Name: Systemy inżynierii tkankowej 3D do metod regeneracyjnych, odkrywania leków i badań przesiewowych toksyczności - REKLAMA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj ograniczenia klasycznych dwuwymiarowych kultur komórkowych w biologii komórki. Dowiedz się, jak sztywne podłoża wpływają na morfologię i fenotyp komórek, oraz dlaczego potrzebujemy bardziej fizjologicznych modeli in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

3D Systemy hodowli
A. 3D Kultury z użyciem hydrożeli i rusztowań
Hydrożele składają się z sieci usieciowanych łańcuchów polimerowych lub złożonych białek lub polisacharydowych cząsteczek pochodzenia naturalnego lub syntetycznego. Ze względu na znaczną zawartość wody i zakres przestrajalnych właściwości mechanicznych, hydrożele mają właściwości biofizyczne podobne do naturalnej tkanki i służą jako wysoce skuteczne matryce do hodowli komórek 3D. Hydrożele mogą być stosowane jako samodzielne matryce 3D, jako powłoka lub jako metoda enkapsulacji komórek, które mają być łączone z innymi technologiami, takimi jak rusztowania stałe, przepuszczalne podpory, mikromacierze komórkowe, druk 3D lub urządzenia mikrofluidyczne. Morfologia, wzrost i funkcjonalność komórek w hydrożelu zależą od prezentacji sygnałów biofizycznych i biochemicznych, a także właściwości fizycznych, takich jak przepuszczalność i sztywność matrycy.
Naturalne hydrożele i matryce zewnątrzkomórkowe (ECM)
Naturalnie pozyskiwane hydrożele do hodowli komórkowej są zazwyczaj tworzone z białek, polisacharydów i składników ECM, takich jak kolagen, laminina, fibryna, kwas hialuronowy, chitozan lub Matrigelä (odtworzony ekstrakt z błony podstawnej z guzów myszy Engelbreth-Holm-Swarm zawierający mieszaninę lamininy, kolagenu IV, proteoglikanu siarczanu heparyny i nidogenu/entaktyny19, Rysunek 1). Żele pochodzące ze źródeł naturalnych są z natury biokompatybilne i bioaktywne20. Promują również wiele funkcji komórkowych ze względu na obecność różnych czynników endogennych, które mogą być korzystne dla wspierania żywotności, proliferacji, funkcji i rozwoju wielu typów komórek21.
Jednak naturalne hydrożele mają pewne wady, w tym ich izolację od źródeł pochodzenia zwierzęcego i nieodłączną zmienność składu między partiami. Ponadto zawierają endogenne składniki bioaktywne, takie jak czynniki wzrostu, które mogą być korzystne przy tworzeniu niektórych modeli 3D, ale w innych przypadkach mogą zakłócać określone zachowanie lub odpowiedź komórki, która jest badana. Na przykład Matrigel aktywuje szlaki kontrolujące angiogenezę22,23, ruchliwość komórek rakowych24 i wrażliwość na leki25, podczas gdy kolagen typu 1 zmienia produkcję metaloproteinaz macierzy (MMP), enzymów, które degradują składniki ECM i umożliwiają inwazję komórek nowotworowych26, wrażliwość komórek na leki przeciwnowotworowe27, proliferację komórek i migrację28,29.
Aby obejść niektóre problemy związane z biomateriałami pochodzenia zwierzęcego, matryce zostały opracowane w organizmach, które są wolne od zwierząt lub pochodzą z technologii rekombinacji kwasów nukleinowych. Kwas hialuronowy (hialuronan lub HA) jest coraz bardziej popularną matrycą30-32 pochodzenia biologicznego na bazie polisacharydów. Większość komercyjnego kwasu hialuronowego jest pochodzenia bakteryjnego i charakteryzuje się wysoką czystością i jednorodną jakością. Żele te mogą być modyfikowane przez dodanie składników ECM w celu poprawy właściwości przylegania komórek i wzrostu.
Syntetyczne hydrożele i matryce zewnątrzkomórkowe
Syntetyczne hydrożele są opcją do zastosowań w hodowlach komórkowych 3D, gdy naturalne matryce biologiczne są nieodpowiednie. Hydrożele syntetyczne składają się z czysto nienaturalnych cząsteczek33, takich jak poli(glikol etylenowy) (PEG)34, poli(alkohol winylowy)35 i poli(2-hydroksymetakrylan etylu)36. Są biologicznie obojętne, ale zapewniają wsparcie strukturalne dla różnych typów komórek. Są one również wysoce powtarzalne, pozwalają na łatwe dostrajanie właściwości mechanicznych oraz są proste w obróbce i produkcji.
