Określenie czasu replikacji ssaków w całym genomie za pomocą pomiaru zawartości DNA

Ogólnym celem tej procedury jest zmapowanie programu czasu replikacji w całym genomie wybranej komórki. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w polu replikacji. Na przykład, jak program replikacji genomu zmienia się w zdrowiu i chorobie.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i prosty sposób mapowania czasu replikacji w różnych komórkach i warunkach. Człowiekiem piszącym procedurę faksu miał być Dan Lehmann, ekspert ds. faksów na Wydziale Lekarskim. Ta procedura zwykle rozpoczyna się od co najmniej jednej do dwóch razy dziesięć do szóstej szybko rosnących niezsynchronizowanych komórek.

W przypadku przylegających komórek odessać i umyć każdą płytkę trzema mililitrami PBS bez wapnia lub magnezu. Wyrzuć PBS i dodaj jeden mililitr komercyjnej trypsyny-EDTA do każdej płytki. Inkubuj komórki przez pięć minut, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż się oderwą.

Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę i zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów lub pięciomililitrowej probówce polistyrenowej. Utrzymuj komórki na lodzie. Aby rozpocząć procedurę, odwiruj komórki w temperaturze 300 x G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać i umyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS. Następnie odwiruj komórki. Po drugim praniu wyjmij PBS i ponownie zawieś ogniwa w 250 mikrolitrach zimnego PBS.

Delikatnie wirując rurkę, powoli dodawaj kroplami 800 mikrolitrów etanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, 100 procent czystości. Prowadzi to do końcowego stężenia etanolu na poziomie od 70 do 80 procent. Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.

Rozpocznij tę procedurę od odwirowania stałych komórek w temperaturze 500 x G przez dziesięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ostrożnie odessać supernatant i przemyć komórki dwukrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Odkręć po każdym praniu.

Po drugim przemyciu odessać supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę następującą mieszaniną PI. Jeden mililitr PBS zawierający pięć mikrolitrów po dziesięć miligramów na mililitr RNAas i 50 mikrolitrów po jeden miligram na mililitr jodku propidyny. Przefiltruj próbkę przez siatkę o grubości 35 mikrometrów do 5-mililitrowej rurki polistyrenowej.

Uszczelnij rurkę parafilmem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. Próbki należy przechowywać w ciemności, ponieważ jodek propidyny jest wrażliwy na światło.

Komórki zostaną posortowane za pomocą faksu. Użyj lasera 561 n, aby zróżnicować komórki na podstawie intensywności ich jodku propidyny. Aby uzyskać optymalne rezultaty, użyj najmniejszej dyszy zalecanej dla określonego rozmiaru komórki.

W przypadku większości komórek jest to 85 mikrometrów. Używaj stałego, powolnego przepływu. Zwykle od 300 do 500 zdarzeń na sekundę.

Korzystając z bramkowania, rozróżniaj martwe komórki i zanieczyszczenia subkomórkowe, wykreślając FCS i SSC. Od żywotnych komórek rozróżnij dublety, wykreślając szerokość SSC w stosunku do wysokości SSC, a następnie wykres szerokości FFC w stosunku do wysokości FFC oraz wykres szerokości jodku propidyny w stosunku do wysokości jodku propidyny. W przypadku żywotnych komórek sygnałowych narysuj histogram intensywności obszaru jodku propidyny, który reprezentuje zawartość DNA w komórkach.

Sortuj komórki w niskich temperaturach na fazy G1 i S. Bramkowanie dla S powinno być szerokie i wchodzić w fazy G1 i G2. Podczas gdy bramkowanie G1 powinno być wąskie i jak najdalej od S.

W przypadku niektórych typów komórek może być trudno uzyskać ładny rozkład cyklu komórkowego. Najważniejsze jest, aby wziąć fazę G1 bez ogniw fazy S. Wyjmij probówki z posortowanymi komórkami z faksu.

Utrzymuj probówki na lodzie zgodnie z sortowaniem. Po sortowaniu komórek DNA dla każdej próbki jest oczyszczane za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA zgodnie ze wskazówkami producenta. Następnie prześwietlić DNA za pomocą skoncentrowanego ultrasonografu do średniej docelowej wielkości piku wynoszącej 250 par zasad.

Sprawdź rozmiar czystego DNA za pomocą elektroforezy. Zalecany rozkład wielkości to od 200 do 700 par zasad ze szczytem na około 250 parach zasad. Następnie biblioteka jest przygotowywana, sekwencjonowana i analizowana zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono mapę czasu replikacji dla całego chromosomu pierwszego z mysich fibroblastów embrionalnych. Przyjrzyj się bliżej regionowi składającemu się z około 50 megabaz. Kropki reprezentują znormalizowany stosunek S do G1 dla poszczególnych okien, a linia ciągła reprezentuje wyniki z sześciennej płynnie i interpolacji.

Wysokie wartości od S do G1 odpowiadają wczesnej replikacji, podczas gdy niskie wartości odpowiadają późnej replikacji. Czerwone strzałki wskazują przykłady regionów replikacji o stałym czasie replikacji, a zielone strzałki wskazują czasowe regiony przejściowe. Rysunek ten przedstawia odtwarzalność map czasu replikacji między potrójnymi fibroblastami embrionalnymi myszy w porównaniu z potrójnymi komórkami myszy pre-B w tym samym regionie 18 megazasad na pierwszym chromosomie myszy.

Pomarańczowe strzałki wskazują przykłady zróżnicowanych regionów między liniami komórkowymi. Mapa cieplna korelacji spearmana między sześcioma próbkami dodatkowo potwierdza wyniki. Po opanowaniu, ta technika, od zbierania komórek po generowanie map, może zostać wykonana w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować mapy genomowe czasu replikacji dla rosnących komórek.