40 do 50 °C).</li>
		<li>Przemyj co najmniej 6 razy zimną wodą ultrapure.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanoszenie pierwszej warstwy lipidowej
	<ol>
		<li>Umieść tacki z PTFE w obudowie z PTFE koryta Langmuira, a następnie napełnij ją wodą ultrapure.</li>
		<li>Użyj oprogramowania sterującego aparatu Langmuira, aby ustawić mierzone ciśnienie na 0 mN/m.</li>
		<li>Użyj szczelnej strzykawki szklanej lub metalowej, aby nanieść 30 µL roztworu lipidów o stężeniu 1 mg/mL (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) w chloroformie) na powierzchnię wody. Chloroform odparowuje, a cząsteczki lipidów samoistnie tworzą monowarstwę.</li>
		<li>Użyj oprogramowania sterującego, aby skompresować monowarstwę lipidową poprzez zamykanie bariery z PTFE, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia (27 mN/m dla DOPC).</li>
		<li>Użyj oprogramowania sterującego, aby zanurzyć przygotowane w sekcji 2.5.2 szkiełko w obudowie z PTFE za pomocą zmotoryzowanego uchwytu.</li>
		<li>Trzymaj szkiełko w uchwycie prostopadle do granicy faz powietrze-woda. Użyj oprogramowania sterującego, aby powoli (15 mm/min) podnieść je przez granicę faz, utrzymując stałe ciśnienie na poziomie 27 mN/m.</li>
		<li>Umieść w suchym środowisku do natychmiastowego użycia lub do przechowywania do 24 h w temperaturze pokojowej (między 20 a 30 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanoszenie drugiej warstwy lipidowej
	<ol>
		<li>Utrzymuj ciśnienie powierzchniowe w korycie Langmuira na pożądanej wartości 27 mN/m. Kompresuj za pomocą oprogramowania sterującego aparatu Langmuira i/lub dodaj niewielką ilość lipidów, aby osiągnąć pożądane ciśnienie.</li>
		<li>Umieść szkiełka z monowarstwą lipidową, przygotowane w sekcji 3.2.6, poziomo na powierzchni wody. Upewnij się, że każde szkiełko unosi się nad tacką z PTFE.</li>
		<li>Wpychaj szkiełka jedno po drugim w dół, do odpowiadających im tacek z PTFE, używając pęsety z PTFE lub metalowej, tak aby zostały zanurzone w wodzie. Unikaj przechylania szkiełek podczas wpychania.</li>
		<li>Użyj pęsety z PTFE lub metalowej, aby przenieść tacki z PTFE zawierające szkiełka do krystalizatora wypełnionego wodą ultrapure, dbając o to, aby szkiełka nie miały kontaktu z powietrzem.</li>
		<li>Użyj pęsety z PTFE lub metalowej, aby przenieść, pracując pod wodą, szkiełko pokryte dwuwarstwą do komory obserwacyjnej. 
		UWAGA: Komora obserwacyjna jest umieszczona pod wodą wewnątrz krystalizatora. Komora obserwacyjna jest wykonana na zamówienie i składa się z pierścienia z PTFE z uszczelką gumową i stalowych obudów, które można zmontować pod wodą, tworząc wodoszczelną komorę, której powierzchnią dolną jest szkiełko wcześniej pokryte dwuwarstwą lipidową.</li>
		<li>Zamknij komorę, kontynuując pracę pod wodą i dbając o to, aby wewnątrz komory uwięziono około 1 mL wody.</li>
		<li>Wyjmij zmontowaną komorę z wody. Upewnij się, że jest wodoszczelna i nie ma wycieków.</li>
		<li>Zastąp 1 mL wody ultrapure znajdującej się w komorze obserwacyjnej buforem PBS, dodając i usuwając 500 µL PBS 10 razy. Upewnij się, że w komorze nigdy nie zabraknie cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok blokowania SLB
	<ol>
		<li>Wprowadź 100 µg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do komory obserwacyjnej zawierającej szkiełko przygotowane w sekcji 3.3.6 i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej (między 20 a 30 °C).</li>
		<li>Przepłucz dwuwarstwę, usuwając i dodając 500 µL PBS 10 razy. Dwuwarstwę można przechowywać przez 24 h w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Funkcjonalizacja ligandami
<ol>
	<li>Do komory zawierającej preparat na szkiełku przygotowany w sekcji 3.4.2 dodać neutrawidynę fluorescencyjną lub niefluorescencyjną (NAV, deglikozylowaną wersję awidyny niezakładowaną przy pH 7) w stężeniu 2 µg/mL na 30 min w temperaturze pokojowej (od 20 do 30 °C).</li>
	<li>Przepłukać, dodając i usuwając 500 µL PBS-u 10 razy.</li>
	<li>Do komory zawierającej preparat na szkiełku przygotowany w sekcji 3.4.2 dodać biotynilowane przeciwciało anty-CD3 w stężeniu 2 µg/mL. W przypadku podwójnej funkcjonalizacji SLB i kropek, dodać Fc-ICAM1 His-tag w stężeniu 5 µg/mL (tutaj dwuwarstwa składa się z DOPC + 1% lipidów z kwasem nitrilotrioctowym (NTA)). Pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej (od 20 do 30 °C).</li>
