Name: Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj analizę całego genomu mikroRNA i mRNA w komórkach B myszy C57BL6J pod wpływem inhibitora HDAC. Ta metoda pozwala badać epigenetyczną regulację przełączania klasy przeciwciał i różnicowania komórek plazmatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH granty AI 105813 i AI 079705 (na PC), Alliance for Lupus Research Target Identification in Lupus Grant ALR 295955 (na PC) oraz na granty badawcze Arthritis National Research Foundation (na HZ). TS był wspierany przez Pediatrics Medical Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Chiny, w ramach programu wizyt studentów medycyny Xiangya-UT School of Medicine w San Antonio.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.
1. Stymulacja mysich komórek B do CSR, różnicowania komórek plazmatycznych i leczenia HDI
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesin komórek śledziony 
	UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w okapie z przepływem laminarnym z wyjątkiem eutanazji i sekcji myszy.
	<ol>
		<li>Poddać eutanazji specyficzną, wolną od patogenów mysz C57BL/6J (w wieku 8-12 tygodni) przez wdychanie CO2 .</li>
		<li>Połóż mysz na desce sekcyjnej z brzuchem skierowanym do góry. Przypnij wszystkie cztery stopy myszy za pomocą 1,5-calowych igieł podskórnych o rozmiarze 18 mm.</li>
		<li>Wysterylizuj skórę za pomocą chusteczek nasączonych etanolem w 70%.</li>
		<li>Użyj jednego zestawu autoklawowanych narzędzi chirurgicznych (kleszcze i nożyczki preparacyjne), aby przeciąć skórę tuż pod klatką piersiową, aby uwidocznić śledzionę (po lewej stronie brzucha, tuż pod wątrobą).</li>
		<li>Użyj innych sterylnych kleszczy i nożyczek, aby usunąć śledzionę, która leży pod większą krzywizną żołądka, delikatnie zaciskając śledzionę kleszczami i odcinając całą tkankę łączącą nożyczkami do preparowania. Upewnij się, że usunąłeś całą tkankę łączącą.</li>
		<li>Umieść śledzionę w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej zawierającej 1,000 μl kompletnej pożywki RPMI1640 (pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 50 μM β-merkaptoetanolu).</li>
		<li>Umieść sitko o średnicy 70 μm w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml i wlej śledzionę z probówki do mikrowirówek na sitko do komórek. Użyj końcówki stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 15 ml, aby delikatnie przetrzeć śledzionę przez sitko. Przepłukać sitko komórkowe 15 do 20 ml kompletnego podłoża.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 350 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Usunąć czerwone krwinki z zawiesiny komórek śledziony. Zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy ACK (5 ml na śledzionę). Inkubować przez 4 minuty w temperaturze pokojowej z okazjonalnym wstrząsaniem, a następnie schłodzić 25 ml kompletnej pożywki.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 350 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 lub 10 ml kompletnego podłoża. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek B<br />
	UWAGA: Wyizoluj komórki B przez selekcję negatywną zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki inne niż B są przeznaczone do usunięcia za pomocą biotynylowanych przeciwciał skierowanych przeciwko komórkom innym niż B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) i TER119) oraz cząstkom magnetycznym pokrytym streptawidyną.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę komórek o objętości od 0,25 do 2 ml 1 x 108 komórek/ml w kompletnym podłożu w sterylnej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml (12 x 75 mm) z polistyrenu. Dodać normalną surowicę szczura (50 μl/ml) do próbki.</li>
		<li>Dodać 50 μl/ml koktajlu izolacyjnego do próbki. Wymieszaj komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać do próbki 75 μl/ml cząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Wymieszaj mieszaninę, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy i inkubuj przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj kompletną pożywkę RPMI 1640. Wymieszaj komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.</li>
