Name: Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodologię in vivo do badania złożonych sieci sygnalizacyjnych w zarodkach bezkręgowców. Ta technika pozwala efektywnie charakteryzować szlaki sygnałowe i regulacyjne sieci genów w kontekście rozwojowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Robertowi Angererowi za uważne przeczytanie i zredagowanie manuskryptu. NIH R15HD088272-01, a także Biuro Badań i Rozwoju oraz Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytetu Stanowego Mississippi udzieliły RCR wsparcia dla tego projektu.

1. Strategia projektowania Morpholino o wysokiej przepustowości
<ol>
	<li>Zidentyfikuj gen(y) będący przedmiotem zainteresowania (np. podejście genów kandydujących, analiza cis-regulatorowa, RNAseq i/lub proteomiczne badania różnicowe).</li>
	<li>Korzystaj z danych genomicznych, transkryptomicznych i ekspresji genów dostępnych na często aktualizowanych stronach internetowych (np. SpBase http://www.echinobase.org20 i S. purpuratus Genome Search http:///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index.html), aby ustalić, czy profil ekspresji czasoprzestrzennej pokrywa się z danym mechanizmem rozwojowym. Jeśli nie są dostępne żadne dane dotyczące ekspresji, wygeneruj startery qPCR i/lub antysens w sonda situ do oceny wzorca ekspresji genów.</li>
	<li>Po określeniu przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji, uzyskaj sekwencję DNA z genomowych stron internetowych.
	<ol>
		<li>Aby wygenerować blokujące translację oligonukleotydy morfolino, należy uzyskać sekwencję nieulegającego translacji regionu 5' (5' UTR) bezpośrednio przed kodonem inicjacyjnym z baz danych wyrażonego znacznika sekwencji (EST) dostępnych na stronach internetowych SpBase lub S. purpuratus Genome Search. Jeśli ta informacja jest niedostępna dla interesującego genu, wykonaj 5' RACE.</li>
		<li>Aby zaprojektować morfolino blokujące splicing, wyszukaj sekwencję genomową, w tym eksony i introny, za pomocą narzędzia do usuwania rusztowania w SpBase lub narzędzia do wyszukiwania genomu S. purpuratus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorzystaj z http://oligodesign.gene-tools.com strony internetowej do projektowania oligonukleotydów, aby zaprojektować pożądaną sekwencję morfolinową z 25 parami zasad.
	<ol>
		<li>W przypadku morfoliny blokującej translację należy użyć sekwencji mRNA od 5' do 3' jako źródła translacyjnej sekwencji docelowej. Dołącz sekwencję 5' UTR (około 70 nukleotydów przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji) plus 25 zasad regionu kodującego (poniżej miejsca początkowego) z kodonem start oznaczonym nawiasem (ATG).</li>
		<li>W przypadku morpholino blokującego splicing wybierz sekwencję graniczną intron-ekson lub ekson-intron i uwzględnij 50 zasad (25 zasad sekwencji eksonów i 25 zasad sekwencji intronu) wokół regionów granicznych. Zeskanuj genom za pomocą sekwencji morpholino, aby sprawdzić, czy sekwencja jest unikalna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja oligonukleotydów morfolino
<ol>
	<li>Przygotować 3 mM roztwory podstawowe oligonukleotydów morfolino, dodając 100 μl wody wolnej od nukleaz do fiolki z morfoliną o stężeniu 300 nmol. 
