Name: Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków kostnych czaszki. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie komórek o wysokim potencjale osteogennym bez konieczności długotrwałej hodowli in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.D.M. był wspierany przez American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. był wspierany przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. był wspierany przez grant NIH R01 GM087609 oraz prezent od Ingrid Lai i Billa Shu na cześć Anthony'ego Shu. H.P.L. i M.T.L. byli wspierani przez Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine i The Oak Foundation. M.T.L. był wspierany przez granty NIH U01 HL099776, R01 DE021683-01 i RC2 DE020771. D.C.W. był wspierany przez grant NIH 1K08DE024269, Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine oraz Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

UWAGA: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę. Wszystkie protokoły zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Stanforda. Podczas obchodzenia się z ludzkimi tkankami i komórkami zawsze przestrzegaj środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), określonych przez Twoją instytucję.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor FACS: Dodać 10 ml FBS, 5 ml Poloxameru 188 i 5 ml Pen-Strep do 500 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przygotuj mieszankę mineralną: Dodaj 0,375 g proszku kolagenazy C. hemolyticum typu II i 5 ml Poloxameru 188 do 500 ml sterylnego podłoża 199/EBSS.</li>
	<li>Przygotuj standardowe podłoże: Dodaj 50 ml FBS i 5 ml Pen-Strep do 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium.</li>
</ol>
2. Zbieranie i izolacja ASC
UWAGA: Upewnij się, że istnieją odpowiednie instytucjonalne zgody na stosowanie tkanek ludzkich i izolowanie ludzkich komórek macierzystych. Uzyskaj ludzką podskórną tkankę tłuszczową z brzucha, boku lub uda od zdrowego dawcy poddanego planowej liposukcji. Trzymaj tłuszcz w plastikowym kanistrze ssącym.
<ol>
	<li>Dodaj sterylny PBS w stosunku 1:1 do tłuszczu w oryginalnym plastikowym kanistrze. (Jeśli jest 500 ml tłuszczu, dodaj 500 ml PBS). Mieszać przez delikatne mieszanie przez 30 s. Poczekaj, aż warstwa wodna osiądzie na dnie (rysunek 1), a następnie odessać i wyrzucić warstwę wodną za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml podłączonej do odsysania.</li>
	<li>Przelej tłuszcz do dużego plastikowego pojemnika i dodaj mieszankę mineralną w stosunku 1:1. Zamknij pojemnik i wyczyść zewnętrzną stronę 70% etanolem. Uszczelnij nakrętkę folią parafinową.</li>
	<li>Mieszać ten pojemnik w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Zneutralizuj trawienie, dodając standardową pożywkę w stosunku 1:1. (Jeśli jest 1,000 ml mieszaniny tłuszczu, dodaj 1,000 ml standardowej pożywki).</li>
	<li>Rozprowadzić mieszaninę równomiernie na parzystą liczbę stożkowych probówek wirówkowych z tworzywa sztucznego o pojemności 250 ml i odwirować mieszaninę przy 300 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Odessać supernatant i uważać, aby pozostawić osad nienaruszony. Zawiesić granulki w standardowym podłożu o pojemności 5 ml dla każdej stożkowej probówki.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę przez filtr 100 mikronów do jednej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforze do lizy RBC o temperaturze pokojowej. Pozostaw mieszaninę na 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml roztworu wzorcowego. Ponownie przefiltruj przez filtr 100 mikronów do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Do nowego stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml dodaj 15 ml roztworu polisacharozy przeznaczonego do rozdzielania na podstawie gęstości (patrz lista odczynników). Następnie, trzymając probówkę pod kątem 45°, ostrożnie odpipetować komórki na bok probówki, tak aby zawiesina komórek delikatnie nałożyła się na wierzch roztworu polisacharozy (Rysunek 2). 