Syntetyczne hydrożele mogą utrzymać żywotność zamkniętych komórek, jednocześnie pozwalając na osadzanie ECM podczas degradacji hydrożelu37, pokazując tym samym, że syntetyczne żele mogą funkcjonować jako platformy do hodowli komórek 3D przy braku ligandów wiążących integryny. Alternatywnym podejściem można modyfikować obojętne hydrożele syntetyczne odpowiednimi składnikami biologicznymi. Przykładem syntetycznego hydrożelu, który jest przestrajalny, jest Corning PuraMatrix™ Peptide Hydrogel, samoorganizujący się, syntetyczny oligopeptyd, który wykazuje włókna w skali nanometrowej (ryc. 2). Syntetyczne hydrożele można dostosować za pomocą określonych sekwencji peptydowych w celu poprawy przyczepiania komórek, naprowadzania komórek i innych zachowań38 lub hydrożele mogą być uzupełnione bioaktywnymi cząsteczkami (np. czynnikami wzrostu lub białkami ECM). Co więcej, urządzenia, takie jak przepuszczalne nośniki (np. wkładki Transwell®) mogą być włączane do modeli hodowli 3D z substratami hydrożelowymi w celu zbadania interakcji między różnymi typami komórek, czynnikami rozpuszczalnymi i środowiskiem hodowli.
Solidne rusztowania
Solidne rusztowania do hodowli komórek 3D są wykonane z szerokiej gamy materiałów, w tym metalu, ceramiki, szkła i polimerów. W szczególności polimery są powszechnym wyborem do generowania rusztowań litych o różnych rozmiarach, różnej strukturze, sztywności, porowatości i przepuszczalności39. Do generowania solidnych rusztowań do hodowli komórek 3D wykorzystuje się wiele technik produkcyjnych, w tym miękką litografię, elektroprzędzenie, mikromacierze, biodruk i wiele innych. Głównymi wadami stosowania solidnych rusztowań są ograniczony zakres obrazowania komórek i trudności, które napotyka się podczas odzyskiwania komórek z macierzy.
Ważnym czynnikiem przy projektowaniu rusztowań do hodowli komórek 3D jest skala i topografia wewnętrznych struktur w rusztowaniu. W ciele ECM zapewnia skomplikowaną infrastrukturę w nanoskali do wspierania komórek i przedstawia pouczające tło, które rządzi ich zachowaniem40-44. Komórki wiążące się z rusztowaniami, które wykazują architekturę w mikroskali, zwykle spłaszczają się i rozprzestrzeniają, tak jak gdyby były hodowane na płaskich powierzchniach45. Nawet niewielkie zmiany na poziomie nanoskali w topografii środowiska komórki mogą wywołać różnorodne skutki w zachowaniu komórki46. Oprócz skali i struktury, materiał użyty do budowy rusztowania, właściwości chemiczne powierzchni, sztywność matrycy, przepuszczalność i siły mechaniczne mogą znacząco wpływać na adhezję, wzrost i zachowanie komórek47.
B. Sferoidy
Sferoidy komórkowe to proste modele 3D, które mogą być generowane z szerokiej gamy typów komórek, które tworzą sferoidy w sposób naturalny ze względu na tendencję przylegających komórek do agregacji. Typowymi przykładami sferoidów są ciała embrionalne, mammosfery, sferoidy nowotworowe, hepatosfery i neurosfery. W szczególności przylegające komórki mają tendencję do agregacji w warunkach, które utrudniają adhezję do substratów hodowli komórkowych. Powszechne metody bezmatrycowe stosowane do generowania sferoid obejmują wykorzystanie bardzo niskich powierzchni przylegających do hodowli komórkowych lub poprzez utrzymywanie komórek jako kultur zawiesinowych w pożywkach (np. technologia wiszących kropli, hodowle rotacyjne i bioreaktory). Kilka typów komórek tworzy również sferoidy w hydrożelach 3D i w ograniczonym stopniu w niektórych rusztowaniach stałych, w zależności od właściwości strukturalnych i mechanicznych materiału. Całkowity rozmiar sferoid jest ograniczony do kilkuset mikrometrów, po przekroczeniu których w jądrze sferoid następuje nekroza48.
