Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Ogólnym celem niniejszej procedury jest konstrukcja syntetycznych operonów wielogenowych pod kontrolą indukowalnej polimerazy RNA T7 w celu jednoczesnej ekspresji wielu białek. Metoda ta może pomóc badaczom w dziedzinie biologii syntetycznej i biochemii, umożliwiając im budowanie wielobiałkowych szlaków lub badanie kompleksów białkowych zależnych od koekspresji przy zastosowaniu wielu podejść. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na jednoczesną ekspresję wielu genów w Escherichia coli z jednego plazmidu.

Procedurę z mojego laboratorium zademonstrują Mohamed Hassan, doktorant, oraz Angela Thompson, studentka programu Co-op. Po uzyskaniu i amplifikacji interesujących genów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować reakcje trawienia dla pierwszego genu oraz wektora pMGX. Należy zastosować 40 µl reakcji zawierającej od 0,5 do 1,5 µg DNA w obecności enzymu restrykcyjnego.

Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie dodać EcoRI i pozwolić na trawienie przez kolejną godzinę. NdeI jest dodawany przed EcoRI, aby zapewnić jego skuteczne trawienie.

NdeI jest wrażliwy na długość dwuniciowego DNA po obu stronach miejsca restrykcyjnego. Dodanie go w pierwszej kolejności zapewnia przecięcie pełnowymiarowego kolistego plazmidu. Reakcje trawienia należy nanieść na żel agarozowy o stężeniu 0,7% i poddać elektroforezie przy napięciu 100 V przez 55 minut.

Następnie, za pomocą czystego skalpela lub żyletki, wycinamy prążki insertu oraz wektora, a wycięte fragmenty żelu umieszczamy w probówkach 1,5 ml. Do oczyszczania DNA należy użyć zestawu do izolacji z żelu zgodnie z protokołem tekstowym. Przygotowujemy 20 µl reakcji ligacji zawierającej od 0,15 do 0,5 µg DNA wektora i odpowiednią ilość insertu, zależnie od wielkości genu, oraz 1 µl ligazy T4 DNA.

W warunkach aseptycznych rozmrozić na lodzie 100 µL aliquoty chemicznie kompetentnych komórek E.coli XL1-Blue przez pięć minut. Następnie dodać do komórek pięć µL reakcji ligacji zawierających gen zainteresowania. Inkubować transformacje na lodzie przez 30 minut.

Następnie poddaj komórki szokowi termicznemu przez 45 sekund w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C. Potem umieść próbki z transformacją na lodzie, a następnie dodaj 200 µL zimnej pożywki LB. Pozostaw komórki do inkubacji przez dwie minuty.

Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez jedną godzinę, a następnie rozprzestrzenić 100 µL na płytkach z agarem LB zawierającym odpowiedni marker selekcyjny. Aby przeanalizować kolonie pod kątem potencjalnych transformantów, należy porównać liczbę kolonii na kontroli negatywnej i na płytkach z ligacją. Pożądany stosunek liczby kolonii wynosi od jeden do dwóch.

Wybiery od czterech do ośmiu pojedynczych kolonii z każdej reakcji ligacji w celu zaszczepienia 4 mililitrów LB z odpowiednim antybiotykiem. Inkubuj kultury w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez noc. Za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA oczyść DNA plazmidowe zgodnie z protokołem tekstowym i przygotuj reakcje trawienia o objętości 20 µL z 150–500 ng DNA, używając po jednym µL enzymów NdeI i EcoRI.

Inkubować reakcje trawienia w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Aby wstawić gen dwa do wektora pMGX zawierającego gen jeden, przygotować 40-µl reakcję trawienia zawierającą od 0,5 do 1,5 µg DNA wektora z pierwszym badanym genem oraz 1 µl AVR2. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny przed dodaniem 1,5 µl fosfatazy jelitowej cielęcej (CIP).

Inkubować przez kolejne 30 minut. Następnie przygotować reakcję trawienia o objętości 40 µL, zawierającą od 0,5 do 1,5 µg wektora pMGX z drugim genem zainteresowania. Do reakcji dodać po 1 µL AVR2 oraz xpol.

Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Przeprowadzić elektroforezę produktów trawienia restrykcyjnego na żelu agarozowym 0,7%. Następnie, używając czystego skalpela, wyciąć prążki insertu i wektora, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Po wyekstrahowaniu plazmidowego DNA i ilościowym oznaczeniu próbki zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić reakcję ligacji, stosując stosunek insertu do wektora 3:1 dla genu 2 i pMGX-yfg1. Należy uwzględnić kontrolę negatywną z użyciem wyłącznie pMGX-yfg1. Pięć mikrolitrów każdej reakcji należy wprowadzić do komórek XL1-Blue, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Następnie porównaj liczbę kolonii na płytkach z kontrolą negatywną oraz na płytkach po ligacji. Jeśli na płytce z kontrolą negatywną znajduje się duża liczba kolonii, zweryfikuj proces traktowania CIP. Wybierz od czterech do ośmiu pojedynczych kolonii z reakcji ligacji i użyj każdej z nich do zaszczepienia 4 µL pożywki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku.

Hodować w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez noc. Po wyizolowaniu i oilościowym oznaczeniu DNA plazmidowego w sposób opisany wcześniej, sprawdzić skuteczność insercji drugiego genu, przygotowując reakcję trawienia zawierającą od 150 do 500 ng DNA oraz 1 µL EcoRI. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.

Do celów przesiewowych zaleca się stosowanie EcoRI, jednak w niektórych przypadkach EcoRI może generować dwa lub więcej insertów o podobnej wielkości, które są trudne do rozróżnienia na żelu. Aby zapewnić sukces, należy zastosować alternatywny enzym restrykcyjny, taki jak NdeI. Rozdziel reakcje trawienia na żelu agarozowym, szukając prążka odpowiadającego wielkości wprowadzonego genu 2.

Sklonuj dodatkowe geny do plazmidu zgodnie z protokołem tekstowym. Aby wygenerować plazmid policistronowy, pięć genów sklonowano najpierw do odpowiedniego plazmidu, pMGX A. Rysunek ten przedstawia pCR-Blunt-yfg1 oraz pCR-Blunt-yfg2 w plazmidzie pMGX A, a także pMGX A po trawieniu enzymami indel i EcoRI. W celu sklonowania dwóch pierwszych genów do pMGX A, plazmid poddano trawieniu enzymami indel i EcoRI.

Po klonowaniu wektory pMGX-yfg1 i pMGX-yfg2 poddano trawieniu enzymami AVR2 i xpol, aby potwierdzić uzyskanie prawidłowych klonów. Rysunek ten przedstawia wektor pMGXyfg1 trawiony AVR2 oraz wektor pMGX-yfg2 trawiony AVR2 i xpol w celu wyizolowania drugiego genu zainteresowania. Uzyskany insert sklonowano do pMGX-yfg1, tworząc wektor pMGX-yfg1 dwa.

Jak widać tutaj, trawienie pMGX-yfg1 za pomocą EcoRI potwierdziło pomyślne klonowanie genu docelowego numer dwa do wektora pMGX-yfg1. Obraz żelu pokazuje różnicę między plazmidami po trawieniu, które posiadały wstawkę w prawidłowej orientacji lub w orientacji odwrotnej. Wstawka w orientacji odwrotnej powodowałaby obecność dwóch miejsc cięcia EcoRI w bliskim sąsiedztwie, co sprawiłoby, że powstałe po trawieniu fragmenty o długości 50 par zasad byłyby niewykrywalne na żelu, a szkielet plazmidu byłby większy.

Na koniec, po wygenerowaniu policistronowego wektora ekspresyjnego dla pięciu genów, analiza western blot wykazanych białek potwierdza, że wszystkie pięć białek zostało wyekspresowanych z jednego wektora. Należy zauważyć, że białko produkowane przez yfg5 ma ten sam rozmiar co yfg1 i nie ulega rozdzieleniu w żelu. Po opanowaniu tej techniki, proces ten może zostać ukończony w ciągu trzech lub czterech dni dla każdego genu wstawionego do szkieletu pMGX, pod warunkiem jego prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o potraktowaniu i linearyzacji wektora fosfatazą, taką jak fosfataza jelitowa cielęca, w celu defosforylacji końców wektora. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać dalsze eksperymenty, takie jak ekspresja wielogenowa in vivo, aby scharakteryzować i wykorzystać szlaki biosyntetyczne do produkcji produktów naturalnych lub badać kompleksy białko-białko. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii syntetycznej do produkcji złożonych węglowodanów oraz genetycznie zmodyfikowanych E.Coli.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wdrożyć system ekspresji wielogenowej w E.coli.