	UWAGA: Nie używaj wody uzdatnionej DEPC do ponownego zaparcia, ponieważ pirowęglan dietylu może uszkodzić morfolino.</li>
	<li>W celu pierwszej rekonstytucji odwirować fiolkę zawierającą podstawowy roztwór oligonukleotydu przez 30 s z pełną prędkością (14 000 - 16 000 x g), krótko odwirować, ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 do 10 minut, krótko wirować i utrzymywać zapas morfolino w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Roztwory podstawowe morfolino przechowuje się w temperaturze od -20 °C do +4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań zawierający oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów o pożądanym stężeniu. Roztwór ten zawiera zwykle 20% glicerolu lub 125 mM KCl jako nośnik i 15% FITC-Dekstranu (roztwór podstawowy izotiocyjanianu fluoresceiny 10 000 MW 2,5 mg/μL). FITC-Dekstran i inne fluorescencyjne koniugaty dekstranu są rutynowo stosowane do identyfikacji wstrzykniętych zarodków za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Roztwory do wstrzykiwań należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Podgrzewać roztwór morfolino w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej przez co najmniej 2-5 minut.</li>
	<li>Krótko wirować roztwór morfolino przez 30 s z pełną prędkością (14 000 - 16 000 x g), wirować przez 1 minutę i wirować z pełną prędkością (14 000 - 16 000 x g) przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Na igły iniekcyjne należy napełnić roztworem morfolino. Szczegółowy protokół mikroiniekcji można znaleźć w Stepicheva and Song, 201421 oraz Cheers and Ettensohn, 200422.</li>
</ol>
3. Utrwalenie i protokół in situ po 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf) u zarodków S. purpuratus 
UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany z Arenas-Mena et al., 200023 i Sethi et al., 201424.
<ol>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Dodać kilka kropli utrwalacza (patrz poniżej) do studzienek zawierających zarodki, delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić do osiadania. Usunąć roztwór utrwalający, a następnie wymieszać zarodki z dwoma dodatkowymi 180 μl roztworu utrwalającego. 
		UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie wymieszać zarodki podczas płukania, kilkakrotnie delikatnie pipetując w górę i w dół. Niezastosowanie się do tego może obniżyć stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Pozostaw zarodki do utrwalenia w drugim płukaniu utrwalającym przez 50 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej (RT) w 4% paraformaldehydzie klasy mikroskopii elektronowej, składającym się z 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20 i sztucznej wody morskiej (ASW). Spraw, aby to rozwiązanie było świeże za każdym razem, aby uzyskać najlepsze wyniki. Ponadto, dla ułatwienia i praktyczności, zarodki są umieszczane na płytkach 96-dołkowych.
		<ol>
			<li>Do utrwalania 20 ml użyj 5 ml 16% paraformaldehydu, 15 ml ASW, 200 μl 1 M MOPS pH 7,0 i 20 μL Tween-20.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć 5 razy w temperaturze pokojowej 180 μl buforu do płukania MOPS składającego się z 0,1 M MOPS o pH 7,0, 0,5 M NaCl i 0,1% Tween-20 przez co najmniej 5 minut lub do momentu, gdy zarodki opadną na dno studzienki. Ponownie, Ważne jest, aby dokładnie wymieszać zarodki z buforem do płukania, delikatnie pipetując kilka razy w górę iw dół. Bufor do mycia MOPS może być używany przez 2 dni, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
		<ol>
			<li>W przypadku 40 ml buforu do płukania MOPS użyj 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH2O i 40 μl Tween-20.</li>
			<li>Utrwalone zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 oC przez 2 dni. 
			UWAGA: Jeśli przechowujesz utrwalone zarodki dłużej, dodaj 0,2% azydku sodu do buforu do płukania MOPS, aby zapobiec rozwojowi bakterii.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed hybrydyzacją
	<ol>
		<li>Odessać bufor płuczący MOPS i dodać 180 μl buforu płuczącego MOPS do buforu hybrydyzacyjnego w stosunku 2:1, wymieszać zarodki z roztworem przez delikatne pipetowanie kilka razy i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Bufor hybrydyzacyjny składa się z 70% formamidu, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg/ml BSA i 0,1% Tween-20.