	<li>Przepłukać, dodając i usuwając 500 µL PBS-u 10 razy.</li>
	<li>Zastąpić PBS pożywką komórkową (PBS + 0,1% BSA), dodając i usuwając 500 µL pożywki komórkowej 10 razy.</li>
	<li>Pozostawić 200 µL pożywki komórkowej w komorze ze szkiełkiem.</li>
	<li>Przed dodaniem komórek umieścić komorę na 10 min w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Osadzanie komórek (szczegóły w odniesieniu 7)
<ol>
	<li>Ostrożnie nanieś 400 µL zawiesiny komórkowej do komory. Inkubuj komórki przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Utrwal komórki w 2% paraformaldehydem (PFA) przez 15 min w temperaturze 37 °C. Zastąp PFA buforem PBS poprzez wielokrotne usuwanie i dodawanie 500 µL PBS.</li>
</ol>
6. Obserwacja
<ol>
	<li>Nanowzór proteolipidowy i płynność SLB
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania wzoru białkowego w trybie epi-fluorescencji, stosując odpowiednią długość fali oświetlenia (639 nm) oraz kostki filtracyjne (np. tutaj EX TBP 483+564+642; BS TFT 506+582+659; EM TBP 526+601+688). 
		UWAGA: Intensywność sygnału można skwantyfikować, aby oszacować ilość białka wewnątrz i na zewnątrz kropki. Użyj odpowiedniej długości fali oświetlenia (330 nm) i kostki filtracyjnej do obrazowania dwuwarstwy (BP 365/12, FT 395, LP 397), która jawi się jako jasna z ciemnymi otworami.</li>
		<li>Zastosuj technikę ciągłego wybielania fotochemicznego (CPB)13,15 w celu pomiaru stałej dyfuzji lipidów znacznikowych w dwuwarstwie. Obserwację tę najlepiej przeprowadzić bezpośrednio po osadzeniu SLB. 
		UWAGA: Aby skwantyfikować stałą dyfuzji, podczas procesu CPB mierzy się dwa parametry: specyficzny czas wybielania barwnika (tauT) oraz długość zaniku profilu fluorescencyjnego otoczki utworzonej wokół obszaru wybielonego (tauD). Pierwszy parametr uzyskuje się poprzez wykreślenie ewolucji czasowej intensywności fluorescencji w centrum pola oświetlenia podczas procesu CPB. Drugi parametr uzyskuje się poprzez wykreślenie profilu intensywności na krawędzi strefy oświetlonej (uśrednionego z 12 linii i 5 obrazów po osiągnięciu stanu stacjonarnego). Krzywe są dopasowywane w celu wyznaczenia tauT i tauD. Stała dyfuzji jest określana wzorem tauD2/ tauT (D=<img alt="Równanie współczynnika szybkości zaniku, τ₂/τ₁, w analizie absorpcji przejściowej." src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie">).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunological+Synapse%3A+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li>
<li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays%3A+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li>
<li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li>
<li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li>
<li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li>
<li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li>
<li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+intermembrane+distance%3A+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li>
<li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026146o">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li>
<li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li>
<li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/2009ApSS..256..395M">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li>
<li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li>
<li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li>
<li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.Soc.Rev%22%5BJournal%5D)">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li>
<li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li>
<li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398(2012).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w ramach opisanego powyżej protokołu są związane z tworzeniem nanokropek białkowych lub wypełnianiem przestrzeni wokół kropek przez podpartą dwuwarstwę lipidową. Pierwszym krytycznym krokiem w odniesieniu do nanokropek białkowych jest przygotowanie maski perełkowej. Czyszczenie szkiełka pokrywy ma kluczowe znaczenie. Szkiełka należy czyścić roztworem detergentu, który jest zalecany do czyszczenia kuwet kwarcowych, lub plazmą tlenową. Inne techniki czyszczenia, takie jak zanurzenie w etanolu lub obróbka iz...

