Name: Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę indukowalnej koekspresji wielu genów za pomocą polimerazy T7 i plazmidu pMGX w Escherichia coli. Technika ta umożliwia budowanie wielogenowych operonów syntetycznych do jednoczesnej ekspresji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych.

1. Pozyskiwanie interesujących genów
<ol>
	<li>Projektowanie syntetycznych genów.
	<ol>
		<li>Zoptymalizuj sekwencję genów pod kątem ekspresji E. coli.</li>
		<li>Usuń wszystkie problematyczne miejsca ograniczeń z sekwencji (AvrII, NdeI, EcoRI i XbaI).</li>
		<li>Włączenie miejsc ograniczeń do klonowania; zalecane jest stanowisko 5′-NdeI i stanowisko 3′-EcoRI. W razie potrzeby można skorzystać z innych witryn; odnoszą się do regionu multiklonowania wybranego plazmidu (<silna klasa="xfig">Rysunek S1-S4). W razie potrzeby dołącz znacznik kodowania 5′ lub 3′ do wykrywania Western blot.</li>
		<li>Zamów komercyjnie zaprojektowany gen.</li>
		<li>Albo tępo sklonować gen do wektora za pomocą zestawu do klonowania, zgodnie z instrukcjami producenta; zaprojektować startery do amplifikacji genu (następnie przejść do kroku 1.2.2); lub dodać dodatkowe końce 5′ i 3′ do bezpośredniego klonowania do plazmidu pMGX i przejść do kroku 2. W tym przypadku reprezentatywne wyniki pochodzą z klonowania genów, które są przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikuj pożądany gen (z zaprojektowanego i zoptymalizowanego genu syntetycznego lub z matrycowego DNA zawierającego pożądany gen)15.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj podkłady z miejscami ograniczeń do klonowania; zalecane jest stanowisko 5′-NdeI i miejsce 3′-EcoRI. W razie potrzeby można skorzystać z innych witryn; odnoszą się do regionu multiklonowania wybranego plazmidu (<silna klasa="xfig">Rysunek S1-S4). W razie potrzeby dołącz znacznik kodujący 5′ lub 3′ do wykrywania Western blot.</li>
		<li>PCR amplifikuje pożądany gen 15.</li>
		<li>Przeanalizuj PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym16.</li>
		<li>Jeśli amplifikacja jest niespecyficzna, oczyść amplifikowany gen przez ekstrakcję żelu. Jeśli nie, użyj zestawu do czyszczenia enzymów.</li>
		<li>Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru, sprawdzając absorbancję przy długości fali 260 nm; ślepa próba z buforem elucyjnym17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Klonowanie interesujących genów do wektora wielogenowego systemu ekspresji, pMGX18
<ol>
	<li>Restrykcyjne trawienie uzyskanego genu będącego przedmiotem zainteresowania i pożądanego wektora, pMGX, z NdeI i EcoRI. 
	UWAGA: Jeśli otrzyma się dużą ilość plazmidów recyrkularyzowanych, przed dodaniem EcoRI pozwól reakcji NdeI postępować przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Stosować 40 μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μ5 μg DNA i 1 μl każdego enzymu z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu.</li>
		<li>Do trawienia NdeI i EcoRI użyj buforu EcoRI i najpierw dodaj endonukleazę NdeI. Trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj endonukleazę EcoRI i pozwól trawieniu postępować przez dodatkową godzinę. NdeI jest wrażliwe na rozszczepienia w pobliżu końca DNA, więc wstępne trawienie przez EcoRI może uniemożliwić skuteczne trawienie przez NdeI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza trawienia restrykcyjnego w żelu agarozowym (dla genu 1 kb należy użyć 0,7% żelu agarozowego pod napięciem 110 V przez 55 minut; aby wybrać procent żelu agarozowego dla różnych rozmiarów genów, patrz odniesienie16.</li>
	<li>Za pomocą czystego skalpela lub żyletki należy wprowadzić wkładkę akcyzową i wektor, a wycięty segment żelu umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Ekstrakcję DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zliguj interesujący nas gen do wektora pMGX przy użyciu stosunku insercji do wektora 3:1; ustaw ujemną ligację strawionego pMGX bez wstawki.