		<ol>
			<li>W przypadku 40 ml buforu hybrydyzacyjnego użyj 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH2O, 0,04 g BSA i 40 μl Tween-20. Dobrze wymieszaj przez wirowanie, dodaj 28 ml formamidu i ponownie zwiruj.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć do przemywania i hybrydyzacji MOPS w stosunku 2:1 i dodać 180 μl buforu do przemywania MOPS w stosunku 1:2 do buforu hybrydyzacyjnego, wymieszać zarodki z roztworem i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przed hybrydyzacją sondą delikatnie wymieszaj zarodki w 100 - 150 μL buforu hybrydyzacyjnego. Inkubować zarodki w temperaturze 50 °C przez co najmniej 1 h, 
		UWAGA: Dopuszczalna jest inkubacja zarodków przez noc. Przed inkubacją uszczelnij studzienki arkuszem kleju, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>krzyżowanie
	<ol>
		<li>W osobnej probówce dodaj 0,1 - 0,3 ng/μL sondy i 500 μg/ml tRNA drożdży do buforu hybrydyzacyjnego, a następnie delikatnie zwiruj, aby uzyskać roztwór sondy. Drożdżowe tRNA dodaje się do roztworu sondy w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania sondy antysensownej. Wstępnie podgrzać ten roztwór do temperatury 50 °C i odessać bufor hybrydyzacyjny.</li>
		<li>Wymieszaj wstępnie zhybrydyzowane zarodki w 100 μl roztworu sondy, uszczelnij arkuszem kleju i hybrydyzuj w temperaturze 50 °C przez 2 do 7 dni w zależności od sondy (sonda foxq2 może być inkubowana przez 2 dni). 
		UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnić w zależności od sondy. Niektóre geny ulegające ekspresji na niskich poziomach wymagają nawet 7-dniowej inkubacji. Płytki 96-dołkowe można umieścić w pojemniku na wilgoć jako zabezpieczenie przed parowaniem, jeśli arkusz kleju nie uszczelni się prawidłowo.</li>
		<li>Umyj 5 razy w temperaturze 50 °C ze 180 μl świeżo przygotowanego buforu do mycia MOPS, w sumie przez 3 godziny. Następnie przemyć 3 razy (15 min) 180 μl buforu do płukania MOPS w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, aby za każdym razem mieszać zarodki z buforem do płukania, kilkakrotnie delikatnie pipetując.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał
	<ol>
		<li>Odessać bufor do przemywania MOPS i wymieszać zarodki w 180 μl buforu blokującego składającego się z 10% normalnej surowicy owczej i 5 mg/ml BSA w buforze do przemywania MOPS i inkubować przez co najmniej 45 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.</li>
		<li>Usunąć bufor blokujący, a następnie wymieszać zarodki z buforem blokującym zawierającym rozcieńczenie 1:1,500 przeciwciała anty-digoksygeniny sprzężonego z fosfatazą alkaliczną rozcieńczonego w buforze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na szczelnie zamkniętej płytce, aby uniknąć parowania. UWAGA: Nie pozostawiaj przeciwciał włączonych dłużej niż na noc.</li>
		<li>Umyć zarodki 6 razy (5 minut lub do momentu, gdy zarodki opadną) w buforze do płukania MOPS w temperaturze pokojowej. Zarodki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwój in situ
	<ol>
		<li>Umyj zarodki 3 razy (10 min) w temperaturze pokojowej świeżo przygotowanym buforem o pH 9,5 składającym się z 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM lewamizolu i 0,1% Tween-20.
		<ol>
			<li>W przypadku 20 ml buforu pH 9,5 użyj 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 μl 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl2, 20 μl Tween-20, 16,6 ml dH2O i 0,0048 g lewamizolu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować zarodki w temperaturze 37 °C w buforze barwiącym, chronić przed światłem. Bufor barwiący składa się z 10% dimetyloformamidu, 4,5 μl / ml chlorku 4-nitro niebieskiego tetrazolu (NBT) i 3,5 μl / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP) w świeżo przygotowanym buforze o pH 9,5.