	UWAGA: Ważne jest, aby pipetować komórki na powierzchnię roztworu. Nie należy dodawać roztworu polisacharozy do zawiesiny komórek, ponieważ spowoduje to powstanie nieodwracalnej mieszaniny. Podobnie, nie należy pipetować komórek do środka roztworu polisacharozy.</li>
	<li>Odwirować tę mieszaninę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyć niskiego przyspieszenia (2 - 3 z 10) i ustawić funkcję hamowania wirówki na zero na tym etapie. 
	UWAGA: Widoczne będą trzy warstwy: przezroczysta na dole, mętna w środku i łososiowa na górze. Środkowa warstwa zawiera interesujące komórki.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml ostrożnie usuń środkową warstwę i przenieś do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Lepiej jest całkowicie przenieść środkową warstwę i w tym procesie wziąć część górnej i dolnej warstwy, niż pozostawić część środkowej warstwy.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ całkowitą liczbę żywych komórek. 
	UWAGA: Zwykle używamy błękitu trypanowego dodawanego do mieszaniny komórek do końcowego stężenia 0,8%, aby pomóc w liczeniu komórek. Żywe komórki nie wchłoną niebieskiego barwnika i będą wydawać się białe.</li>
</ol>
3. Sortowanie FACS dla komórek dodatnich BMPR-IB i przygotowanie rusztowań zawierających komórki
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS w stężeniu 1 miliona komórek na 100 μl (na podstawie liczby komórek przeprowadzonej w kroku 2.13).</li>
	<li>Przenieś co najmniej 10 milionów komórek do plastikowej probówki wirówkowej oznaczonej "BMPR-IB". Oddzielnie przenieś milion komórek z 100 μl buforu FACS do oddzielnej plastikowej probówki wirówkowej oznaczonej "Niebarwiona". Dodaj 1 ml buforu FACS do probówki "Niebarwiony". Pozostałe komórki w buforze FACS należy przechowywać na lodzie podczas wykonywania części eksperymentu dotyczącej sortowania FACS. Oznacz te komórki jako "Nieposortowane". Użyj ich jako kontrolek w dalszej części eksperymentu.</li>
	<li>Dodać odpowiednią ilość fluorescencyjnego przeciwciała anty-ludzkiego BMPR-IB do probówki "BMPR-IB" zgodnie z instrukcjami producenta. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby rozprowadzić przeciwciało. 
	UWAGA: Używamy ludzkiego przeciwciała sprzężonego z APC BMPR-IB/ALK-6 w rozcieńczeniu 1:10 (szczegółowe informacje znajdują się na liście odczynników). Jednak przeciwciała różnych producentów będą miały różne zalecane stężenia.</li>
	<li>Przykryj wiaderko z lodem w taki sposób, aby nie przedostawało się światła. Pozostaw mieszaninę komórki/przeciwciała na 30 minut (lub zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał). 