Gdy komórki spontanicznie łączą się w sferoidy, naturalnie naśladują różne aspekty tkanek stałych i są wyposażone w naturalne gradienty do efektywnej dyfuzji tlenu i składników odżywczych, jak również usuwania odpadów metabolicznych. Te agregaty komórkowe mogą naśladować zachowanie unaczyniowych, litych guzów skuteczniej niż standardowe środowiska 2D, ponieważ sferoidy, podobnie jak nowotwory, zwykle zawierają niejednorodną populację odsłoniętych powierzchniowo i głęboko zakopanych komórek, komórek proliferujących i nieproliferujących oraz dobrze natlenionych i niedotlenionych komórek49. Ponadto różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych zazwyczaj wiąże się z tworzeniem sferycznych struktur zwanych ciałami embrionoidalnymi, co jest ważnym krokiem w kolejnych badaniach różnicowania komórek in vitro. Sferoidy stanowią zatem szczególnie dobry fizjologiczny model 3D do badania nowotworzenia litego i różnicowania komórek macierzystych. Ponadto sferoidy można łatwo analizować poprzez obrazowanie za pomocą mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej i konfokalnej, co stanowi przewagę nad bardziej złożonymi modelami hodowli komórkowych 3D. Co więcej, masowa produkcja sferoid 3D o jednolitych rozmiarach jest stosunkowo prosta, co czyni je wysoce podatnymi na wiele zastosowań in vitro o wysokiej przepustowości (HTP) i badaniach przesiewowych toksyczności.
C. Organoidy
Kolejnym ważnym krokiem naprzód w różnicowaniu komórek macierzystych jest tworzenie samoorganizujących się mini "organów" 3D, znanych jako organoidy. Organoidy mogą podsumowywać szczegóły histologiczne i zapewniać funkcjonalną reprezentację wielu typów komórek, które są obecne w narządach natywnych. Organoidy reprezentatywne dla tkanek jelitowych50,51, siatkówki52, trzustki53, sutka54, okrężnicy55 i tkanki mózgowej56 zostały niedawno opracowane przy użyciu modeli 3D składających się z Matrigel Matrix. Rycina 3 ilustruje schemat warunków hodowli 3D, które umożliwiły efektywną ekspansję zdysocjowanych embrionalnych komórek progenitorowych trzustki myszy53. Inny przykład pokazano na rycinie 4, gdzie Lancaster i in. wygenerowali organoidy mózgowe o strukturalnym podobieństwie do tkanki mózgowej57 . Podczas gdy hodowla organoidów in vitro jest ważnym krokiem w kierunku wyjaśnienia zasad rozwoju narządów i mechanizmów odpowiedzialnych za choroby genetyczne, spójność i przewidywalność uzyskania tych samych struktur różni się w zależności od próbki57. Podobnie jak sferoidy, są one również ograniczone pod względem wielkości przez rozwój nekrotycznych rdzeni, co ogranicza ich przydatność w podejściach regeneracyjnych.
D. Bioreaktory perfuzyjne
Jednym z głównych wyzwań związanych z tworzeniem kultur 3D in vitro jest ograniczona odległość transferu masy wymagana do dostarczania i usuwania składników odżywczych. Bioreaktory rozwiązują to wyzwanie, kontrolując środowisko fizjologiczne otaczające konstrukcje 3D (tj. dostarczanie składników odżywczych, napięcie tlenu, usuwanie odpadów, dane mechaniczne, pH i temperaturę). Bioreaktory są zatem niezbędne, gdy wymagane są większe konstrukty tkankowe, a także do podtrzymywania tkanek in vitro przez dłuższy czas, ponieważ zwiększony transport przez perfuzję pomaga uniknąć nekrotycznych centrów. W szczególności bioreaktory mogą być wykorzystywane do utrzymywania długoterminowych kultur, w których można monitorować dynamiczne zmiany58. Dodatkowo bioreaktory kontrolują rozmiar i kształt kultur 3D oraz promują równomierne rozmieszczenie komórek59-64. Bioreaktory występują w wielu różnych formatach, w tym: bioreaktory perfuzyjne (bezpośrednie)65, (pośrednie) bioreaktory perfuzyjne z pustymi włóknami66, bioreaktory perfuzyjne ze stymulacją mechaniczną67, bioreaktory naczyń o obrotowych ściankach68, kolby wirujące69 i wytrząsarki orbitalne70.