		<ol>
			<li>Na 1 ml buforu barwiącego użyj 100 μl dimetyloformamidu, 4,5 μl NBT i 3,5 μl BCIP.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję fosfatazy alkalicznej, przemłukując 3 do 5 razy w buforze do płukania MOPS. Reakcja z sondą foxq2 trwa zwykle od 30 minut do 1 godziny. Niektóre sondy mogą wymagać całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej lub 4 °C.</li>
		<li>Wymieszaj zarodki w roztworze 70% płynu do mycia MOPS i 30% glicerolu. Glicerol zapewnia współczynnik załamania światła niezbędny do mikroskopii. Zarodki można przechowywać w tym roztworze przez kilka tygodni. Uszczelnij płytki plastikową parafiną, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie slajdów i przechwytywanie obrazów
	<ol>
		<li>Przygotuj szkiełko, układając trzy małe paski taśmy dwustronnej w trójkąt z małymi przerwami między paskami na szkiełku.</li>
		<li>Przenieś zarodki w 70% roztworze MOPS i 30% roztworze glicerolu do środka trójkąta i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, nakładając warstwę lakieru do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu światła złożonego z obiektywem 20X i dołączoną kamerą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Erwin, D. H., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hierarchical+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The evolution of hierarchical gene regulatory networks.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).</li>
<li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+body+plan+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development.</a> Cell. 144, 970-985 (2011).</li>
<li>Borggrefe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+intracellular+domain+integrates+signals+from+Wnt%2C+Hedgehog%2C+TGFbeta%2FBMP+and+hypoxia+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways.</a> Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).</li>
<li>Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+canonical+and+noncanonical+Wnt+signaling+pathways+patterns+the+neuroectoderm+along+the+anterior-posterior+axis+of+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos.</a> PLoS Biol. 11, e1001467(2013).</li>
<li>Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2C+TGFbeta+and+Wnt+crosstalk%3A+embryonic+to+in+vitro+cartilage+development+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).</li>
<li>Lapraz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTK+and+TGF-beta+signaling+pathways+genes+in+the+sea+urchin+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome.</a> Dev Biol. 300, 132-152 (2006).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+signalling+pathways+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The evolution of signalling pathways in animal development.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).</li>
<li>Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+signaling+crosstalk+regulates+endomesoderm+segregation+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos.</a> Science. 335, 590-593 (2012).</li>
<li>Range, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+positioning+of+the+anterior+neuroectoderm+in+deuterostome+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos.</a> Genesis. 52, 222-234 (2014).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+the+polarity+of+the+primary+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and the polarity of the primary body axis.</a> Cell. 139, 1056-1068 (2009).</li>
<li>Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deuterostome+origin+of+the+Spemann+organiser+suggested+by+Nodal+and+ADMPs+functions+in+Echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms.</a> Nature communications. 6, 8434(2015).</li>
<li>Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+mechanisms+of+Wnt+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways.</a> Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).</li>
<li>Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).</li>
<li>Houart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+telencephalon+during+gastrulation+by+local+antagonism+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling.</a> Neuron. 35, 255-265 (2002).</li>
<li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li>
<li>Rottinger, E., Lowe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+hemichordates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates.</a> Development. 139, 2463-2475 (2012).</li>
<li>Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li>
<li>Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+control+in+the+sea+urchin+aboral+ectoderm%3A+spatial+initiation%2C+signaling+inputs%2C+and+cell+fate+lockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown.</a> Dev Biol. 374, 245-254 (2013).</li>
<li>Saudemont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancestral+regulatory+circuits+governing+ectoderm+patterning+downstream+of+Nodal+and+BMP2%2F4+revealed+by+gene+regulatory+network+analysis+in+an+echinoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm.</a> PLoS Genet. 6, e1001259(2010).</li>
<li>Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpBase%3A+the+sea+urchin+genome+database+and+web+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SpBase: the sea urchin genome database and web site.</a> Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).</li>
<li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+expression+of+Hox+cluster+genes+in+the+ontogeny+of+a+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin.</a> Development. , 4631-4643 (2000).</li>
<li>Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+labeling+in+developmental+gene+regulatory+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis.</a> Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).</li>
<li>Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+essential+for+patterning+the+maternally+specified+animal-vegetal+axis+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).</li>
<li>Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wnt-FoxQ2-nodal+pathway+links+primary+and+secondary+axis+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos.</a> Dev Cell. 14, 97-107 (2008).</li>
<li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%3A+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li>
<li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li>
<li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin%2C+a+TGF-beta+related+to+Vg1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li>
<li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li>
<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
<li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li>
<li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metodologia jest przykładem, który ilustruje moc wykorzystania embrionów o mniejszej złożoności genomicznej i morfologicznej niż kręgowców do zrozumienia szlaków transdukcji sygnałowej i GRN rządzących podstawowymi mechanizmami rozwojowymi. Wiele laboratoriów stosuje podobne testy podczas wczesnego rozwoju jeżowców w celu przeanalizowania szlaków sygnałowych zaangażowanych w inne zdarzenia specyfikacji losu komórki (np. Notch, Hedgehog, TGF-β i sygnalizacja FGF)27,28,29,30,31.<sup class="xref...