Adhezja komórek odbywa się za pośrednictwem wyspecjalizowanych cząsteczek adhezyjnych (CAM), białek obecnych na błonie komórkowej, które są zdolne do wiązania się ze swoim odpowiednikiem na matrycy pozakomórkowej lub na innej komórce. Na przylegających komórkach większość cząsteczek adhezyjnych, w tym wszechobecna integryna i kadheryna, znajduje się w postaci klastrów 1. Interakcja limfocytów T (limfocytów T) z komórkami prezentującymi antygen (APC) stanowi szczególnie uderzającą ilustrację znaczenia klastrów receptorów utworzonych na granicy między dwiema komórkami - często nazywanych synapsami immunologicznymi. Po pierwszym kontakcie z APC, receptory limfocytów T (TCR) na powierzchni limfocytu T tworzą klastry w skali mikronowej, które służą jako platformy sygnalizacyjne 2,3,4, i ostatecznie są scentralizowane, tworząc większy centralny klaster supramolekularny (cSMAC) 5,6,7. Niedawno wykazano, że po stronie APC ligandy TCR są również zgrupowane 8.
W kontekście interakcji limfocytów T z APC, wdrożenie systemów hybrydowych, w których APC jest naśladowany przez sztuczną powierzchnię funkcjonalizowaną odpowiednimi białkami, znacznie poszerzyło nasze zrozumienie interfejsu synaptycznego 2,3,4,5,6,7. W tym kontekście bardzo istotne jest projektowanie powierzchni mimetycznych APC, które rejestrują jeden lub więcej aspektów komórki docelowej. Na przykład, jeśli ligandy są szczepione na podpartych dwuwarstwach lipidowych, mogą dyfundować w płaszczyźnie dwuwarstwy, naśladować sytuację na powierzchni APC i jednocześnie umożliwiać tworzenie cSMAC 6,7. Podobnie, klastry na APC zostały naśladowane poprzez utworzenie wysp ligandów w morzu polimerów 9,10,11,12,13,14. Jednak te dwie cechy do tej pory nie zostały połączone.
Tutaj opisujemy nowatorską technikę tworzenia nano-kropek anty-CD3 (przeciwciała skierowanego przeciwko kompleksowi TCR) otoczonych dwuwarstwą lipidową z dyfuzyjnymi lipidami. Dwuwarstwa jest deponowana przy użyciu techniki Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer 7,15,16 i w razie potrzeby może być funkcjonalizowana określonym białkiem — na przykład ligandem integryny limfocytów T (zwanym ICAM1). Ponadto kropki białkowe anty-CD3 można zastąpić innym przeciwciałem lub CAM. Chociaż wybraliśmy białka do wykorzystania w przyszłości jako platformę do badań adhezji limfocytów T, opisana tutaj strategia może być dostosowana do dowolnego białka, a nawet DNA.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora obserwacyjna</td><td>Domowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alkaliczny koncentrat środków powierzchniowo czynnych (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonikator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krystalizator&nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Woda MQ&nbsp;</td><td>ELGA, Veolia Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotyna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna&nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , Francja</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Balans folii</td><td>NIMA</td><td>Średni</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td>System</td><td></td>TIRF-III</tr><tr><td>Tarcza aluminiowa&nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System rozpylania magnetronu o częstotliwości radiowej; mnie&nbsp;</td><td>zmodyfikowane narzędzie SMC 600 firmy ALCATEL, Francja</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Obecnie istnieje duże zainteresowanie tworzeniem uporządkowanych układów wysp białkowych w morzu pasywowanej powierzchni do badań biologicznych komórek. W ostatnich latach stało się coraz bardziej oczywiste, że żywe komórki reagują nie tylko na biochemiczną