E. Inne sposoby rozwiązania problemu ograniczonego transferu masowego
Innym fizjologicznie istotnym rozwiązaniem problemu ograniczonego transferu masy w dużych konstruktach tkankowych jest odtworzenie układu naczyniowego tkanek (który dostarcza i usuwa składniki odżywcze in vivo) z połączonymi, unaczynionymi kanałami 71. Jako sztuczny substytut wspomagający wzrost komórek o dużej gęstości, "pseudowaskularyzacja" za pomocą bioreaktorów z membraną z pustych włókien również przyniosła obiecujące wyniki 66,72-74. Puste włókna działają jak naczynia krwionośne przenoszące pożywkę hodowlaną przez konstrukty inżynierii tkankowej, podczas gdy większość można wysiać macierzą zewnątrzkomórkową lub innymi materiałami i komórkami rusztowania.
Ostatnie ulepszenia w technikach inżynierii mikroskali, takie jak produkcja urządzeń mikroprzepływowych i mikroukładów, mogą potencjalnie rozwiązać problemy z zaopatrzeniem w składniki odżywcze poprzez tworzenie modeli w skali mikro. Urządzenia mikroprzepływowe manipulują małymi objętościami (od 10-9 do 10-6 litrów) w celu generowania i precyzyjnego kontrolowania dynamicznego przepływu płynów i gradientów czasoprzestrzennych, a także dostarczania składników odżywczych i innych sygnałów chemicznych do komórek w kontrolowany sposób75. Sieci mikroprzepływowe zostały włączone bezpośrednio do hydrożeli osadzonych w komórkach, a także w kilku innych matrycach, aby umożliwić wydajny transport konwekcyjny składników odżywczych i innych rozpuszczalnych wskazówek w rusztowaniach3D 76. Mikromacierze składają się z solidnego nośnika, w którym małe objętości różnych biomolekuł i komórek można umieszczać w określonych miejscach, umożliwiając multipleksowane badanie żywych komórek i ich reakcji na bodźce. Zastosowanie tych technologii może poprawić żywotność i funkcje komórek. Co więcej, technologie mikroprzepływowe mogą zwiększyć przepustowość i znacznie obniżyć koszty hodowli ze względu na niskie wymagania dotyczące objętości odczynników.
F. Uwagi dotyczące komórek
Różne typy komórek mogą być włączane do modeli 3D, co skutkuje zmienionymi wynikami. Istnieją trzy główne klasyfikacje komórek, które można zastosować: komórki macierzyste, komórki pierwotne i unieśmiertelnione linie komórkowe. Komórki macierzyste to niezróżnicowane komórki, które można stymulować do różnicowania się w dół różnych linii. Komórki macierzyste są atrakcyjną opcją, ponieważ samoodnawiają się w hodowli i mogą być wykorzystywane do tworzenia modeli specyficznych dla pacjenta. Istnieje wiele rodzajów komórek macierzystych, które są definiowane przez ich etap rozwoju. Różne typy obejmują: dorosłe komórki macierzyste (często ze szpiku kostnego lub tkanki tłuszczowej), płodowe komórki macierzyste, łodygi krwi pępowinowej, embrionalne komórki macierzyste lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Z drugiej strony komórki pierwotne są pozyskiwane bezpośrednio z określonej tkanki i dlatego są już zaangażowane w określoną linię. Mają ograniczony czas życia w kulturze, a zatem są bardziej ograniczone liczebnie, a w końcu ulegają starzeniu się i przestają się rozmnażać. Natomiast unieśmiertelnione komórki zostały zmienione tak, aby namnażać się i unikać starzenia się komórek. Systemy dostarczania genów są również opcją modulowania określonego fenotypu w modelach inżynierii tkankowej.