	UWAGA: Jeśli przeciwciało anty-BMPR-IB występuje jako pierwszorzędowe niesprzężone przeciwciało, które wymaga przeciwciała drugorzędowego, należy wykonać oddzielny etap barwienia na lodzie z przeciwciałem drugorzędowym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Odwirować obie probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, uważając, aby nie zassać osadu. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml buforu FACS. Ponownie odwirować probówki o masie 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS do stężenia 1 miliona komórek na 1 ml.</li>
	<li>Przefiltruj komórki "BMPR-IB", "niebarwione" i "niesortowane" przez sitka do komórek o średnicy 40 mikronów do nowych oznakowanych szklanych probówek FACS. Przepłucz filtry buforem FACS o pojemności 500 μl, aby upewnić się, że komórki nie pozostały w filtrze. Dodaj również 2 ml standardowej pożywki do dwóch oddzielnych plastikowych probówek wirówkowych oznaczonych jako "BMPR-IB-dodatni" i "BMPR-IB-ujemny". Użyj tych dwóch, aby zebrać posortowane komórki w maszynie FACS.</li>
	<li>Na maszynie FACS użyj niebarwionych komórek, aby zdefiniować ujemną bramkę dla markera fluorescencyjnego.</li>
	<li>Za pomocą dyszy o średnicy 100 mikronów posortuj dodatnie i ujemne komórki BMPR-IB do odpowiednich probówek zawierających standardowe podłoże. Probówki te należy przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C podczas sortowania, jeśli maszyna FACS ma taką zdolność. 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z artykułem JOVE13 autorstwa Sharon et al., aby uzyskać doskonały protokół sortowania FACS.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej probówce. Odwirować probówki "BMPR-IB-dodatnie", "BMPR-IB-ujemne" i "niesortowane" o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zassać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić komórki w standardowym podłożu do stężenia 1 miliona komórek na 250 μl.</li>
	<li>Otrzymać wstępnie pocięte 4 mm rusztowania PLGA (kwas poli[mlekowo-ko-glikolowy]) pokryte hydroksyapatytem. Umieść każde rusztowanie w studzience z 24-dołkową płytą. Przykryj każde rusztowanie 50 μl zawiesiny komórek (tj. 200 000 komórek) z jednej z trzech grup: niesortowane, BMPR-IB-dodatnie i BMPR-IB-ujemne (ryc. 3). 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z artykułem JOVE 14 autorstwa Lo et al., aby uzyskać szczegółowe informacje na temat budowy rusztowań PLGA.</li>
	<li>Częściowo napełnić otaczające puste studzienki standardową pożywką (aby zapobiec wysuszeniu rusztowań), przykryć płytkę pokrywką i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C przez 30 minut.</li>
</ol>
4. Tworzenie wad kalwarycznych i zastosowanie rusztowania zawierającego ACS
UWAGA: Upewnij się, że istnieją odpowiednie instytucjonalne zgody na tworzenie wad kalwarycznych u żywych myszy. Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanforda.
<ol>
	<li>Znieczulij nagą mysz CD-1 za pomocą wdychanego gazu izofluranowego lub wstrzykniętego długo działającego koktajlu znieczulającego.
	<ol>
		<li>Aby użyć samego gazu, umieść mysz w komorze anestezjologicznej i rozpocznij przepływ tlenu z prędkością 2 - 3 l/min przy 2% stężeniu izofluranu. Gdy mysz jest całkowicie nieprzytomna, połóż ją na kocu z recyrkulacją ciepłej wody z podkładką absorpcyjną i umieść jej pysk w stożku do znieczulenia nosa o tym samym stężeniu tlenu i izofluranu. Uważnie monitorować częstość oddechów i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.</li>
		<li>Aby użyć wstrzykniętego, długo działającego koktajlu znieczulającego, znieczul mysz w komorze anestezjologicznej, jak opisano powyżej, a następnie wstrzyknij koktajl znieczulający. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i obserwuj jej zachowanie. 
		UWAGA: Mysz może na chwilę wyjść ze znieczulenia, ale w ciągu kilku minut powinna być ponownie w pełni znieczulona pod wpływem wstrzykniętego środka znieczulającego. Przenieś mysz do koca z recyrkulacją ciepłej wody pokrytego podkładką chłonną. 
		UWAGA: Do koktajlu znieczulającego zalecamy mieszankę zawierającą ketaminę 10 mg/ml i ksylazynę 1 mg/ml w soli fizjologicznej, podawaną dootrzewnowo. Standardowa dawka tej mieszanki to 300 μl dla myszy 30 g, co odpowiada ketaminie 100 mg/kg i ksylazynie 10 mg/kg. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat środka znieczulającego do wstrzykiwań.</li>
		<li>Użyj manewru szczypania palców u stóp, aby określić głębokość znieczulenia. Odpowiednio znieczulona mysz nie cofnie łapy, gdy zostanie lekko uszczypnięta przez chirurga.</li>
		<li>Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
		<li>Podawać 1 mg/kg buprenorfiny SR podskórnie. 