Sieci regulacji genów (GRNs) i szlaki transdukcji sygnału ustalają przestrzenną i czasową ekspresję genów podczas rozwoju embrionalnego, które są używane do budowy planu ciała dorosłego zwierzęcia. Szlaki transdukcji sygnału między komórkami są niezbędnymi składnikami tych sieci regulacyjnych, zapewniając środki, za pomocą których komunikują się komórki. Te interakcje komórkowe ustanawiają i udoskonalają ekspresję genów regulacyjnych i różnicujących w różnych terytoriach i między nimi podczas embriogenezy1,2. Interakcje między wydzielanymi modulatorami zewnątrzkomórkowymi (ligandami, antagonistami), receptorami i koreceptorami kontrolują aktywność szlaków transdukcji sygnału. Asortyment cząsteczek wewnątrzkomórkowych przekształca te dane wejściowe, powodując zmianę ekspresji, podziału i/lub kształtu genów komórki. Chociaż znanych jest wiele kluczowych cząsteczek stosowanych na poziomie zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym w głównych szlakach, jest to wiedza niekompletna, w dużej mierze ze względu na złożoność poszczególnych szlaków sygnałowych. Ponadto różne szlaki sygnałowe często oddziałują ze sobą pozytywnie lub negatywnie na poziomie zewnątrzkomórkowym, wewnątrzkomórkowym i transkrypcyjnym3,4,5,6. Co ważne, podstawowe składniki szlaków transdukcji sygnału są wysoce konserwatywne u wszystkich gatunków metazoanów i, co ciekawe, większość głównych szlaków sygnałowych często pełni podobne funkcje rozwojowe u wielu gatunków, gdy porównuje się organizmy z blisko spokrewnionych typów, w szczególności 7,8,9,10,11.
Badanie sygnalizacji podczas rozwoju jest trudnym zadaniem w każdym organizmie, a badanie szlaków sygnałowych w większości modeli deuterostomicznych (kręgowce, struny bezkręgowców, półstrunowce i szkarłupnie) wiąże się z wieloma istotnymi wyzwaniami: 1) U kręgowców istnieje duża liczba możliwych interakcji ligandów i receptorów/komodulatorów, wewnątrzkomórkowych cząsteczek transdukcyjnych, a także potencjalnych interakcji między różnymi sygnałami ze względu na złożoność genomu12,13,14; 2) Złożona morfologia i ruchy morfogenetyczne u kręgowców często utrudniają interpretację funkcjonalnych interakcji w szlakach transdukcji sygnału i między nimi; 3) Analizy większości gatunków modelowych bezkręgowców niebędących szkarłupniami są ograniczone krótkimi oknami ciężkości, z wyjątkiem niektórych gatunków osłonicowatych15,16.
Zarodek jeżowca ma niewiele z wyżej wymienionych ograniczeń i oferuje wiele unikalnych cech do przeprowadzania szczegółowej analizy ścieżek transdukcji sygnału in vivo. Należą do nich: 1) Względna prostota genomu jeżowca znacznie zmniejsza liczbę możliwych interakcji ligandów, receptorów/koreceptorów i cząsteczek transdukcji wewnątrzkomórkowej17; 2) GRN kontrolujące specyfikację i wzór listków zarodkowych i głównych osi embrionalnych są dobrze ugruntowane w zarodkach jeżowców, pomagając w zrozumieniu kontekstu regulacyjnego komórki/terytorium odbierającego sygnały18,19; 3) Wiele szlaków transdukcji sygnału można badać między wczesnym etapem rozszczepienia a stadiami gastruli, gdy zarodki składają się z jednowarstwowego nabłonka, którego morfologia jest łatwiejsza do analizy; 4) Cząsteczki zaangażowane w szlaki sygnałowe u jeżowców można łatwo manipulować; 5) Wiele jeżowców jest obciążających przez 10 do 11 miesięcy w roku (np. Strongylocentrotus purpuratus i Lytechinus variegatus).