W organizmie komunikacja między różnymi typami komórek jest kluczowa dla utrzymania homeostazy i swoistości tkanek. Zwiększone różnicowanie i przeżywalność osiąga się poprzez kokulturację odpowiednich typów komórek77-81. Ponadto kohodowle prowadzą do zwiększonego odkładania się ECM82,83, poprawy pomiarów wyników funkcjonalnych84, prawidłowej morfologii83,84 i struktur naczyniowych81 nieosiąganych w monokulturach. Oprócz lepszego naśladowania normalnej fizjologii, modele kokultur 3D okazały się przydatne do badania złożonych interakcji między komórkami rakowymi a innymi typami komórek, wyjaśniając ich udział we wzroście guza, unaczynieniu i przerzutach.
Unikalne względy komórkowe dla narządów, które łączą się z powietrzem, zaowocowały hodowlami wielu typów komórek na granicy powietrze-ciecz, w tym płuca85, naskórek86, rogówka87 i wewnętrzna strona policzka88.
Hodowla komórek na granicy powietrze-ciecz przy użyciu przepuszczalnych podpór umożliwiła rozwój modeli 3Din vitrodo odkrywania leków, w tym modelowania nabłonka płuc. Wykorzystując komórki od chorych dawców, te modele komórkowe są wykorzystywane do badania różnych zaburzeń płucnych.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Budowa fizjologicznie istotnych tkanek 3D to wieloaspektowa inicjatywa badawcza, w ramach której uzyskane tkanki mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań. Ponieważ systemy hodowli komórkowych 3D zapewniają dokładniejsze środowisko dla wzrostu komórek, morfogenezy tkanek i różnicowania komórek macierzystych, mają one potencjał do wykorzystania do modelowania rozwoju tkanek, postępu choroby oraz do implantacji in situ w przypadku dużych ubytków tkankowych. Modele 3D hodowli komórkowych nadają się również do wypełnienia luki między konwencjonalnymi modelami przedklinicznymi 2D do badań przesiewowych leków i toksyczności a badaniami klinicznymi in vivo na ludziach. Ulepszone modele przedkliniczne 3D pozwolą lepiej podsumować procesy patobiologiczne leżące u podstaw chorób określonych tkanek i narządów u ludzi, a także dokładniej przewidzieć reakcje fizjologiczne na związki terapeutyczne.
W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono już ogromne postępy w tej dziedzinie, jednak pozostaje wiele praktycznych ograniczeń, zanim modele 3D hodowli komórkowych będą mogły zostać powszechnie wdrożone w wielu zastosowaniach. Po pierwsze, wiele modeli 3D jest nowatorskich, a dane wygenerowane przy użyciu tych metod muszą zostać zweryfikowane pod kątem ustalonych odpowiedzi in vivo w celu kalibracji. Ponadto wyniki testów 3D mogą być bardzo zmienne ze względu na brak ustandaryzowanych protokołów i stosowanie heterogenicznych, a czasem wielu populacji komórek. Nieniszczące techniki analizy danych (wydzielane czynniki, zmiany morfologiczne i/lub nieinwazyjne markery funkcjonalne) są zatem niezbędne do śledzenia tego samego konstruktu 3D w hodowli. Ponadto niektóre matryce 3D mają ograniczoną przepuszczalność lub słabą dynamikę dyfuzji i dlatego muszą zawierać systemy perfuzyjne, aby zachować żywotność i funkcjonalność. Co więcej, odzyskiwanie i wizualizacja komórek mogą być ograniczone w niektórych rusztowaniach 3D. Innym poważnym ograniczeniem jest to, że wielu modeli hodowli 3D nie można łatwo zautomatyzować ani skalować w celu przeprowadzenia badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.
Ograniczenia te są jednak przezwyciężane dzięki nowym technologiom i nowszym testom 3D in vitro . Modele hodowli komórkowych 3D in vitro poczyniły postępy we wspieraniu wzrostu komórek, morfogenezy tkanek, różnicowania komórek macierzystych, modelowania chorób, odkrywania leków i testowania toksyczności. Oczywiste jest również, że wymagane są różne modele 3D o różnych charakterystykach, aby zaspokoić potrzeby określonych typów ogniw lub zastosowań. Połączenie nowszych technologii, takich jak mikromacierze na chipie, mikrofluidyka lub biodruk z biologicznie istotnymi matrycami, może pomóc w zwiększeniu skali i przeprowadzeniu niektórych z tych złożonych modeli hodowli komórkowych 3D do wysoce predykcyjnych i odpowiednich testów przesiewowych leków i testów toksyczności, a także zapewnić nowatorskie systemy do badań regeneracyjnych.