		<li>Umieścić probówkę (bez pokrywki) w magnesie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2,5 minuty. Odlać supernatant zawierający nietknięte limfocyty B do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Oceń czystość limfocytów B za pomocą analizy cytometrii przepływowej markerów powierzchniowych komórek B, takich jak B220 i CD19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja komórek B i leczenie HDI
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić oczyszczone limfocyty B w kompletnym podłożu RPMI 1640 w końcowym stężeniu 0,3 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Do hodowli komórkowej należy użyć 48-dołkowej płytki do hodowli komórek. Do każdej studzienki dodać 1 ml oczyszczonej zawiesiny komórek B (0,3 x 106 komórek/ml), LPS (3 μg/ml stężenie końcowe) z Escherichia coli, IL-4 (5 ng/ml stężenie końcowe) i 0 lub 500 μM HDI (kwas walproinowy; Dobrowolna umowa o partnerstwie).</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 60 godzin w przypadku qRT-PCR i wysokoprzepustowej analizy sekwencjonowania mRNA i miRNA lub 96 godzin w przypadku analizy cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza CSR i różnicowania komórek plazmatycznych za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Po 96 godzinach hodowli odłącz komórki od każdej studzienki, odpipetowując komórki w górę i w dół kilka razy. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować komórki o masie 350 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki 100 μl buforu HBSS zawierającego 1% BSA i 0,5 ng/ml fluoresceiny (FITC) sprzężonego z kozią przeciwciałem anty-mysim IgM (Ab), 0,2 ng/ml allofikocyjaniny (APC) sprzężonego ze szczurami przeciwciała monoklonalnego IgG1 (mAb), 0,2 ng/ml bakioryny (PE) sprzężonego ze szczurzą przeciwciała przeciw-mysiego B220 mAb, 0,2 ng/ml skoniugowanego z PE-Cy7 szczurzego anty-mysiego CD138 mAb, i 2 ng/ml 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją (etap 1.4.2) w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Umyj komórki 1 ml HBSS z 1% BSA.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 300 μl HBSS z 1% BSA i przenieść zawiesinę komórek do rurki z polistyrenu o okrągłym dnie. Przykryj tubę folią, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
		<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej na zawiesinie jednokomórkowej. Zbierz 50 000 zdarzeń dla każdej próbki wynagrodzeń i 250 000 zdarzeń dla pozostałych próbek. Analizuj dane za pomocą oprogramowania sprzętowego.</li>
		<li>Wyeliminuj zanieczyszczenia i dublety za pomocą bramki o geometrii impulsów (FSC-H x FSC-A i SSC-H x SSC-A). Odpowiednio bramkuje wykres na 7-AAD, aby wykluczyć martwe komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowy sekwencja mRNA
<ol>
	<li>Po 60 godzinach hodowli wyekstrahuj całkowite RNA z 2 - 4 × 106 komórek za pomocą zestawu do izolacji całkowitego RNA, który może odzyskać małe RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Uwzględnij etap leczenia DNazą I.</li>
	<li>Sprawdź integralność RNA za pomocą bioanalizatora, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj 500-1,000 ng wysokiej jakości całkowitego RNA (liczba integralności RNA > 8.0) do przygotowania biblioteki sekwencyjnej RNA za pomocą komercyjnego zestawu do przygotowywania próbek RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Połącz poszczególne biblioteki sekwencyjne mRNA na podstawie odpowiednich części adapterów o indeksie 6 pz i zsekwencjonuj biblioteki z prędkością 50 pz/sekwencję. Używaj wysokoprzepustowego systemu DNA zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Po przebiegu sekwencjonowania należy przeprowadzić demultipleks za pomocą CASAVA, aby wygenerować plik fastq dla każdej próbki. Wykonuj mapowanie odczytów i analizę bioinformatyczną, jak wcześniej opisano11.</li>
	<li>Dopasuj wszystkie odczyty sekwencjonowania do ich genomów referencyjnych (UCSC mysi genom zbudowany mm9) przy użyciu domyślnych ustawień TopHat214. Przetwarzaj pliki bam od wyrównania za pomocą HTSeq-count, aby uzyskać liczbę na gen we wszystkich próbkach.</li>
