Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest izolacja specyficznych populacji komórek stromalnych pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz zbadanie ich aktywności osteogennej za pomocą testu in vivo. Metoda ta może posłużyć do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracyjnej obszaru twarzoczaszki, takie jak sposób wykorzystania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do tworzenia w pełni funkcjonalnej tkanki kostnej w uszkodzonych ubytkach kostnych. Główną zaletą tej techniki jest szybka izolacja komórek ze świeżej tkanki ludzkiej, dzięki czemu komórki nie spędzają czasu w hodowli komórkowej, o której wiadomo, że zmienia ona ekspresję genów i markerów powierzchniowych komórek.

Zastosowania tej techniki obejmują pacjentów z rozległymi ubytkami kostnymi spowodowanymi nowotworami, urazami lub infekcjami. W przyszłości możliwe może być wyizolowanie populacji komórek ASC i wykorzystanie ich w celach regeneracyjnych. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ nauka tworzenia ubytku w sklepieniu czaszki jest trudna, głównie ze względu na kopulistą strukturę czaszki oraz bliskość opony twardej.

Do niniejszego protokołu należy przygotować tkankę tłuszczową podskórną z brzucha, boku lub uda, pobraną od zdrowego dawcy i przechowywaną w plastikowym kanistrze do odsysania. Do tkanki tłuszczowej należy dodać taką samą objętość sterylnego PBS i mieszać delikatnie przez 30 sekund. Po odczekaniu do osadzenia się warstwy wodnej, należy ją usunąć za pomocą 10 mililitrowej plastikowej pipety.

Następnie zlej tłuszcz do dużego plastikowego pojemnika i dodaj równą objętość mieszaniny trawiennej. Oczyść zamknięty pojemnik z tłuszczem 70% etanolem, a następnie zapieczętuj go parafiną. Następnie wstrząsaj pojemnikiem z prędkością 180 obrotów na minutę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Następnie zneutralizuj trawienie, podwajając objętość reakcji za pomocą standardowego medium. Odwiruj komórki, ostrożnie usuń nadosad i resuspenduj każdy osad w 5 ml standardowego medium. Następnie przepuść wszystkie zawiesiny przez filtr 100 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Odwiruj filtrat w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy 300 G. Usuń nadsącz i resuspenduj osad w 5 mL buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej. Po uzyskaniu zawiesiny pozostaw próbkę na 5 minut w celu przeprowadzenia lizy w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj zawartość probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut i przeprowadź pozostałe etapy separacji zgodnie z protokołem tekstowym.

Prawidłowe sortowanie komórek ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu. Najpierw zawiesić ponownie komórki w buforze FACS w stężeniu jeden milion komórek na 100 µL i przechowywać je w lodzie. Następnie przenieść co najmniej 10 milionów komórek do plastikowej probówki wirówkowej w lodzie oznaczonej jako BMPR-1B.

Przenieś jeden milion komórek do probówki w lodzie oznaczonej jako niebarwione i dodaj do nich jeden mililitr buforu FACS. Pozostałe komórki oznacz jako nieposortowane. Następnie dodaj przeciwciało do probówki BMPR-1B i wymieszaj delikatnie poprzez pipetowanie.

Pozostaw tę mieszaninę do inkubacji przez czas zalecany przez producenta. Następnie odwiruj komórki w celu przygotowania do sortowania FACS i ostrożnie resuspenduj je w 1 ml buforu FACS. Powtórz tę czynność i resuspenduj komórki do stężenia 1 milion komórek na ml.

Następnie przeprowadź wszystkie trzy populacje komórek przez sitka komórkowe o oczkach 40 µm do szklanych probówek FACS. Użyj 500 µl buforu FACS, aby wypłukać pozostałe komórki z filtrów. Teraz przygotuj dwie probówki do zbierania komórek: dla populacji przeciwciał dodatnich oraz ujemnych.

Napełnij każdą z nich dwoma mililitrami standardowej pożywki do hodowli komórkowej; w urządzeniu FACS najpierw przeanalizuj niebarwione komórki i wykorzystaj wyniki do zdefiniowania bramki ujemnej dla markera fluorescencyjnego. Następnie, używając dyszy o średnicy 100 mikronów, posortuj zabarwione komórki do odpowiednich probówek zawierających standardową pożywkę. Jeśli to możliwe, podczas sortowania utrzymuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie należy załadować komórki do rusztowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po znieczuleniu zwierzęcia należy przyciąć sierść w miejscu operacyjnym, a następnie trzykrotnie przemyć odsłoniętą skórę roztworem powidonu jodowego, a następnie 70% etanolem. Następnie należy założyć sterylne pole chirurgiczne, pozostawiając odsłonięte miejsce operacyjne.

Następnie, używając skalpela z ostrzem nr 15, wykonaj cięcie wzdłuż linii pośrodkowej w płaszczyźnie strzałkowej, obejmujące większą część grzbietowej strony czaszki. Następnie, za pomocą pęsety o drobnych zębach, odsunie skórę po prawej stronie nacięcia, aby odsłonić prawą kość ciemieniową. Przygotuj wiertarkę, mocując w niej autoklawowany, 4 mm diamentowy wiertło trepanacyjne.

Następnie wywierć otwór w kości ciemieniowej, dbając jednak o to, aby nie przekroczyć grubości kości i nie uszkodzić opony twardej. Teraz umieść w otworze rusztowanie zawierające komórki lub roztwór kontrolny, a następnie zamknij nacięcie skóry za pomocą ciągłego szwu nylonowego. Po tym wykonaj procedury pooperacyjnej opieki nad myszami zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym.

Skaner mikro-TK defektu czaszki wykonany w dniu operacji wyraźnie pokazuje nowy defekt. Powtórne skany wykonane w późniejszych punktach czasowych wykazują, że defekty zasiane komórkami pozytywnymi pod kątem BMPR-1B zamykają się szybciej niż defekty zasiane komórkami negatywnymi pod kątem BMPR-1B lub komórkami nieposortowanymi. Gdy gojenie zostanie określone ilościowo jako procent całkowitego zamknięcia rany, różnica ta jest łatwo zauważalna.

Następnie fragmenty czaszek zawierające defekty poddano dekalcyfikacji i barwieniu, aby zidentyfikować nową oraz kontrolną regenerację kości przy użyciu metody pięciobarwnej Movat’a, która pozwala odróżnić chrząstkę od kości oraz wszystkie pośrednie stadia dojrzewania. W porównaniu z nieposortowanymi komórkami, komórki pozytywne pod kątem BMPR-1B miały silny wpływ na proces regeneracyjny, co było najbardziej zauważalne wzdłuż krawędzi defektów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o potencjale klinicznym tego eksperymentu w zakresie izolacji specyficznych dla pacjenta komórek ASC i wykorzystania ich do leczenia defektów kostnych.

Wiele dalszych eksperymentów można przeprowadzić na podstawie tej metody, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące gojenia tkanek kostnych, takie jak FACS w celu izolacji ASC o różnych przeznaczeniach linii komórkowych, mikro-CT do analizy procesu gojenia różnych typów komórek i tkanek w czasie oraz wykorzystanie modelu defektu czaszkowego z tego eksperymentu do opracowania kolejnych badań nad regeneracją kości. Należy pamiętać, że praca z tkankami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna. Należy bezwzględnie przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, w tym nosić rękawice, stosować ochronę oczu i prawidłowo utylizować wszystkie odpady niebezpieczne.