		UWAGA: Podanie środka przeciwbólowego przed zabiegiem powoduje lepszą ulgę w bólu.</li>
		<li>Podczas całego zabiegu monitoruj częstość oddechów myszy. 
		UWAGA: Mysz prawidłowo znieczulona izofluranem powinna mieć częstość oddechów 50 - 100 oddechów/min. Zwiększona częstość oddechów wskazuje, że znieczulenie jest zbyt lekkie, podczas gdy zmniejszone tempo oddechów może wskazywać, że znieczulenie jest zbyt głębokie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj skórę grzbietowej części czaszki roztworem jodu powidonu, a następnie trzykrotnie 70% etanolem. Ułóż sterylne serwety, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne. 
	UWAGA: Podczas zabiegu należy nosić sterylne rękawice chirurgiczne i utrzymywać sterylną technikę. Dotykaj wyłącznie sterylnych powierzchni i przedmiotów, takich jak sterylna serweta i narzędzia autoklawowane. Poproś asystenta o dostosowanie oświetlenia, otwarte pakiety szwów itp.</li>
	<li>Za pomocą skalpela z 15 ostrzami wykonaj strzałkowe nacięcie w linii środkowej, które rozciąga się na większą część czaszki grzbietowej. Za pomocą kleszczy o drobnych zębach cofnij skórę po prawej stronie nacięcia, aby odsłonić prawą kość ciemieniową.</li>
	<li>Za pomocą wiertła z autoklawowanym wiertłem trepanacyjnym o średnicy 4 mm pokrytym diamentem wywierć ubytek przez kość ciemieniową. Nie należy rozciągać ubytku poza kość do warstwy opony twardej. (Rysunek 4)</li>
	<li>Umieść rusztowanie w ubytku, a następnie zamknij nacięcie skóry za pomocą biegnącego nylonowego szwu.</li>
	<li>Monitoruj mysz i zapewnij standardową opiekę pooperacyjną zgodnie z wytycznymi instytucji.
	<ol>
		<li>Trzymaj mysz na czystym ręczniku papierowym w czystej klatce podczas rekonwalescencji. Jedną połowę klatki należy umieścić na kocu z recyrkulacją ciepłej wody i mysz należy początkowo umieścić w tej połowie.</li>
		<li>Nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby się poruszać. Nie należy zwracać myszy, która przeszła operację, do klatki z innymi myszami, dopóki nie zostanie w pełni wyleczona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki z nową myszką dla każdego rusztowania, które ma być testowane. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne między operacjami za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami lub innej odpowiedniej metody.</li>
	<li>Krótko po zabiegu, a następnie w 2, 4, 6 i 8 tygodniu, użyj mikrotomografii komputerowej, aby przeanalizować szybkość zamykania się ubytku kalwarii. 
	UWAGA: Zobacz artykuł Levi i wsp.6 dla opisu mikrotomografii komputerowej wad kalwarii.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu należy poddać myszy eutanazji, umieszczając je w czystej komorze eutanazyjnej i rozpoczynając przepływ gazowego dwutlenku węgla do komory z prędkością 2 l/min. Po całkowitym ustaniu oddychania (po około 10 minutach) należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić eutanazję.</li>
	<li>Opcjonalnie, po zakończeniu eksperymentu, należy zastosować sekcje i barwienie histologiczne, aby ocenić tworzenie się kości w obrębie ubytku. 