Hodowla komórkowa ssaków in vitro służyła jako nieocenione narzędzie w biologii komórkowej przez kilka dziesięcioleci. Klasycznie, monowarstwowe kultury przylegających komórek hodowano na płaskich i sztywnych dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren lub szkło. Jednak wiele komórek, po wyizolowaniu z tkanek i umieszczeniu na sztywnych, płaskich powierzchniach hodowli komórkowych 2D, takich jak plastik do hodowli tkankowych, staje się stopniowo bardziej płaskich, dzieli się nieprawidłowo i traci swój zróżnicowany fenotyp 1,2. Chociaż te dwuwymiarowe badania nad kulturami komórkowymi odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia wielu procesów biologicznych, nie naśladują one warunków in vivo.
W ciele komórki znajdują się w złożonej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) składającej się z trójwymiarowej (3D) architektury, która umożliwia bezpośrednie interakcje z sąsiednimi komórkami i cząsteczkami macierzy poprzez sygnały biochemiczne i mechaniczne. Interakcje komórka-komórka i komórka-ECM tworzą sieć komunikacyjną 3D, która utrzymuje swoistość i homeostazę tkanki3. Dlatego nie jest zaskakujące, że fundamentalne różnice w mikrośrodowisku systemów hodowli komórkowych 2D i 3D wpływają na różne zachowania komórkowe, w tym sposób, w jaki komórki przyłączają się, rozprzestrzeniają i rosną, ich morfologię i polarność, ekspresję genów i białek, żywotność, proliferację, ruchliwość, różnicowanie, reakcję na bodźce, metabolizm komórkowy i ogólną funkcję 1,2,4-16.
ECM 3D otaczający komórkę pełni kilka krytycznych funkcji. Po pierwsze, zapewnia złożoną, nanoskalową architekturę białek strukturalnych, takich jak kolagen, laminina, fibronektyna i glikozaminoglikany, w celu ustalenia właściwości mechanicznych właściwych dla mikrośrodowiska komórkowego17,18. Komórki wyczuwają tę mechanikę poprzez integryny powierzchniowe komórki i wiążą się ze specyficznymi motywami adhezyjnymi obecnymi na białkach ECM i glikozaminoglikanach. Ponadto ECM jest niezbędny do sekwestracji rozpuszczalnych biomolekuł i czynników wzrostu oraz uwalniania tych cząsteczek sygnałowych z kontrolą przestrzenno-czasową w celu kierowania procesami, takimi jak migracja komórek, degradacja macierzy i osadzanie17,18. Dlatego, aby naprawdę naśladować natywny ECM, konieczne jest opracowanie modeli hodowli 3D, które wykazują mechaniczne i chemiczne właściwości ECM, nie tylko na początkowym etapie wysiewu komórek, ale raczej w dynamiczny i dostrajalny sposób, gdy komórki rosną i rozwijają się. Aby sprostać wymaganiom różnych typów komórek i zastosowań w organizmie, zastosowano szeroki wachlarz materiałów i technik wytwarzania w celu opracowania mikrośrodowisk 3D o różnych właściwościach fizycznych, biologicznych i mechanicznych. Każdy model ma swój własny zestaw zalet i ograniczeń, a jeden odrębny model nie nadaje się do wszystkich zastosowań.

systemy inżynierii tkankowej 3d do metod regeneracyjnych, odkrywania leków i badań przesiewowych toksyczności - reklama

3D Tissue Engineered Systems for Regenerative Approaches, Drug Discovery, and Toxicity Screening - ADVERTISEMENT

Hodowla komórkowa ssaków in vitro służyła jako nieocenione narzędzie w biologii komórki przez kilka dziesięcioleci. Klasycznie, monowarstwowe kultury przylegających komórek hodowano na płaskich i sztywnych dwuwymiarowych (2D) podłożach, takich jak polistyren lub szkło. Jednak wiele komórek, po wyizolowaniu z tkanek i umieszczeniu na sztywnych, płaskich powierzchniach hodowli komórkowych 2D, takich jak plastik do hodowli tkankowych, staje się stopniowo bardziej płaskich, dzieli się nieprawidłowo i traci swój zróżnicowany fenotyp 1,2. Chociaż te dwuwymiarowe badania nad kulturami komórkowymi odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia wielu procesów biologicznych, nie naśladują one warunków in vivo.

