Immunohistochemia na skrawkach parafiny naskórka mysiego z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych

W naskórku. Immunohistochemia jest skutecznym sposobem lokalizacji specyficznych białek w obrębie przedziałów ich ekspresji. W tym filmie prezentujemy niezawodną metodę immunolokalizacji białek w naskórku, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium.

Witajcie, jestem Tammy z laboratorium dr. Turina, znajdującego się w niskim budynku Ottawa Health Research Institute w ramach programu chorób przewlekłych. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę immunohistochemii z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych na sekcjach tkanki naskórka myszy zatopionej w parafinie. W naszym laboratorium zoptymalizowaliśmy protokoły lokalizacji immunologicznej markerów różnicowania naskórka z wykorzystaniem tkanek utrwalonych w BO'S.

W ramach optymalizacji utrzymujemy skórę w pozycji płaskiej, rozkładając ją na ręczniku papierowym przed utrwaleniem. Procedura ta obejmuje wypreparowanie naskórka, utrwalenie, odwodnienie, zatopienie w parafinie oraz cięcie sekcji, usuwanie parafiny, rehydratację, odsłanianie antygenów, znakowanie przeciwciałami, a na koniec montaż i wizualizację za pomocą epifluorescencji. Zacznijmy zatem.

W przypadku myszy noworodkowych nie ma potrzeby golenia skóry grzbietu. Jednak w przypadku starszych myszy z sierścią, należy ogolić skórę na grzbiecie, aby nie utrudniało to wycinania sekcji. Podczas przeprowadzania sekcji należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotykać pęsetą obszarów skóry, które mają zostać wykorzystane w badaniu.

Zatem robimy tak, że umieszczamy pęsetę wokół krawędzi miejsca, w którym będziemy wycinać, a następnie bardzo ostrożnie podnosimy i nacinamy naskórek, pamiętając o tym, aby nie dotykać obszaru, który chcemy wykorzystać w eksperymencie. Podczas utrwalania skóry musimy dopilnować, aby nie zwinięła się ona wewnątrz probówki. Powinna pozostać całkowicie płaska.

Aby temu zapobiec, kładziemy skórę na ręczniku papierowym, tak aby pozostała płaska podczas utrwalania. Gdy skóra jest już odpowiednio rozłożona na ręczniku papierowym, odcinamy lub przycinamy jej brzegi, aby usunąć fragmenty, które mogły zostać uszkodzone pęsetą. Następnie tniemy skórę na bardzo małe kawałki o wymiarach około 2 mm na 2 mm.

Teraz tkanka zostanie utrwalona. Po pocięciu skóry na mniejsze kawałki, zanurz ją w roztworze Bouina. Zamknij probówki zakrętkami, owiń je folią Parafilm i umieść na wytrząsarku obrotowym.

W przypadku inkubacji nocnej ważne jest, aby inkubować w roztworze boin jedynie przez 16 do 18 godzin. Krótszy lub dłuższy czas utrwalania uszkodzi tkankę. Inkubacja dobiegła końca.

Tkankę płucze się w PBS, a następnie w serii roztworów etanolu o stężeniach 30%, 50% i 70%. Można zauważyć, że BO ma żółty kolor i w miarę przeprowadzania płukań, wraz z rozcieńczaniem BO, kolor płuczki staje się coraz mniej żółty. Płukanie wykonuje się dwukrotnie, za każdym razem przez 30 minut.

Po ostatnim przemyciu w etanolu próbki umieszcza się w świeżym 70% etanolu i można je przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania w parafinie. W przypadku tkanek mrożonych integralność tkanki jest lepsza, a próbki mogą być przechowywane przez dłuższy czas. Generalnie jednostki centralne (core facilities) generują bardziej powtarzalne wyniki.

Jeśli jednak dysponują Państwo odpowiednią infrastrukturą oraz wyspecjalizowanym operatorem z odpowiednim doświadczeniem, skrawanie sekcji może być wykonywane wewnętrznie. Nauka przygotowywania wysokiej jakości skrawków jest w pewnym stopniu formą sztuki, dlatego w naszej pracy korzystamy z usług centrum usług wspólnych (core facility).

Po odebraniu preparatów z laboratorium centralnego można zauważyć obecność parafiny na szkiełkach. Szkiełka, na których parafina tworzy cienką warstwę, umieszcza się na statywie owiniętym folią aluminiową (podobnie jak pieczonego ziemniaka) i inkubuje przez pięć minut w temperaturze 55 °C. Po zakończeniu inkubacji należy szybko rozwinąć folię i umieścić szkiełka w toluenie, wykonując trzy płukania po pięć minut każde.