	<ol>
		<li>Ustaw 20 μl reakcji ligacji zawierającej 1 μl ligazy DNA T4, 0,15-0,5 μg wektorowego DNA (~5 μl) i odpowiednią ilość insertu w oparciu o stosunek insercji do wektora 3:1 i wielkość wstawianego genu; szkielety pMGX mają wielkość od 5,312 do 5,504 pz. Uwzględnij reakcję kontroli negatywnej, która zawiera wszystko oprócz wprowadzanego genu. Upewnij się, że ilość DNA wektora jest równoważna w reakcjach ligacji kontroli ujemnej i ligacji wektora plus insercji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć reakcje ligacji w XL1-Blue chemicznie kompetentne komórki E. coli i ligowane plazmidy pMGX-yfg1 (zawierające gen zainteresowania 1), pMGX-yfg2 (zawierające gen zainteresowania 2) ... pMGX-yfgn (zawierające gen zainteresowania n). Stosuj technikę aseptyczną (w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub pod płomieniem).
	<ol>
		<li>Rozmrozić 100 μl podwielokrotności chemicznie kompetentnej XL1-Blue E. coli na lodzie przez 5 minut, a następnie dodać 5 μl reakcji ligacji. Inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Szokować termiczne komórki przez 45 s w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 42 °C, a następnie dodać 200 μl zimnego LB. Inkubować je na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Potrząsać komórkami w temperaturze 37 °C, 220 obr./min przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić płytkę o objętości 100 μl na płytce z agarem LB zawierającej odpowiedni marker do wyboru (ampicylinę lub kanamycynę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewaj klony pod kątem dodatnich transformantów.
	<ol>
		<li>Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Pożądany jest stosunek liczby kolonii większy niż 1:2. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 2.1 i przejrzyj notatkę.</li>
		<li>Wybierz 4-8 indywidualnych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z każdej reakcji ligacji różnych genów wstawionych do badań przesiewowych (1 n) i zaszczepij 4 ml LB i odpowiednią antybiotykową kulturę nocną / indywidualną kolonię. Hoduj kultury przez noc, wytrząsając w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.</li>
		<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przygotuj 20 μl NdeI + EcoRI reakcji trawienia zawierającej 150-500 ng DNA i 1 μl każdego enzymu z 2 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. W takim przypadku należy dodać NdeI i EcoRI w tym samym czasie, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania będzie znajdował się pomiędzy miejscami restrykcyjnymi. Zalecana jest kontrola ujemna z pustym wektorem pMGX. Trawić przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstawienie genu 2 do wektora pMGX zawierającego gen 1, pMGX-yfg1
<ol>
	<li>Trawienie restrykcyjne pMGX-yfg1 z AvrII i leczenie fosfatazą jelitową cielęcej ().
	<ol>
		<li>Stosować 40-μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μg wektorowego DNA (~5-10 μL wyizolowanego DNA) i 1 μl AvrII z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. Trawić przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie dodać 1,5 μl. Pozostaw w temperaturze 37 °C na dodatkowe 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ograniczenie trawi pMGX-yfg2 z AvrII i XbaI, aby uwolnić interesujący gen.
	<ol>
		<li>Stosować 40 μl reakcji trawienia zawierającej 0,5-1,5 μg DNA i 1 μl każdego enzymu z 4 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu. Trawienie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ograniczenie elektroforezy trawi odpowiedni procent (0,7%) żelu agarozowego i wycina wkładkę i pasma wektorowe za pomocą czystego skalpela/żyletki (patrz kroki 2.2-2.3).</li>
	<li>Wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta i określ ilościowo klasę<="xref">17.</li>
	<li>Zligować gen 2 do pMGX-yfg1 przy użyciu stosunku insercji do wektora 3:1. Ustawić ujemną ligację strawionego pMGX-yfg1 bez dodatkowej wkładki. Skonfiguruj jak powyżej w kroku 2.5.</li>
	<li>Przekształć 5 μl reakcji ligacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli XL1-Blue, ligowane plazmidy pMGX-yfg1,2 (zawierające gen zainteresowania 1 i 2) i ujemną kontrolę pMGX-yfg1, jak pokazano w kroku 2.6.</li>
	<li>Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Pożądany jest stosunek liczby kolonii większy niż 1:2. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 3.1 i dokonaj przeglądu leczenia.</li>
	<li>Wybrać 4-8 pojedynczych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z reakcji ligacji i zaszczepić 4 ml LB plus odpowiedni antybiotyk na pojedynczą kolonię i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta i określ ilościowo DNA17.</li>
	<li>Badanie przesiewowe skutecznej insercji drugiego genu poprzez przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego pMGX-yfg1,2 za pomocą EcoRI.