</ol>
3. Wysokoprzepustowy miRNA-Seq
<ol>
	<li>Użyj 100 ng-1 μg wysokiej jakości całkowitego RNA, jak przygotowano w kroku 2.1, do przygotowania małej biblioteki sekwencyjnej RNA przy użyciu komercyjnego zestawu do sekwencjonowania małych RNA.</li>
	<li>Zwiąż zdegenerowany adapter 3' na końcach 5' początkowych małych cząsteczek RNA za pomocą komercyjnego zestawu do ligacji. Zwiąż zdegenerowany adapter 5' na końcach 3' początkowych małych cząsteczek RNA za pomocą komercyjnego zestawu do ligacji. Przekształć RNA w cDNA przez odwrotną transkrypcję i amplifikuj małą bibliotekę sekwencjonowania RNA przez amplifikację PCR za pomocą komercyjnych zestawów.</li>
	<li>Użyj 6% natywnego żelu PAGE TBE, aby wyizolować końcową małą bibliotekę sekwencyjną RNA. Uruchom żel z buforem 1X TBE pod napięciem 200 V, aż pasmo barwnika śledzącego błękit bromofenolowy zbliży się do dna żelu (0,5 - 1 cm).</li>
	<li>Usuń żel ze szklanych płytek i zabarwij bromkiem etydyny (0,5 μg/ml w wodzie) w czystym pojemniku na 2-3 minuty. Zwizualizuj opaski żelowe na transiluminatorze UV lub innym przyrządzie do dokumentacji żelu.</li>
	<li>Wytnij pasmo ~150 pz za pomocą czystej maszynki do golenia i umieść je w probówce o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Sprawdź rozkład wielkości końcowej biblioteki za pomocą komercyjnego testu DNA o wysokiej czułości oraz stężenie za pomocą komercyjnego testu dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Połącz biblioteki w celu amplifikacji, a następnie sekwencjonowania z komercyjnym systemem sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Demultipleks za pomocą CASAVA w celu wygenerowania pliku fastq dla każdej próbki zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Do analizy małych sekwencji RNA każdej próbki należy użyć funkcji Flicker do wyrównania małego RNA zgodnie z protokołami producenta.
	<ol>
		<li>Usuń odczyty, które są wyrównane do zanieczyszczeń, takich jak mitochondria, rRNA, startery i tak dalej.</li>
		<li>Dopasuj dane do dojrzałych sekwencji miRNA.</li>
		<li>Dopasuj dane do sekwencji pętli spinki do włosów (miRNA prekursora).</li>
		<li>Dopasuj dane do innych małych sekwencji RNA (korzystając z bazy danych fRNA)15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ilościowym określeniu wszystkich próbek zdefiniuj różnicę ekspresji miRNA między różnymi grupami/próbkami. Przewiduj miRNA, które celują w wybrane mRNA lub mRNA, które mogą być celem selektywnego miRNA, korzystając z narzędzi do przewidywania celów miRNA online, takich jak TargetScan16, MicroCosm17 i PicTar18.</li>
	<li>Jeśli potrzebna jest adnotacja funkcjonalna lub analiza szlaku, prześlij przewidywane geny do analizy Ingenuity Pathway (IPA) lub DAVID.</li>
</ol>
4. Ilościowy RT-PCR (qRT-PCR) mRNA i miRNA
<ol>
	<li>Analiza qRT-PCR mRNA
	<ol>
		<li>Wyodrębnij RNA z komórek 0,2-5 × 106 za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji całkowitego RNA, który może odzyskać małe RNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Uwzględnij etap leczenia DNazą I.</li>
		<li>Zsyntetyzuj cDNA z całkowitego RNA za pomocą systemu syntezy pierwszej nici cDNA przy użyciu startera oligo-dT.</li>
		<li>Określ ilościowo cDNA metodą qRT-PCR z odpowiednimi starterami, używając 2x głównej mieszanki PCR w czasie rzeczywistym z następującym protokołem: 95 °C przez 15 s, 40 cykli po 94 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s.</li>
		<li>Przeprowadzić akwizycję danych podczas etapu rozszerzania o 72 °C i przeprowadzić analizę krzywej topnienia w zakresie od 72 °C do 95 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza qRT-PCR miRNA
	<ol>
		<li>Podwielokrotność RNA z próbek przygotowanych w kroku 4.1.1.</li>
		<li>Odwrotna transkrypcja RNA na cDNA. Użyj komercyjnego zestawu do odwrotnej transkrypcji mikroRNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym dla mikroRNA przy użyciu głównej mieszanki SYBR Green real-time PCR z dojrzałymi starterami miRNA o długości 250 nM w połączeniu z uniwersalnym starterem odwrotnym.
