Określenie czasu replikacji ssaków w całym genomie za pomocą pomiaru zawartości DNA

Ogólnym celem tej procedury jest zmapowanie programu czasu replikacji w całym genomie wybranej komórki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji, takie jak sposób, w jaki program replikacji genomowej zmienia się w stanie zdrowia i choroby.

Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona szybki i prosty sposób mapowania czasu replikacji w różnych komórkach i warunkach. Osobą opracowującą procedurę FAX był Dan Lehmann, ekspert w zakresie metody FAX z Wydziału Medycyny. Procedura ta zazwyczaj rozpoczyna się od co najmniej 1-2 × 10⁶ szybko rosnących komórek niesynchronizowanych.

W przypadku komórek adherentnych odessać i przemyć każdą płytkę trzema mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Odlać PBS i dodać jeden mililitr komercyjnej Trypsyny-EDTA do każdej płytki. Inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 °C, aż do ich odklejenia.

Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę, i zbierz komórki do 15-mililitrowej probówki stożkowej lub 5-mililitrowej probówki polistyrenowej. Przechowuj komórki w lodzie. Aby rozpocząć tę procedurę, odwiruj komórki z prędkością 300 x G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odssać i przemyć komórki 1 ml zimnego PBS. Następnie odwirować komórki. Po drugim przemyciu usunąć PBS i resuspendować komórki w 250 µl zimnego PBS.

Podczas delikatnego mieszania probówki na wirówce typu vortex, powoli dodawaj kroplami 800 µL 100% wysokiej czystości etanolu schłodzonego do -20 °C. Pozwala to uzyskać końcowe stężenie etanolu na poziomie od 70 do 80%. Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.

Procedurę należy rozpocząć od odwirowania utrwalonych komórek przy 500 x G przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS. Po każdym przemyciu należy przeprowadzić wirowanie.

Po drugim przemyciu odessaj supernatant i resuspenduj każdą komórkę w następującej mieszaninie PI: 1 mL PBS zawierającego 5 µL RNazy o stężeniu 10 mg/mL oraz 50 µL jodku propidyny o stężeniu 1 mg/mL. Przefiltruj próbkę przez sito o oczkach 35 µm do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL.

Uszczelnij probówkę parafilmem. Inkubuj w temperaturze pokojowej od 15 do 30 minut. Przechowuj próbki w ciemności, ponieważ jodek propidyny jest wrażliwy na światło.

Komórki zostaną posortowane za pomocą sortera FACS. Należy użyć lasera o długości fali 561 nanometrów, aby rozróżnić komórki na podstawie intensywności barwienia jodkiem propidyny. Dla uzyskania optymalnych wyników należy zastosować najmniejszą dyszę zalecaną dla konkretnego rozmiaru komórek.

Dla większości komórek wartość ta wynosi 85 micrometers. Należy stosować stały, powolny przepływ. Zazwyczaj do 300 do 500 zdarzeń na sekundę.

Stosując bramkowanie, oddziel martwe komórki i fragmenty subkomórkowe, nanosząc FCS względem SSC. Z żywych komórek oddziel dublety, nanosząc szerokość SSC względem wysokości SSC, a następnie szerokość FFC względem wysokości FFC oraz szerokość sygnału jodku propidyny względem jego wysokości. Dla żywych komórek sygnałowych sporządź histogram intensywności pola sygnału jodku propidyny, który reprezentuje zawartość DNA w komórkach.

Sortuj komórki w niskiej temperaturze na fazy G1 i S. Bramkowanie dla fazy S powinno być szerokie i nachodzić na fazy G1 oraz G2, podczas gdy bramkowanie dla fazy G1 powinno być wąskie i oddalone od fazy S tak bardzo, jak to możliwe.

W przypadku niektórych typów komórek uzyskanie prawidłowego rozkładu cyklu komórkowego może być trudne. Kluczowe jest wyizolowanie fazy G1 bez komórek w fazie S. Wyjmij probówki z posortowanymi komórkami z cytometru.

Po sortowaniu należy przechowywać probówki w lodzie. Po sortowaniu komórek DNA z każdej próbki jest oczyszczane za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie DNA należy poddać fragmentacji za pomocą skoncentrowanego sonikatora do średniego docelowego rozmiaru szczytu 250 par zasad.

Zweryfikuj wielkość pofragmentowanego DNA za pomocą elektroforezy. Zalecany rozkład wielkości wynosi od 200 do 700 par zasad z pikiem przy około 250 parach zasad. Następnie bibliotekę przygotowuje się, sekwencjonuje i analizuje zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono mapę czasu replikacji dla całego chromosomu 1 fibroblastów embrionalnych myszy. Poniżej znajduje się powiększenie regionu o wielkości około 50 megabaz. Kropki reprezentują znormalizowany stosunek fazy S do G1 dla poszczególnych okien, a linia ciągła przedstawia wyniki uzyskane dzięki interpolacji sześciennej.

Wysokie wartości S do G1 odpowiadają wczesnej replikacji, natomiast niskie wartości odpowiadają replikacji późnej. Czerwone strzałki wskazują przykłady obszarów o stałym czasie replikacji, a zielone strzałki wskazują obszary przejścia czasowego. Rysunek ten przedstawia powtarzalność map czasu replikacji pomiędzy powtórzeniami dla zarodkowych fibroblastów myszy, w porównaniu do powtórzeń dla prekursorów limfocytów B myszy w tym samym regionie o wielkości 18 megabaz na pierwszym chromosomie myszy.

Pomarańczowe strzałki wskazują przykłady regionów różnicujących między liniami komórkowymi. Mapa ciepła korelacji Spearmana między sześcioma próbkami dodatkowo potwierdza uzyskane wyniki. Po opanowaniu, technika ta – od pobrania komórek po wygenerowanie map – może zostać przeprowadzona w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób generować mapy genomiczne czasu replikacji dla rosnących komórek.