	UWAGA: Zobacz artykuł McArdle i wsp.12 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania próbek kości do badania histologicznego. Przegląd technik histologicznych i barwienia można znaleźć w podręczniku histologicznym, takim jak Manual of Surgical Pathology15.</li>
</ol>

<ol><li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+site+morbidity+after+anterior+iliac+crest+bone+harvest+for+single-level+anterior+cervical+discectomy+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: an update.</a> Injury. 36, S20-S27 (2005).</li>
<li>Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+graft+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Bone graft substitutes.</a> Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in bone tissue engineering.</a> Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).</li>
<li>Chapekar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: challenges and opportunities.</a> J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects.</a> PLoS One. 5 (6), e11177(2010).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29-positive+selection+enhances+osteogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).</li>
<li>Wozney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+bone+formation%3A+molecular+clones+and+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.</a> Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).</li>
<li>Wan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li>
<li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (71), e4425(2013).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Lester, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLester%2C+SC+%22Manual+of+surgical+pathology%22">Manual of surgical pathology</a>. , Saunders/Elsevier. (2010).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Podczas zbioru ASC krytycznym etapem jest odpowiednie trawienie tłuszczu za pomocą kolagenazy. Nieodpowiednie trawienie spowoduje niską wydajność ASC. Podczas sortowania komórek BMPR-IB + metodą FACS ważne jest, aby dokładnie zdefiniować bramkę dla pozytywności. Zbyt luźne definiowanie bramek może spowodować, że posortowane populacje nie będą czyste. Podczas tworzenia ubytku kalwarycznego bardzo ważne jest, aby przewiercić ubytek przez kość czaszki, ale nie przed...

Główne wady kości wynikające z urazu, infekcji lub inwazyjnego raka mają znaczący wpływ na powrót pacjenta do zdrowia i jakość życia. Istnieją techniki wypełniania tych ubytków zdrową kością z innego miejsca w ciele pacjenta, ale ten transfer niesie ze sobą własną chorobowość i ryzyko powikłań1,2,3. Ponadto niektóre ubytki są tak duże lub złożone, że nie jest dostępna wystarczająca ilość kości dawcy, aby wypełnić ubytek. Protezy są potencjalną opcją do wypełniania ubytków kostnych, ale wiążą się one z kilkoma wadami, w tym ryzykiem infekcji, awarią sprzętu i reakcją na ciało obce4.
Z tych powodów istnieje duże zainteresowanie możliwością inżynierii biologicznych substytutów kości przy użyciu własnych komórek pacjenta5. Komórki zrębowe pochodzenia tłuszczowego (ASC) mają potencjał do tego zastosowania, ponieważ są obficie dostępne we własnej tkance tłuszczowej pacjenta i wykazały zdolność do leczenia ubytków kostnych poprzez generowanie nowej tkanki kostnej6,7. ASC to zróżnicowana populacja komórek, a kilka badań wykazało, że selekcja pod kątem określonych markerów powierzchni komórek może wytworzyć populacje komórek o zwiększonej aktywności osteogennej8,9. Wybór ASC o najwyższym potencjale osteogennym zwiększyłby prawdopodobieństwo, że rusztowanie wysiane tymi komórkami może zregenerować duży ubytek kostny.
Sygnalizacja białka morfogenetycznego kości (BMP) jest kluczowa dla regulacji różnicowania i tworzenia kości10 i wiadomo, że receptor BMP typu IB (BMPR-IB) jest ważny dla osteogenezy w ASCs11. Ostatnio wykazaliśmy, że ekspresja BMPR-IB może być wykorzystana do selekcji ASC o zwiększonej aktywności osteogennej12. Tutaj demonstrujemy protokół izolacji ASC z ekspresją BMPR-IB z ludzkiego tłuszczu, a następnie test ich aktywności osteogennej przy użyciu modelu ubytku kalwarialnego in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sitko do komórek 100 mikronów</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel z 15 ostrzami</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 mikronów</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon nylon, 18", igła P-3,&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-BMPR-IB</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne BioGel PI</td><td>M&ouml; lnlycke Opieka zdrowotna</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo sterownik igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 naga mysz</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II