		<ol>
			<li>Rozmrozić 2x PCR Master Mix, specyficzny dla miRNA starter do przodu i uniwersalny starter odwrotny w temperaturze pokojowej. Wymieszaj poszczególne roztwory.</li>
			<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób dla objętości reakcyjnej 25 μl na basenik (stosowaną w 96-dołkowych płytkach PCR): 
			2x PCR Master Mix 12,5 μL 
			startery do przodu miRNA (2,5 μM) 2,5 μL 
			Uniwersalny podkład odwrotny (2,5 μM) 2,5 μL 
			Woda wolna od RNaz5 μL</li>
			<li>Dodać 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej do 96-dołkowej płytki PCR. Dodać 2,5 μl matrycowego cDNA (50 pg-3 ng) do poszczególnych dołków płytkowych.</li>
			<li>Szczelnie uszczelnij folię płyty. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 000 x g i temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Umieść płytkę w cyklerze czasu rzeczywistego i uruchom następujący program cykliczny: 95 °C przez 5 minut, 40 cykli po 94 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Metodę ΔΔCt należy stosować do analizy danych qRT-PCR za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Znormalizuj ekspresję odpowiednich miRNA do ekspresji małych jądrowych/jąderkowych RNA Rnu6 / RNU61 / 2, Snord61 / SNORD61, Snord68 / SNORD68 i Snord70 / SNORD70.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę statystyczną, aby określić wartości p za pomocą sparowanego i niesparowanego testu t-Studenta za pomocą arkusza kalkulacyjnego i rozważ wartości p <0,05 jako znaczące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643790">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li>
<li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631(2015).</li>
<li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination%3A+induction%2C+targeting+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li>
<li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627(2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fRNAdb%3A+a+platform+for+mining%2Fannotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten zapewnia kompleksowe podejścia do indukowania przełączania klas komórek B i różnicowania komórek plazmatycznych; analiza ich wpływu za pomocą modulatorów epigenetycznych, a mianowicie HDI; oraz do wykrycia wpływu HDI na ekspresję mRNA i miRNA w tych komórkach. Większość z tych podejść można również wykorzystać do analizy wpływu czynnika epigenetycznego na funkcję ludzkich komórek B i ekspresję mRNA/miRNA. Podejścia qRT-PCR i mRNA-seq/miRNA-seq mogą być również wykorzystywane do analizy limfocytów B wyizolowa...

Cechy lub czynniki epigenetyczne, takie jak metylacja DNA, potranslacyjne modyfikacje histonów i niekodujące RNA (w tym mikroRNA), modulują funkcję komórki poprzez zmianę ekspresji genów1. Modyfikacje epigenetyczne regulują funkcję limfocytów B, takie jak rekombinacja DNA z zamianą klasy immunoglobuliny (CSR), hipermutacja somatyczna (SHM) i różnicowanie do komórek B pamięci lub komórek plazmatycznych, modulując w ten sposób odpowiedzi przeciwciał i autoprzeciwciał2,3. CSR i SHM krytycznie wymagają indukowanej aktywacją deaminazy cytydynowej (AID, kodowanej jako Aicda), która jest silnie indukowana w komórkach B w odpowiedzi na antygeny zależne i niezależne od T4. Limfocyty B z przełączaną klasą/hipermutacją dalej różnicują się w komórki plazmatyczne, które wydzielają duże ilości przeciwciał w sposób krytycznie zależny od białka dojrzewania indukowanego limfocytami B 1 (Blimp1, kodowane jako Prdm1)5. Nieprawidłowe zmiany epigenetyczne w komórkach B mogą powodować nieprawidłowe odpowiedzi przeciwciała/autoprzeciwciała, co może prowadzić do odpowiedzi alergicznej lub autoimmunizacji1,4. Zrozumienie, w jaki sposób czynniki epigenetyczne, takie jak miRNA, modulują ekspresję genów wbudowanych w limfocyty B, jest nie tylko ważne dla opracowania szczepionki, ale jest również niezbędne do ujawnienia mechanizmów potencjalnych nieprawidłowych odpowiedzi przeciwciał/autoprzeciwciał.