	<ol>
		<li>Użyć 20 μl reakcji trawienia zawierającej 150-500 ng DNA i 1 μl enzymu EcoRI z 2 μl buforu EcoRI 10x. Trawienie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforezę przetrawienia restrykcji na odpowiednim procencie żelu agarozowego; poszukać prążka, która odpowiada wielkości genu 2 (patrz Krok 2.2). Gen może wstawiać się do wektora w niepożądanej, odwróconej orientacji.</li>
</ol>
4. Dodanie trzeciego genu do wektora pMGX zawierającego geny 1 i 2, pMGX-yfg1,2
<ol>
	<li>Ograniczenie trawić pMGX-yfg1,2 z AvrII i leczyć, jak pokazano w kroku 3.1.</li>
	<li>Skrót ograniczeń pMGX-yfg3 z AvrII i XbaI, jak pokazano w kroku 3.2.</li>
	<li>Elektroforeza ograniczenie trawi odpowiedni procent żelu agarozowego oraz wkładkę akcyzową i opaski wektorowe za pomocą czystego skalpela/żyletki; patrz kroki 2.2-2.3.</li>
	<li>Wyekstrahuj DNA z żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i określ ilościowo DNA17.</li>
	<li>Zligować gen 3 do pMGX-yfg1,2 przy użyciu stosunku 3:1 insertu do wektora i ustawić ujemną ligację strawionego pMGX-yfg1,2 bez dodatkowej insercji, jak pokazano w kroku 3.5.</li>
	<li>Przekształć 5 μl reakcji ligacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli XL1-Blue, zligowany plazmid pMGX-yfg1,2,3 (zawierający geny będące przedmiotem zainteresowania 1, 2 i 3) i ujemną kontrolę pMGX-yfg1,2, jak pokazano w kroku 2.6.</li>
	<li>Porównaj liczbę kolonii na płytkach kontroli ujemnej i podwiązania. Jeśli na płytce kontroli ujemnej znajduje się duża liczba kolonii, wróć do kroku 4.1 i przejrzyj leczenie.</li>
	<li>Wybrać 4-8 pojedynczych kolonii (w zależności od stosunku kontroli ujemnej do ligacji) z reakcji ligacji i zaszczepić 4 ml LB plus odpowiedni antybiotyk na pojedynczą kolonię; rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Badanie przesiewowe skutecznej insercji trzeciego genu poprzez przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego pMGX-yfg1,2,3 za pomocą EcoRI, jak pokazano w kroku 3.10.</li>
	<li>Elektroforezę przetrawienia restrykcji na odpowiednim procencie żelu agarozowego; poszukać prążków, które odpowiadają rozmiarom genu 2 i genu 3 (patrz krok 2.2). Uwaga: gen 3 może wstawiać się do wektora w niepożądanej, odwróconej orientacji. Jeśli geny 2 i 3 są tej samej wielkości, należy wybrać inne odpowiednie miejsce trawienia restrykcyjnego do badań przesiewowych. 
	UWAGA: Powtórz w razie potrzeby dla każdego nowego genu.</li>
</ol>
5. Wytwarzanie interesujących białek za pomocą wielogenowego systemu ekspresji i ocena produkcji za pomocą Western blotting
<ol>
	<li>Przekształć dodatni klon zawierający wszystkie interesujące geny w chemicznie kompetentną E. coli produkującą białka, taką jak BL21-(λDE3).
	<ol>
		<li>Rozmrozić 100 μl podwielokrotności chemicznie kompetentnej BL21-(λDE3) E. coli na lodzie przez 5 minut, a następnie dodać 1 μl dodatniego sklonowanego plazmidowego DNA; inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Szok termiczny komórek przez 45 s w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 42 °C, a następnie dodać 200 μl zimnego LB. Inkubować na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Potrząsać komórkami w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 1 godzinę, a następnie rozprowadzić płytkę o objętości 100 μl na płytce z agarem LB zawierającej odpowiedni marker do wyboru (ampicylinę lub kanamycynę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja białka przez indukcję izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
	<ol>
		<li>Wybrać wyizolowaną kolonię z płytki transformacyjnej B21-(λDE3) i zaszczepić 4 ml LB wraz z odpowiednim antybiotykiem; rosnąć przez noc, wstrząsając w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.</li>
		<li>Zaszczepić 100 ml LB plus odpowiednią kulturę antybiotykową, używając 1 ml kultury na noc.</li>
		<li>Rosnąć w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min do OD600 0,6.</li>
		<li>Indukować kulturę za pomocą 100 μM IPTG i rosnąć przez 15 godzin w temperaturze 25 °C i 220 obr./min.</li>
		<li>Usunąć 1 ml kultury i odwirować ją przy 13 000 x g przez 1 minutę; wyrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj komórki lizie za pomocą roztworu do lizy zgodnie z instrukcjami producenta i przygotuj Western blot rozpuszczalnego lizatu komórkowego, aby określić, czy wszystkie białka zostały pomyślnie wyprodukowane19.</li>
</ol>

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Koekspresja wielu genów jest coraz bardziej istotna, szczególnie w charakterystyce i odtwarzaniu złożonych, wielogenowych szlaków metabolicznych 3,4,5. System pMGX sprawia, że wielogenowa koekspresja w E. coli jest rutynowa 6,7,8 i dostępna dla różnych badaczy. W tym badaniu wykazano, że pięć interesujących białek jest jednocze...

