Immunohistochemia skrawków parafinowych naskórka myszy przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych

W naskórku. Immunohistochemia jest skutecznym sposobem lokalizowania określonych białek w ich kompartmencie ekspresji. W tym filmie pokazujemy niezawodną metodę immunolokalizacji białka w naskórku, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium.

Cześć, jestem Tammy i pracuję w laboratorium doktora Turina w niskim budynku Instytutu Badań nad Zdrowiem w Ottawie, gdzie prowadzę program chorób przewlekłych. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę immunohistochemiczną z wykorzystaniem przeciwciał fluorescencyjnych na zatopionych w parafinie skrawkach tkanki naskórka myszy. W naszym laboratorium zoptymalizowaliśmy protokoły immunolokalizacji markerów różnicowania naskórka przy użyciu utrwalonej tkanki BO.

W ramach optymalizacji utrzymujemy skórę płaską, układając ją na ręczniku papierowym przed utrwaleniem. Procedura ta polega na rozwarstwieniu naskórka, utrwaleniu, odwodnieniu, zatopieniu parafiny i przecięciu sekcji, dewoskowaniu, rehydratacji, antygenie, demaskowaniu, znakowaniu przeciwciał, a na końcu montażu i wizualizacji za pomocą epifluorescencji. Więc zacznijmy.

Podczas korzystania z myszy noworodkowych nie ma potrzeby golenia skóry pleców. Jednak gdy masz starsze myszy, które mają sierść, musisz zgolić skórę z tyłu, aby nie przeszkadzała w przecinaniu sekcji. Podczas sekcji należy bardzo uważać, aby nie umieszczać kleszczy w obszarach skóry, których chcesz użyć do testu.

Więc to, co robimy, to po prostu kładziemy kleszcze wokół krawędzi miejsca, w którym zamierzamy ciąć, a następnie podnosisz bardzo ostrożnie, przecinasz naskórek, pamiętając, aby nie dotykać obszaru, którego chcesz użyć do swojego eksperymentu. Kiedy naprawiamy skórę, nie chcemy, aby skóra zwinęła się i znalazła w tubie. Chcemy, żeby było ładnie i płasko.

Więc to, co robimy, aby temu zapobiec, to kładziemy skórę na ręczniku papierowym, tak aby pozostała płaska podczas mocowania. Więc teraz, gdy mamy już ładną i płaską skórę na ręczniku papierowym, to, co robimy, to odcinamy krawędzie lub przycinamy je, aby usunąć części, które mogliśmy uszkodzić kleszczami. A następnie kroisz skórę na bardzo małe kawałki o wymiarach około dwa milimetry na dwa milimetry.

Teraz tkanka zostanie naprawiona. Po pokrojeniu skóry na łatwe do ułożenia kawałki zanurza się ją w roztworze boin. Zakryj rurki, owiń je perfilem i połóż je na kołysce.

W przypadku inkubacji przez noc ważne jest, aby inkubować w roztworze boina tylko od 16 do 18 godzin. Krótsze lub dłuższe okresy fiksacji uszkodzą twoją tkankę. Inkubacja dobiegła końca.

Spłukujesz tkankę PBS, a następnie przeprowadzasz serię płukań etanolem przy użyciu 30%50% i 70% alkoholu. Widać, że BO ma żółty kolor i że w miarę prania, gdy dobrodziejstwa są rozcieńczane, kolor prania staje się coraz mniej żółty. Myjesz się dwa razy po 30 minut za każdym razem.

Po ostatnim myciu w etanolu próbki umieszcza się w świeżym 70% etanolu i można je przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetworzenia kilku otworów wentylacyjnych parafiny. Osadzanie. Nadużywanie zamrożonych tkanek polega na tym, że integralność tkanek jest lepsza, a próbki mogą być przechowywane przez długi czas. Ogólnie rzecz biorąc, główne obiekty generują bardziej powtarzalne wyniki.

Jeśli jednak dysponujesz odpowiednim obiektem i dedykowanym operatorem, który ma specjalistyczną wiedzę, sekcje można ciąć we własnym zakresie. Nauka wycinania dobrych odcinków jest raczej formą sztuki. W związku z tym korzystamy z obiektu podstawowego.

Po otrzymaniu szkiełek z powrotem z obiektu Core można zobaczyć, że parafina jest obecna na szkiełkach. Jako cienka folia szkiełka umieszcza się na stojaku owiniętym folią aluminiową, podobnie jak pieczony ziemniak i inkubuje przez pięć minut w temperaturze 55 stopni. Po zakończeniu inkubacji szybko rozpakuj szkiełka i umieść je w toluenie na trzy prania po pięć minut.