Tutaj prezentujemy metodę systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników szlaków sygnałowych, które określają i kształtują terytoria w zarodkach jeżowców, aby zilustrować korzyści, jakie oferują kilka systemów modelowych bezkręgowców w badaniu złożonych mechanizmów molekularnych.

<table><tbody><tr><td>Morfolino blokujące translację i/lub blokujące splice morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Dostosowane</td><td>Więcej informacji na stronie www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (izotiocyjanian fluoresceiny dekstranu)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Przygotuj 25 mg / ml roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór EM Grade</td><td>Elektron Nauki mikroskopowe</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digoksygeniny sprzężone z fosfatazą alkaliczną</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetraizolu (lewamizol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall</td><td>Corp 56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Chlorek tetrazolu nitro (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Niezwykle niewiele ścieżek transdukcji sygnału między komórkami jest potrzebnych podczas rozwoju embrionalnego, aby wygenerować dużą różnorodność typów komórek i tkanek w dorosłej formie ciała. Jednak każdego roku odkrywanych jest coraz więcej składników poszczególnych szlaków sygnałowych, a badania wskazują, że w zależności od kontekstu istnieje znaczny przesłuch między większością tych szlaków. Ta złożoność sprawia, że badanie sygnalizacji międzykomórkowej w dowolnym systemie modeli rozwojowych in vivo jest trudnym zadaniem. Ponadto potrzebne są wydajne analizy funkcjonalne w celu scharakteryzowania cząsteczek związanych ze szlakami sygnałowymi zidentyfikowanymi na podstawie dużych zbiorów danych generowanych przez ekrany różnicowe nowej generacji. W tym miejscu zilustrowaliśmy prostą metodę skutecznej identyfikacji składników szlaków transdukcji sygnału rządzących losem komórki i specyfikacją osi w zarodkach jeżowców. Prostota genomiczna i morfologiczna zarodków podobna do tych u jeżowców sprawia, że są one potężnymi modelami rozwojowymi in vivo do zrozumienia złożonych interakcji sygnałowych. Opisana tutaj metodologia może być wykorzystana jako szablon do identyfikacji nowych cząsteczek transdukcji sygnału w poszczególnych szlakach, a także interakcji między cząsteczkami w różnych szlakach w wielu innych organizmach.

W embrionie jeżowca wykazaliśmy, że trzy różne odgałęzienia sygnalizacji Wnt (Wnt/β-katenina, Wnt/JNK oraz Wnt/PKC)4,25 oddziałują na siebie, tworząc sieć sygnalizacji Wnt, która steruje wzorcowaniem w osi przednio-tylnej (AP). Jednym z najważniejszych skutków tych zdarzeń sygnalizacyjnych jest to, że początkowo szeroko wyrażona sieć regulacyjna genów (GRN) przedniego neuroektodermu (ANE) zostaje ograniczona do niewielkiego obszar...

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Ogólnym celem tych eksperymentów jest zilustrowanie zalet, jakie oferują proste organizmy w badaniu złożonych interakcji pomiędzy sieciami regulacji genów kierującymi procesami rozwojowymi. Metodologia ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii ewolucyjnej i rozwojowej, takie jak sposób, w jaki szlaki sygnałowe sterują specyfikacją losów komórek wzdłuż głównych osi embrionalnych u metazoa. Jedną z głównych zalet tej metodologii jest możliwość jej wykorzystania do efektywnej charakterystyki szlaków sygnałowych oraz aktywowanych przez nie sieci regulacji genów w kontekście rozwoju in vivo. Procedurę tę zaprezentuje Marina Martinez-Bartolom

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj metodologię in vivo do badania złożonych sieci sygnalizacyjnych w zarodkach bezkręgowców. Ta technika pozwala efektywnie charakteryzować szlaki sygnałowe i regulacyjne sieci genów w kontekście rozwojowym.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami (Wideo) | JoVE Journal

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Przeglądaj więcej filmów