Współekspresja wielu białek staje się coraz bardziej istotna, szczególnie w zastosowaniach biologii syntetycznej, gdzie konieczna jest ekspresja wielu modułów funkcjonalnych1; w badaniach nad kompleksami białko-białko, w których ekspresja i funkcja często wymagają współekspresji2,3; oraz w charakteryzacji i wykorzystywaniu szlaków biosyntetycznych, w których każdy gen w szlaku musi zostać wyekspresowany4,5,6,7,8. Opracowano szereg systemów do współekspresji, szczególnie w organizmie gospodarza Escherichia coli, będącym podstawowym narzędziem laboratoryjnej ekspresji białek rekombinowanych9. Na przykład do ekspresji poszczególnych białek można użyć wielu plazmidów z różnymi markerami selekcyjnymi, korzystając z szerokiej gamy różnych wektorów ekspresyjnych10,11. Systemy jednoplazmidowe do ekspresji wielu białek wykorzystują albo wiele promotorów do kontroli ekspresji każdego genu10,12; operony syntetyczne, w których wiele genów jest zakodowanych w jednym transkrypcie2,13; lub w niektórych przypadkach pojedynczy gen kodujący polipeptyd, który jest ostatecznie przetwarzany proteolitycznie, dając pożądane białka docelowe14.
<img alt="Schemat konstruktu bicistronowego, trawienie DNA, proces ligacji w klonowaniu genów, wektory plazmidowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat pMGX przedstawiający konstrukcję wektora policistronowego. System pMGX zapewnia elastyczną i łatwą w użyciu strategię budowy syntetycznych operonów pod kontrolą indukowalnego promotora T7. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W niniejszym manuskrypcie opisano zastosowanie wysoce efektywnego systemu do konstrukcji syntetycznych operonów wielogenowych pod kontrolą indukowalnej polimerazy RNA T7 (Rycina 1). System ten umożliwia jednoczesną ekspresję wielu genów z jednego plazmidu. Opiera się on na systemie plazmidowym, pierwotnie nazwanym pKH22, który był z sukcesem stosowany w wielu różnych zastosowaniach6,7,8. W tej pracy zestaw plazmidów został rozszerzony o cztery powiązane wektory: pMGX-A, wektor ekspresyjny pozbawiony znaczników C- lub N-końcowych z markerem oporności na ampicylinę; pMGX-hisA, wektor ekspresyjny kodujący N-końcowy znacznik heksahistydynowy z markerem oporności na ampicylinę; pMGX-K, wektor ekspresyjny pozbawiony znaczników C- lub N-końcowych z markerem oporności na kanamycynę; oraz pMGX-hisK, wektor ekspresyjny kodujący N-końcowy znacznik heksahistydynowy z markerem oporności na kanamycynę. W badaniu tym zaprezentowano metodę generowania wektora policistronowego zawierającego pięć genów z wykorzystaniem systemu pMGX, a konkretnie pMGX-A, wraz z pomyślną produkcją każdego z poszczególnych białek w Escherichia coli.