naturę prezentowanych im cząsteczek, ale także na sposób, w jaki te cząsteczki są prezentowane. Tworzenie mikrowzorów białkowych jest zatem obecnie standardem w wielu laboratoriach biologicznych; Nanowzorce są również bardziej dostępne. Jednak w kontekście interakcji komórka-komórka istnieje potrzeba modelowania nie tylko białek, ale także dwuwarstw lipidowych. Taki podwójny wzór proteolipidowy nie był do tej pory łatwo dostępny. Oferujemy łatwą technikę tworzenia nanokropek białkowych osadzonych na szkle i proponujemy metodę wypełniania przestrzeni między punktami za pomocą podpartej dwuwarstwy lipidowej (SLB). Na podstawie fotowybielania znacznikowych fluorescencyjnych lipidów zawartych w SLB wykazaliśmy, że dwuwarstwa wykazuje znaczną płynność w płaszczyźnie. Funkcjonalizacja kropek białkowych grupami fluorescencyjnymi pozwala nam je zobrazować i pokazać, że są uporządkowane w regularnej sieci heksagonalnej. Typowy rozmiar kropki wynosi około 800 nm, a pokazany tutaj odstęp wynosi 2 mikrony. Oczekuje się, że substraty te posłużą jako użyteczne platformy do badań adhezji komórek, migracji i mechanodetekcji.

Obrazy fluorescencyjne poddano analizie w celu zmierzenia odstępów i rozmiaru kropek. Typowy odstęp wynosił 1 900 ± 80 nm, a typowy rozmiar kropki 600 ± 100 nm (Ryc. 1g). Odstępy są określone przez rozmiar kulek użytych do wykonania maski. Rozmiar kropki zależy zarówno od rozmiaru kulek, jak i od warunków nanoszenia. SLB jest nanoszona selektywnie wokół kropek białkowych, a nie na nich (Ryc. 2), wykazując pełną komplementarność między otworami widocznymi ...

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Ogólnym celem tej techniki jest wytworzenie macierzy nanoklastrów białkowych w podpartej dwuwarstwie lipidowej, która jest kompatybilna z czułymi technikami mikroskopii powierzchniowej w zastosowaniach biologii komórki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki komórki, w szczególności w kwestii tego, jak nanoklastrowanie ligandów wpływa na aktywację i adhezję limfocytów T. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej powtórzenia w standardowym laboratorium biofizycznym oraz kompatybilność z zaawansowanymi technikami mikroskopii czułej powierzchniowo, takimi jak TIRF i RICM.Choć technika ta została opracowana w celu pogłębienia wiedzy z zakresu immunologii, może ona zostać zastosowana do innych typów komórek, z potencjalnymi zastosowaniami w biologii komórki, onkologii i inżynierii tkankowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić szklane lamellki i komory obserwacyjne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie, kroplami nanieś 70 µL 2% zawiesiny kulek krzemionkowych na lamellkę ustawioną pod kątem 15 stopni.Przez jedną minutę obracaj szkło o 90 stopni co 15 sekund, aż zawiesina wyschnie. Kluczowe jest stworzenie gęsto upakowanej monowarst

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Tutaj opisany jest protokół do generowania regulowanych światłem i odwracalnych wzorców białkowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną na sztucznych błonach lipidowych. Metoda polega na zlokalizowanej fotoaktywacji białka iLID (ulepszonego dimeru indukowanego światłem) unieruchomionego na błonach modelowych, które w świetle niebieskim wiąże się ze swoim białkiem partnerskim Nano (SspB typu dzikiego).

Dynamiczne wzorce białek indukowane światłem na błonach modelowych

Poznaj metodę tworzenia nanoklastrów białkowych w podpartej dwuwarstwie lipidowej do badań aktywacji limfocytów T. Technika jest kompatybilna z zaawansowaną mikroskopią optyczną i łatwo powtarzalna w standardowych laboratoriach biofizycznych.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Przeglądaj więcej filmów