<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rozwinięte in vitro gruczoły endometrialne wykazują nabłonkową polaryzację apikopodstawną. Podwójne barwienie immunologiczne gruczołów opracowanych in vitro hodowanych przez 8 dni w pożywce BIE (A-E) lub skrawkach kriostatu uzyskanych z mysiego endometrium (F-I). A i F: Cytokeratyna (zielona) i wimentyna (czerwona). B i G: Laminina (zielona) i falloidyna (czerwona). C i I: GM130 (zielony) i falloidyna (czerwony). D i H: ZO-1 (zielony) i E-kadheryna (czerwony). E: ZO-1 (zielony) i b-katenina (czerwony). Biała skala = 20 mm. BIE medium = podłoże podstawowe uzupełnione 5 ng / ml EGF i rozcieńczenie 1:100 suplementu ITS i 3% świeżego Matrigel™ Matrix; EGF = naskórkowy czynnik wzrostu; ITS = selen transferyny insuliny (Eritja i wsp., 2010)89.
Opis 1 - Organizacja, sygnalizacja i wydzielanie komórek nabłonka gruczołowego bardziej przypominają właściwości obserwowane in vivo podczas hodowli w środowisku 3D, w przeciwieństwie do zachowania, które występuje na powierzchniach 2D 10,11. Model 3D in vitro gruczołów endometrialnych przedstawiono na rycinie 1. W tym modelu komórki nabłonka endometrium hodowano w pożywce zawierającej Matrigel™ Matrix przez 7-8 dni, a następnie barwiono immunofluorescencyjnie różnymi markerami polarności. Analiza ekspresji markerów potwierdziła, że struktury gruczołowe składały się wyłącznie z komórek pochodzenia nabłonkowego (1A i 1F). Ponadto sferoidy reprezentujące gruczoły endometrialne wykazywały prawidłową polaryzację wierzchołkowo-podstawno-boczną (1B i 1G), umiejscowienie aparatu Golgiego (1C i 1I), połączenia przylegające (ID i IH) oraz połączenia ścisłe (IE). 
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Rozprzestrzenianie się i różnicowanie w rusztowaniach 3D. (A + B) Obraz światła transmisyjnego komórek proliferujących w PuraMatrix z 0,25% lamininą (PML) i komórek różnicujących w PML 0,25% (C + D). Obraz komórek proliferujących i zróżnicowanych w PML 0,25% ze skaningowym mikroskopem elektronowym. (B + D) Po indukcji różnicowania obserwuje się rozwój gęstej trójwymiarowej sieci procesów. (E) Immunocytochemia dla bIII-tubuliny i TH komórek nieindukowanych w PML 0,25% i (F) Komórki po 7 dniach różnicowania ujawniły gęstą sieć komórek bIII-tubuliny dodatniej. Stwierdzono, że komórki TH+ posiadają procesy, ale bez budowania gęstej sieci (Ortinau i in. 2010)90.
Rysunek 2 opis - W tym badaniu, Ortinau i współpracownicy użyli syntetycznego hydrożelu, PuraMatrix™ uzupełnionego lamininą (PML 0,25%) do różnicowania neuronów ludzkich nerwowych komórek progenitorowych90. Korzystając z mikroskopii światła transmisyjnego (RYSUNEK 2A + B) i skaningowej mikroskopii elektronowej (FIGURA 2C + D), naukowcy wykazali, że neuronalne komórki progenitorowe mogą przekształcić się w gęstą sieć procesów neuronalnych (FIGURA 2B + D). Ponadto immunocytochemia wykazała, że po 7 dniach różnicowania neuronalne komórki prekursorowe zaczęły wyrażać markery neuronalne (bIII-tubulina i hydroksylaza tyrozynowa (TH)) (FIGURA 2E + F). Obserwacje te pokazują, w jaki sposób funkcjonalizacja odpowiednimi czynnikami biologicznymi może przekształcić obojętne matryce syntetyczne w użyteczne modele in vitro wspierające różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rys. 3. Organoidy rekapitulują ekspansję progenitorów i zorganizowane różnicowanie.