Acetylacja i deacetylacja histonów są modyfikacjami reszt lizyny na białkach histonowych, zazwyczaj katalizowanymi przez acetylotransferazę histonową (HAT) i deacetylazę histonów (HDAC). Modyfikacje te prowadzą do zwiększenia lub zmniejszenia dostępności chromatyny i dodatkowo umożliwiają lub uniemożliwiają wiązanie czynników transkrypcyjnych lub białek z DNA oraz zmianę ekspresji genów5,6,7,8. Inhibitory HDAC (HDI) to klasa związków, które zakłócają funkcję HDAC. W tym przypadku użyliśmy HDI (VPA), aby zająć się regulacją HDAC na wewnętrzny profil ekspresji genów komórek B i na jego mechanizm.
miRNA to małe, niekodujące RNA o długości około 18 do 22 nukleotydów, które są generowane przez kilka etapów. Geny gospodarza miRNA są transkrybowane i tworzą pierwotne mikroRNA (pri-miRNA). Są one eksportowane do cytoplazmy, gdzie pri-miRNA są dalej przetwarzane na prekursorowe miRNA (pre-miRNA). Wreszcie, dojrzałe miRNA powstają w wyniku rozszczepienia pre-miRNA. miRNA rozpoznają komplementarne sekwencje w nieulegającym translacji regionie 3' docelowych mRNAs6,7. Poprzez wyciszenie potranskrypcyjne miRNA regulują aktywność komórkową, taką jak proliferacja, różnicowanie i apoptoza10,11. Ponieważ wiele miRNA może celować w to samo mRNA, a jeden pojedynczy miRNA może potencjalnie celować w wiele mRNA, ważne jest, aby mieć kontekstowy wgląd w profil ekspresji miRNA, aby zrozumieć wartość indywidualnego i zbiorowego efektu miRNA. Wykazano, że miRNA są zaangażowane w rozwój komórek B i różnicowanie obwodowe, a także różnicowanie specyficzne dla etapu komórek B, odpowiedź przeciwciał i autoimmunizację1,4,9. W 3' UTR Aicda i Prdm1 istnieje kilka zweryfikowanych lub przewidywanych ewolucyjnie konserwatywnych miejsc, które mogą być celem miRNAs8.
Modulacja epigenetyczna, w tym modyfikacja histonów po transkrypcji i miRNA, wyświetlają specyficzny dla komórki i stadium komórki wzorzec regulacji ekspresji genów9. W tym miejscu opisujemy metody definiowania modulacji ekspresji miRNA i mRNA, CSR i różnicowania komórek plazmatycznych za pośrednictwem HDI. Należą do nich protokoły indukowania komórek B do przechodzenia CSR i różnicowania komórek plazmatycznych; do leczenia limfocytów B HDI; oraz do analizy ekspresji miRNA i mRNA za pomocą qRT-PCR, miRNA-seq i mRNA-seq10,11,12,8,13.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X z L-Glutaminą (Rozmiar: 6 x 500mL; Z L-glutaminą)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy 100 ml</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>21008-952&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa 0,04%</td><td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Hausser Scientific Bright-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr> Technologie magnetycznych <tr><td>komórek macierzystych</td><td>EasySep</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe rurki polistyrenowe Falcon z nasadką</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek B myszy EasySep</td><td>Stem Cell Tech</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>Tylko igła BD 18 Gauge 1,5 cala KRÓTKI SKOS 100 / pudełko&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne</td><td>&nbsp; </td><td></td>305199</tr><tr><td>PE/Cy7 Przeciwciało anty-mysie CD138 (Syndecan-1)</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PE-Cy7 B220</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciwciało przeciw myszy/ludzkiemu CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC-IgG1 200 i mikro; g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom</td><td>IgM Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, Leczenie szoku cieplnego&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (lipopolisacharydy z Escherichia coli 055:B5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-4 (bez nośnika)</td><td>BioLegend</td><td>574302 (rozmiar: 10 ug)</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu walproinowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Klasa II Typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 o dużej pojemności&nbsp;</td><td>Kąpiele wodne Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp ze sterowaniem cyfrowym: Model 205</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL probówka z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Corning CentriStar 15 ml&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,7 ml, przezroczysta</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>Szybkobieżne plastikowe probówki wirówkowe Easy Reader 50ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M.06</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Przenośny