w proszku</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło: Nóż tarczowy 4,0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło: Z500 Bezszczotkowy mikrosilnik</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki chłonne Fisherbrand, 20" x 24"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylny bawełniany gazik, 4" x 4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS medium</td><td>GE&nbsp; Nauki biologiczne</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isofluran</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>Mikro kleszcze z zębami</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kleszcze z zębami</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Folia parafinowa (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rusztowania PLGA</td><td>Zastrzeżona formuła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, 10%</td><td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Polylined Sterylne pole, 18" x 24"</td> <td>Busse Hospital Jednorazówki</td><td>696</td><td>Wytnij prostokątny otwór o odpowiednim rozmiarze</td></tr><tr><td>Roztwór polisacharozy: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przygotowania jodu powidonu</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Puralube petrolatum, tubka 1/8 uncji</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Waciki nasączone alkoholem Webcol</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej bmpr-ib+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Inwazyjne nowotwory, poważne urazy i infekcje mogą powodować ubytki kostne, które są zbyt duże, aby można je było zrekonstruować z wcześniej istniejącej kości z własnego ciała pacjenta. Zdolność do wzrostu kości de novo przy użyciu własnych komórek pacjenta pozwoliłaby na wypełnienie ubytków kostnych odpowiednią tkanką bez chorobliwości związanej z pobieraniem rodzimej kości. Istnieje zainteresowanie wykorzystaniem komórek zrębu pochodzącego z tkanki tłuszczowej (ASC) jako źródła inżynierii tkankowej, ponieważ są one pozyskiwane z obfitego źródła: własnej tkanki tłuszczowej pacjenta. Jednak ASC są populacją niejednorodną, a niektóre subpopulacje mogą być bardziej skuteczne w tym zastosowaniu niż inne. Izolacja najbardziej osteogennej populacji ASC może poprawić wydajność i skuteczność procesu inżynierii kostnej. W tym protokole ASC są pozyskiwane z podskórnej tkanki tłuszczowej od ludzkiego dawcy. Subpopulację ASC wyrażających marker BMPR-IB izoluje się za pomocą FACS. Komórki te są następnie poddawane testowi gojenia defektów kalwarycznych in vivo i okazuje się, że mają lepszy osteogenny potencjał regeneracyjny w porównaniu z komórkami niesortowanymi.

Skan micro-CT wykonany w dniu operacji wyraźnie pokaże ubytek w czaszce. Na tym etapie nie będzie widocznego wrastania tkanki w obszar ubytku o rozmiarze 4 mm. Kolejne skany są wykonywane w odstępach czasowych, aby określić wielkość ubytku w czasie w porównaniu z wartością wyjściową. Ubytki zasiane komórkami BMPR-IB+ powinny wykazywać szybsze zamknięcie w porównaniu z komórkami BMPR-IB- oraz niesortowanymi (Rycina 5). Ponadto fragment czaszki zawierający ubytek można odwa...

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest izolacja specyficznych populacji komórek stromalnych pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz zbadanie ich aktywności osteogennej za pomocą testu in vivo. Metoda ta może posłużyć do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracyjnej obszaru twarzoczaszki, takie jak sposób wykorzystania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do tworzenia w pełni funkcjonalnej tkanki kostnej w uszkodzonych ubytkach kostnych. Główną zaletą tej techniki jest szybka izolacja komórek ze świeżej tkanki ludzkiej, dzięki czemu komórki nie spędzają czasu w hodowli komórkowej, o której wiadomo, że zmienia ona ekspresję genów i markerów powierzchniowych komórek.Zastosowania tej techniki obejmują pacjentów z rozległymi ubytkami kostnymi spowodowanymi nowotworami, urazami lub infekcjami. W przyszłości możliwe może być wyizolowanie populacji komórek ASC i wykorzystanie ich w celach regeneracyjnych. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ nauka tworzenia ubytku w sklepieniu czaszki jest trudna, głównie ze względu na kopulistą strukturę czaszki oraz bliskość opony twardej.Do niniejszego protokołu należy przyg

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Poznaj metodę izolacji komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków kostnych czaszki. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie komórek o wysokim potencjale osteogennym bez konieczności długotrwałej hodowli in vitro.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Przeglądaj więcej filmów