<table><tbody><tr><td>Enzymes</td>Alkalic Phosphataza, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jelito cielęce ()</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polimeraza</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb drabinka DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemicznie kompetentne ogniwa</td><td></td><td></td><td>Kompensata przygotowana w domu</td></tr><tr><td>B-PER Odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnych</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Dostarczany z</td></tr><tr><td>zestawem</td> <td>do ekstrakcji żelu polimerazyOmega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Ekstrakcja żelem, dostarczana przez VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Przeciwciało [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescencyjny substrat HRP</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteryzowane odtłuszczone mleko w proszku</td><td>instant Lokalny sklep</td><td></td> spożywczy <td>Mleko w sklepie spożywczym bez nazwy jest wystarczające</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare, Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrana PT 0,45 i mikro; m 200 mm x 4 m, dostarczone przez VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidowego DNA</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA MiniKit I, dostarczony przez VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Prośba z Boddy Lab Skontaktuj się z cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td></td><td>Starters Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>Projektuj startery zgodnie z potrzebami dla pożądanego genu</td></tr><tr><td>Technologie syntetycznego życia genów</td><td></td><td></td><td>Zaprojektuj i zoptymalizuj zgodnie z potrzebami</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z grubymi plamami</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemicznie kompetentne ogniwa</td><td></td><td></td><td>Kompensata przygotowana w domu</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Pionowy żelowy do elektroforezy komórkowej</td></tr><tr><td></td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager</td></tr><tr><td>EC Inkubator-piekarnik</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-wytrząsarka</td> izotemperaturowa <td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Maszynki do golenia</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, dostarczany przez Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Zachodni aparat transferowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy rna t7, pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Współekspresja wielu białek jest coraz bardziej istotna dla biologii syntetycznej, badania kompleksów białko-białko oraz charakteryzowania i wykorzystywania szlaków biosyntezy. W pracy opisano zastosowanie wysoce efektywnego systemu do budowy wielogenowych operonów syntetycznych pod kontrolą indukowalnej polimerazy T7 RNA. System ten pozwala na jednoczesną ekspresję wielu genów z jednego plazmidu. Tutaj ujawniono zestaw czterech powiązanych wektorów, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K i pMGX-hisK, z markerem selektywnym oporności na ampicylinę lub kanamycynę (A i K) i posiadającymi lub nieposiadającymi N-końcowego znacznika heksahistydyny (his). Szczegółowe protokoły budowy syntetycznych operonów przy użyciu tego systemu wektorowego są dostarczane wraz z odpowiednimi danymi, pokazującymi, że system oparty na pMGX zawierający pięć genów może być łatwo skonstruowany i wykorzystany do produkcji wszystkich pięciu kodowanych białek w Escherichia coli. Ten system i protokół umożliwia naukowcom rutynową ekspresję złożonych, wieloskładnikowych modułów i szlaków w E. coli.

Celem niniejszego badania była koekspresja pięciu białek z jednego plazmidu. Syntetyczne fragmenty genów zoptymalizowane pod kątem pięciu kodonów, kodujące tagi heksahistydynowe na N- lub C-końcu, zostały zakupione komercyjnie. Syntetyczne geny namnożono metodą PCR, a następnie indywidualnie sklonowano do wektora PCR-blunt i poddano sekwencjonowaniu. W celu wytworzenia plazmidu policistronowego, pięć genów docelowych sklonowano najpierw do odpowiedniego plazmidu pMGX, pMGX-A. <strong clas...

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest konstrukcja syntetycznych operonów wielogenowych pod kontrolą indukowalnej polimerazy RNA T7 w celu jednoczesnej ekspresji wielu białek. Metoda ta może pomóc badaczom w dziedzinie biologii syntetycznej i biochemii, umożliwiając im budowanie wielobiałkowych szlaków lub badanie kompleksów białkowych zależnych od koekspresji przy zastosowaniu wielu podejść. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na jednoczesną ekspresję wielu genów w Escherichia coli z jednego plazmidu.Procedurę z mojego laboratorium zademonstrują Mohamed Hassan, doktorant, oraz Angela Thompson, studentka programu Co-op. Po uzyskaniu i amplifikacji interesujących genów zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować reakcje trawienia dla pierwszego genu oraz wektora pMGX. Należy zastosować 40 µl reakcji zawierającej od 0,5 do 1,5 µg DNA w obecności enzymu restrykcyjnego.Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie dodać EcoRI i pozwolić na trawienie przez kolejną godzinę. NdeI jest dodawany przed EcoRI, aby zapewnić jego skuteczne trawienie.NdeI jest wrażliwy na długość dwuniciowego DNA po obu stronach miejsca restrykcyjnego. Dodanie go w

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Berens, C. i in. Zastosowanie systemu indukowalnej ekspresji do badania interferencji czynników zjadliwości bakteryjnej z sygnalizacją wewnątrzkomórkową. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do identyfikacji, gdzie bakteryjne białko efektorowe CaeB zakłóca apoptotyczną kaskadę gospodarza. Opisuje ona kroki transfekujące komórki ekspresujące CaeB za pomocą systemu reagującego na tetracyklinę, aby indukować ekspresję genów pro-apoptotycznej w...

Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę indukowalnej koekspresji wielu genów za pomocą polimerazy T7 i plazmidu pMGX w Escherichia coli. Technika ta umożliwia budowanie wielogenowych operonów syntetycznych do jednoczesnej ekspresji białek.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Przeglądaj więcej filmów