Kontroler pipet Pipet-Aid XP</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serologicznych końcówek do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologicznych końcówek do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologicznych końcówek do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowych płytek</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Allegra 6, bez chłodzenia</td><td>Redlica Beckman</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>Rotor GH-3.8A, pozioma, ARIES Smart Balance</td><td>Redlica Beckman</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Allegra 25R,</td><td>redlica Beckman z</td> chłodzeniem <td>369434</td><td></td></tr><tr><td>Rotor TA-15-1,5, redlica Beckman o stałym kącie nachylenia</td><td></td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analogowy mikser wirowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MiniPrep Direct-zol RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (ok. 0,75% etanolu jako konserwant/biologia molekularna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dnaz bez rnazy (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometry</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III System syntezy pierwszej nici RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR z półspódniczką Fisherbrand, opakowanie 25 sztuk</td><td>Fisher</td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki samoprzylepne Microseal "B"</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Moduł optyczny MyiQ</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa iCycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw optyczny</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>Analizator cytometrii przepływowej BD LSR II</td> BD <td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 Skoncentrowany ultrasonograf</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>SPRIworks System bibliotek fragmentów I dla Illumina</td><td>Beckman Coulter</td><td>A288267</td><td></td></tr><tr><td>Stacja generowania klastrów cBot</td><td>illumina</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sekwencer genomu</td><td>Illumina</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Zestaw do przygotowania biblioteki RNA v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Mały zestaw do przygotowania biblioteki RNA</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Mały Zestaw do sekwencjonowania RNA v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza całego genomu modulacji mikrorna i mrna za pośrednictwem inhibitora hdac w komórkach b indukowanych do rekombinacji dna ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Odpowiedzi przeciwciał są realizowane poprzez kilka krytycznych procesów wewnętrznych komórek B, w tym hipermutację somatyczną (SHM), rekombinację DNA z zamianą klasy (CSR) i różnicowanie komórek plazmatycznych. W ostatnich latach wykazano, że modyfikacje lub czynniki epigenetyczne, takie jak deacetylacja histonów i mikroRNA (miRNA), wchodzą w interakcje z programami genetycznymi komórek B w celu kształtowania odpowiedzi przeciwciał, podczas gdy stwierdzono, że dysfunkcja czynników epigenetycznych prowadzi do odpowiedzi autoprzeciwciał. Analiza ekspresji miRNA i mRNA w całym genomie w komórkach B w odpowiedzi na modulatory epigenetyczne jest ważna dla zrozumienia epigenetycznej regulacji funkcji komórek B i odpowiedzi przeciwciał. Tutaj demonstrujemy protokół indukowania komórek B do przejścia CSR i różnicowania komórek plazmatycznych, traktowania tych komórek B inhibitorami deacetylazy histonowej (HDAC) (HDI) oraz analizy ekspresji mRNA i mikroRNA. W tym protokole bezpośrednio analizujemy komplementarne sekwencje DNA (cDNA) przy użyciu technologii sekwencjonowania mRNA nowej generacji (mRNA-seq) i miRNA-seq, mapowania odczytów sekwencjonowania do genomu oraz ilościowej odwrotnej transkrypcji (qRT)-PCR. Dzięki tym podejściom ustaliliśmy, że w komórkach B indukowanych do przechodzenia CSR i różnicowania komórek plazmatycznych HDI, regulator epigenetyczny, selektywnie moduluje ekspresję miRNA i mRNA oraz zmienia CSR i różnicowanie komórek plazmatycznych.

Stosując nasz protokół, oczyszczone limfocyty B inkubowane z LPS (3 µg/mL) i IL-4 (5 ng/mL) przez 96 h mogą indukować 30-40% CSR do IgG1 oraz ~10% różnicowania w komórki plazmatyczne. Po zastosowaniu HDI (500µM VPA) odsetek CSR do IgG1 spadł do 10-20%, natomiast różnicowanie w komórki plazmatyczne spadło do ~2% (Rycina 1). Hamowanie CSR za pośrednictwem HDI zostało dodatkowo potwierdzone przez zmniejszenie liczby transkryptów Iμ-Cγ1 po rekombinacji oraz dojrzałych transkr...