Należy pamiętać, że pięciominutowe płukania powinny być precyzyjnie odmierzone w czasie; zbyt długa inkubacja oraz kontakt z toluenem mogą negatywnie wpłynąć na preparaty. Po wykonaniu trzech płukań i zastosowaniu toluenu, należy szybko przepłukać próbki w 100% etanolu. Jest to bardzo ważny krok, ponieważ etanol i toluen tworzą osad, który mógłby zakłócić przebieg eksperymentu.

Następnie próbki poddaje się rehydratacji poprzez inkubację preparatów przez pięć minut w 90% etanolu, pięć minut w 70% etanolu, a następnie dwukrotnie przez pięć minut w wodzie. Na tym etapie tkanki mogą zostać poddane barwieniu H&E. W tym celu korzystamy również z usług jednostki centralnej (core facility).

W celu odsłonięcia antygenów wlej 500 ml buforu cytrynowego do plastikowego zlewka o pojemności jednego litra i zanurz w nim preparaty. Pamiętaj o zdjęciu metalnego uchwytu przed włożeniem zlewka do mikrofalówki. Podgrzewaj w mikrofalówce z wysoką mocą dwukrotnie przez pięć minut.

Należy pamiętać o otwarciu drzwiczek, aby schłodzić mikrofalówkę pomiędzy dwiema inkubacjami. Po zakończeniu podgrzewania w mikrofalówce należy wyjąć szkiełka z wrzącego buforu cytrynianowego i umieścić je w kuwecie barwiącej z ciepłą wodą. W tym celu stosujemy zwykłą ciepłą wodę z kranu, aby szkiełka powoli schłodziły się z temperatury wrzenia do temperatury pokojowej.

Teraz można przemyć preparaty trzy razy przez pięć minut w PBS, po czym jesteśmy gotowi do rozpoczęcia immunohistochemii. Pierwszą czynnością, którą należy wykonać przed rozpoczęciem barwienia immunologicznego, jest osuszenie obszaru wokół preparatów za pomocą chusteczki papierowej. Aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym przeciwciałami, wyznaczamy obszar wokół preparatów za pomocą blokera w płynie.

Przygotuj komorę nawilżania, umieszczając papier filtracyjny w szalce Petriego. Nasącz go wodą, usuń nadmiar wody i włóż preparaty. Komorę nawilżania stosujemy po to, aby mieć pewność, że w okresach inkubacji preparaty nie wyschną.

Bardzo ważne jest, aby preparaty nie wyschły, ponieważ spowoduje to wzrost tła podczas barwienia. W tym kroku preparaty blokuje się w buforze do inkubacji przez 30 minut. Po blokowaniu należy przenieść preparaty z powrotem do kasetki i inkubować w buforze do płukania.

Usuń nadmiar buforu w ten sam sposób, co poprzednio. Umieść szkiełko z powrotem w komorze nawilżanej i inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu jednej godziny inkubacji umieść preparaty z powrotem w statywie i płucz buforem do płukania trzy razy po 10 minut. Po zakończeniu płukania usuń nadmiar buforu z okolic preparatu za pomocą ręcznika papierowego. Umieść preparaty z powrotem w komorze wilgotnościowej i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem wtórnym; po inkubacji z przeciwciałem wtórnym płucz w trzech zmianach buforu do płukania po 15 minut każda.

Następnie wykonujemy trzy przemycia po pięć minut. W PBS usuwamy wszelkie nadmiary płynów otaczających preparat i wycieramy PBS z tyłu szkiełka, aby móc przymocować szkiełko nakrywkę do szkiełka podstawowego. Używamy roztworu z 2,5% DAB.

Aby ograniczyć blaknięcie, dodać kroplami 80 µL na szkiełka, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie bardzo powoli nałożyć szkiełko nakrywkowe.

Należy uważać, aby nie pozostawić żadnych pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki są problematyczne, ponieważ często osadzają się bezpośrednio na preparacie, dokładnie w miejscu, w którym planowane jest wykonanie zdjęć po wyschnięciu urządzenia mobilnego. Teraz można przystąpić do oglądania preparatów.

Oto widok udanego barwienia z wykorzystaniem filtra FITC. Przy użyciu obiektywu 20x widzimy Claudin six powiązany ze wszystkimi warstwami nadbazalnymi naskórka. Nasze laboratorium jest bardzo zainteresowane ekspresją i lokalizacją klaudyn w naskórku.

W odniesieniu do połączeń ścisłych i tworzenia bariery przepuszczalności naskórka, zaprezentowaliśmy właśnie sposób przeprowadzania immunohistochemii na skórze myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o tym, by skrawki tkanki były płaskie oraz aby upewnić się, że preparaty nie wysychają pomiędzy inkubacjami. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.