Bardzo ważne jest, aby pamiętać, że te pięciominutowe myjki powinny być dobrze wymierzone w czasie, inkubować zbyt długo, a toluen nie będzie dobry dla twoich próbek. Po trzech praniach i toluenie szybko spłucz w stuprocentowym etanolu. Ponieważ etanol i toluen tworzą osad, który będzie zakłócał eksperyment, jest to bardzo ważny krok, o którym należy pamiętać.

Następnie próbki są ponownie uwodnione przez szkiełka inkubacyjne, pięć minut w 95% etanolu, pięć minut w 70% etanolu, a następnie dwa razy po pięć minut w wodzie. W tym momencie tkanki można przetworzyć do barwienia za pomocą h i e. W tym celu wykorzystujemy również główny obiekt.

Do demaskowania antygenu słabe 500 milili jednorazowego buforu cytrynianowego do litrowej plastikowej zlewki i zanurz szkiełka. Pamiętaj, aby zdjąć metalowy uchwyt i włożyć zlewkę do kuchenki mikrofalowej. Kuchenka mikrofalowa z dużą mocą przez dwa razy po pięć minut.

Pamiętaj, aby otworzyć drzwiczki, aby schłodzić kuchenkę mikrofalową pomiędzy dwiema inkubacjami. Po zakończeniu podgrzewania w kuchence mikrofalowej wyjmij szkiełka z wrzącego buforu cytrynianu i umieść je w naczyniu barwiącym zawierającym ciepłą wodę. Po prostu używamy ciepłej wody z kranu, a celem tego jest powolne schładzanie szkiełek od wrzenia do temperatury pokojowej.

Teraz możesz umyć szkiełka trzy razy po pięć minut w PBS i jesteśmy gotowi do rozpoczęcia immunohistochemii. Pierwszą rzeczą, którą musimy zrobić, aby rozpocząć barwienie immunologiczne, jest wysuszenie obszaru wokół naszych próbek kawałkiem bibuły. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu przeciwciałami, wyznaczamy obszar wokół naszych próbek za pomocą płynnego blokera.

Przygotuj nawilżoną komorę, umieszczając bibułę filtracyjną na szalce Petriego. Namocz go w wodzie, usuń nadmiar wody i włóż szkiełka. Powodem, dla którego używamy wilgotnej komory, jest zapewnienie, że podczas naszych okresów inkubacji nasze szkiełka nie wysychają.

Bardzo ważne jest, aby slajdy nie wyschły, ponieważ rysowanie zwiększy tło. Szkiełka są w tym czasie blokowane buforem inkubacyjnym na 30 minut. Po zablokowaniu przenieś szkiełka z powrotem do stojaka na szkiełka i inkubuj w buforze do mycia.

Usuń nadmiar bufora, tak jak wcześniej. Umieść szkiełko z powrotem w wilgotnej komorze i inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym przez godzinę. W temperaturze pokojowej.

Po upływie godzinnej inkubacji włóż szkiełka z powrotem do stojaka na szkiełka i myj buforem do płukania trzy razy po 10 minut. Po umyciu usuń nadmiar buforu do płukania z okolic próbki za pomocą bibuły. Umieścić szkiełka z powrotem w wilgotnej komorze i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym, po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym, przemyć trzy zmiany buforu do przemywania po 15 minut każda.

Następnie myjemy trzy razy po pięć minut. W PBS usuń nadmiar płynów otaczających próbkę i wytrzyj PBS z tyłu szkiełka, aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełku. Korzystamy z telefonu komórkowego z 2,5% DAB co.

Aby zmniejszyć blaknięcie, dodaj do szkiełek 80 mikrolitrów kropli. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych bąbelków. Następnie bardzo powoli opuszczaj się na szkiełku nakrywkowym.

Uważając, aby nie pozostawić żadnych bąbelków. Bąbelki są złe, ponieważ często lądują bezpośrednio na twoim okazie, dokładnie tam, gdzie chcesz zrobić zdjęcia po wyschnięciu telefonu komórkowego. Teraz możesz przejść do trybu Spójrz na swoje slajdy.

Oto spojrzenie na udane barwienie przy użyciu filtra FITC. W obiektywie 20x widzimy Clain six związany ze wszystkimi super podstawnymi warstwami naskórka. Nasze laboratorium jest bardzo zainteresowane ekspresją i lokalizacją klaudyn w naskórku.

Jeśli chodzi o ścisłe połączenia i tworzenie bariery przepuszczalności naskórka, właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić immunohistochemię na skórze myszy. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że chcesz, aby skrawki tkanek były płaskie i że chcesz mieć pewność, że szkiełka nie wyschną między inkubacjami. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.