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest indukcja przełączania klas przeciwciał i różnicowania w komórki plazmatyczne w limfocytach B oraz analiza modulacji, a także regulacji epigenetycznej poprzez ekspresję mRNA inhibitora HDAC i mikroRNA w komórkach B. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odpowiedzi przeciwciał komórek B, takich jak epigenetyczna modulacja przełączania klas immunoglobulin oraz różnicowania w komórki plazmatyczne. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej metody modulowania funkcji komórek B oraz określenia zmian w mikroRNA i mRNA wywołanych przez regulatory epigenetyczne.Po uśpieniu myszy C57BL6J wolnej od określonych patogenów i wysterylizowaniu skóry zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć autoklawowanych pęset i nożyczek sekcyjnych, aby rozciąć skórę tuż poniżej klatki piersiowej w celu uwidocznienia śledziony po lewej stronie jamy brzusznej, bezpośrednio pod wątrobą. Należy delikatnie zacisnąć śledzionę i odciąć całą tkankę łączną przed wyjęciem organu. Następnie śledzionę należy umieścić w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 1 000 mikrolitrów kompletnego medium RPMI 1640.Następnie należy włożyć sitko do komórek o rozmiarze oczek 70 µm do 50 ml polipropilenowej stożkowej probówki wirówkowej i przelać śledzionę z probówki do mikrowirówki na sitko. Za pomocą końcówki 15 ml polipropilenowej stożkowej probówki wirówkowej należy delikatnie rozetrzeć śledzionę przez sitko. Następnie należy wypłukać sitko, używając 15–20 ml pożywki kompletnej.Odwirować komórki przy 350 x G przez pięć minut. Odlać nadsącz. Użyć jednego mililitra buforu lizującego ACK do ponownego zawieszenia osadu komórkowego i inkubować przez jedną minutę.Następnie dodać 4 ml ACK i inkubować zawiesinę przez kolejne cztery minuty w temperaturze pokojowej, okazjonalnie wstrząsając, aby usunąć erytrocyty z zawiesiny śledziony. Następnie dodać 25 ml pełnej pożywki, aby zatrzymać reakcję lizy. Wirować komórki przy 350 x G przez pięć minut.Odlej nadsącz i dodaj 1 ml kompletnej pożywki, aby zawiesić osad komórkowy. Następnie, używając hemocytometru, policz żywe komórki. W sterylnej polistyrenowej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml przygotuj od 0,25 do 2 ml zawiesiny komórkowej o stężeniu 1 x 10⁸ komórek/ml w kompletnej pożywce.Do próbki dodać normalne surowicę szczura. Następnie do probówki dodać 50 µL na 1 mL koktajlu izolacyjnego. Po czym wymieszać komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy, i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Do probówki dodać 75 µL na mililitr magnetycznych cząsteczek powlekanych streptawidyną. Delikatnie pipetować w górę i w dół dwa lub trzy razy, a następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez dwie i pół minuty. Uzupełnić objętość do 2,5 mL za pomocą kompletnego medium RPMI 1640 i delikatnie pipetować dwa lub trzy razy w celu wymieszania.Umieść otwartą probówkę w magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie i pół minuty. Następnie przelej nadsącz zawierający nieprzypisane limfocyty B do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Użyj błękitu trypanu oraz hemocytometru, aby policzyć komórki.Oczyszczone limfocyty B zawiesić ponownie w pełnej pożywce RPMI 1640 do końcowego stężenia 0,3 x 10⁶ komórek/ml. Następnie do dołków płytki 48-dołkowej dodać 1 ml oczyszczonych limfocytów B w stężeniu 0,3 x 10⁶ komórek/ml, 3 µg/ml LPS z E. coli, 5 ng/ml IL4 oraz 0 lub 500 µM HDI. Komórki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 60 godzin w przypadku analizy qRT-PCR oraz wysokoprzepustowego sekwencjonowania mRNA i miRNA lub przez 96 godzin w przypadku analizy cytometrycznej.Po 96 godzinach hodowli odklej komórki z każdej dołki, pipetując je kilkakrotnie w górę i w dół. Przenieś zawiesinę komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Następnie, używając wirówki laboratoryjnej, odwiruj komórki przy 350 x G przez pięć minut.Następnie odlej