(A-E) Immunohistochemia na odcinkach 7-dniowych organoidów pokazująca, że (A) wszystkie komórki (DRAQ5, jądra czerwone) są nabłonkowe (E-kadheryna) i wiele z nich proliferuje [fosfo-histon H3 (pHH3)] i (B, C) zachowuje markery trzustkowe PDX1, SOX9 i HNF1B. (C) Komórki polaryzują się i tworzą rurki wyściełane mucyną 1. (D) Różnicowanie zewnątrzwydzielnicze (amylaza) jest widoczne na obrzeżach. (E) Różnicowanie endokrynologiczne (insulina) jest wykrywane w centrum. Sekcja w B jest zbliżona do sekcji w A, a sekcja w D jest zbliżona do tej w C. (F) Schemat eksperymentalny mający na celu zbadanie różnicowania endokrynologicznego po przeszczepieniu wstecznym komórek hodowanych w organoidach w niszy trzustkowej. WT, typ dziki. (G-J) Komórki, które po raz pierwszy wyhodowano in vitro, integrują się z nabłonkiem gospodarza (biały w G i zielony w H-J). Niektóre pozostają przodkami (G; HNF1B), niektóre stają się ziarniastymi (H; amylaza) lub przewodowymi (I; DBA), a inne stają się endokrynologiczne (glukagon lub insulina). Wstawki są powiększeniami przerywanych pól. Paski skali: 50 μm (Greggio i wsp., 2013)53.
Rysunek 3 opis - Rysunek 3 ilustruje schemat warunków hodowli 3D, które umożliwiły efektywną ekspansję zdysocjowanych embrionalnych przodków trzustki myszy53. Manipulując składem pożywki, naukowcy stworzyli albo puste kule, które składają się głównie z komórek progenitorowych trzustki, albo złożone organoidy, które spontanicznie ulegają morfogenezie i różnicowaniu trzustki.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Rysunek 4" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Rysunek 4"> 
Wykres 4 | Opis systemu hodowli organoidów mózgowych. ZA, Schemat systemu hodowli używanego do generowania organoidów mózgowych. Pokazane są przykładowe obrazy każdego etapu. bFGF, podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów; hES, ludzka embrionalna komórka macierzysta; hPSC, ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste; RZS, kwas retinowy. B, Tkanki neuronabłonkowe wygenerowane przy użyciu tego podejścia (po lewej) wykazywały duże ubytki wypełnione płynem i typową lokalizację wierzchołkową neuronalnej N-kadheryny (strzałka). Tkanki te były większe i bardziej ciągłe niż tkanki wyhodowane w stacjonarnej zawiesinie bez Matrigelu (po prawej). C, Sekcja i immunohistochemia ujawniły złożoną morfologię z niejednorodnymi regionami zawierającymi neuronalne komórki progenitorowe (SOX2, czerwony) i neurony (TUJ1, zielony) (strzałka). D, Obrazy w jasnym polu o małym powiększeniu, ukazujące wypełnione płynem jamy przypominające komory (biała strzałka) i tkankę siatkówki, na co wskazuje pigmentowany nabłonek siatkówki (strzałka). Podziałka skali, 200 mm (Lancaster i in., 2013)57.
Rysunek 4 opis – Lancaster i in. stworzyli organoidy mózgowe o niezwykłym podobieństwie strukturalnym do tkanki mózgowej57. Te organoidy mózgowe urosły większe niż typowe sferoidy komórkowe i przetrwały przez tygodnie lub miesiące.

Systemy inżynierii tkankowej 3D do metod regeneracyjnych, odkrywania leków i badań przesiewowych toksyczności - REKLAMA

In vitro mammalian cell culture has served as an invaluable tool in cell biology for several decades. Classically, monolayer cultures of adherent cells ...

3d-tissue-engineered-systems-for-regenerative-approaches-drug

Without Section

Poznaj ograniczenia klasycznych dwuwymiarowych kultur komórkowych w biologii komórki. Dowiedz się, jak sztywne podłoża wpływają na morfologię i fenotyp komórek, oraz dlaczego potrzebujemy bardziej fizjologicznych modeli in vitro.

Systemy inżynierii tkankowej 3D do metod regeneracyjnych, odkrywania leków i badań przesiewowych toksyczności - REKLAMA

Przeglądaj więcej filmów