supernatant. Przygotuj koktajl składający się z buforu HBSS oraz następujących odczynników: 1% BSA, 0,5 ng/ml koniugowanego przeciwciała koziego anty-mysiego przeciwko IgM, 0,2 ng/ml koniugowanego monoklonalnego przeciwciała szczurzego anty-mysiego przeciwko IgG1, 0,2 ng/ml koniugowanego monoklonalnego przeciwciała szczurzego anty-mysiego przeciwko B220, 0,2 ng/ml koniugowanego z PE-Cy7 monoklonalnego przeciwciała szczurzego anty-mysiego przeciwko CD138 oraz 2 ng/ml 7-AAD. Inkubuj komórki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie użyj 1 ml HBSS z 1% BSA, aby wypłukać komórki. Użyj wirówki laboratoryjnej, aby odwirować komórki przy 1,500 x G przez pięć minut. Po odlaniu nadsączu użyj 300 µl HBSS z 1% BSA, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do polistyrenowej probówki z okrągłym dnem.Przykryj probówkę folią, aby uniknąć ekspozycji na światło. W celu przeprowadzenia analizy QRT PCR mRNA, uwzględnij etap traktowania DNAse 1. Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, użyj komercyjnego zestawu do izolacji całkowitego RNA, który umożliwia odzysk małych RNA, aby wyekstrahować RNA z 0,2 do 5 x 10⁶ komórek.Po syntezie cDNA i przeprowadzeniu QRT PCR dla mRNA, wykonaj RT PCR dla microRNA, wykorzystując master mix do PCR w czasie rzeczywistym z barwnikiem cyber green; rozmroź w temperaturze pokojowej 2x PCR master mix, 250 nM miRNA swoisty starter forward oraz uniwersalny starter reverse. Po przygotowaniu 25 µL mieszaniny reakcyjnej zgodnie z protokołem tekstowym, nanieś do płytki PCR 96-dołkowej alikwoty po 22,5 µL na dołek. Następnie do poszczególnych dołków dodaj 2,5 µL matrycowego cDNA.Szczelnie zamknąć folię na płytce. Następnie wirować płytkę z prędkością 1 000 x G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Umieścić płytkę w termocyklerze do PCR w czasie rzeczywistym i uruchomić program cykliczny opisany w protokole tekstowym.Stosując protokół przedstawiony w tym filmie, oczyszczone limfocyty B inkubowane bez PS NIL4 przez 96 godzin mogą indukować od 30 do 40% CSR do IgG1 oraz około 10% różnicowania w komórki plazmatyczne. Po zastosowaniu HDI poziom CSR do IgG1 spadł do 10–20%, natomiast różnicowanie w komórki plazmatyczne zmniejszyło się do około 2%. Inhibicja CSR zapośredniczona przez HDI została dodatkowo potwierdzona poprzez zmniejszenie liczby transkryptów po rekombinacji I mu C gamma 1 oraz dojrzałych VHDJHC gamma 1. Pomiary wykonane za pomocą QRT PCR wykazały, że ekspresja Aicda, kluczowego dla CSR i SHM, oraz Prdm1 i Xbp1, ważnych dla różnicowania w komórki plazmatyczne, została zahamowana przez VPA.Jak wykazano w sekwencjonowaniu mRNA limfocytów B stymulowanych bez udziału PS Nil4, tylko 0,3% tych silnie ekspresyjnych mRNA uległo nadekspresji pod wpływem HDI ponad dwukrotnie, a jedynie 0,36% silnie ekspresyjnych mRNA, w tym Aicda, Prdm1 i Xbp1, uległo redukcji pod wpływem HDI o ponad 50%. Analiza sekwencjonowania miRNA w profilowaniu miRNA w limfocytach B traktowanych HDI lub Nil wykazała, że HDI selektywnie zwiększają ekspresję miRNA celujących w Aicda i Prdm1. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w czasie od czterech i pół do pięciu godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie sterylnych warunków pracy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować przełączanie klas przeciwciał i różnicowanie komórek plazmatycznych w limfocytach B oraz jak modulować te funkcje za pomocą regulatorów epigenetycznych.

genome-wide-analysis-hdac-inhibitor-mediated-modulation-micrornas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, raportujemy in vitro model różnicowania komórek B do komórek plazmatycznych.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Poznaj analizę całego genomu mikroRNA i mRNA w komórkach B myszy C57BL6J pod wpływem inhibitora HDAC. Ta metoda pozwala badać epigenetyczną regulację przełączania klasy przeciwciał i różnicowania komórek plazmatycznych.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Przeglądaj więcej filmów