Name: Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę ekotoksykologiczną z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska. Protokół umożliwia wyznaczenie wartości LC50 dla toksycznych substancji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez projekt badawczy: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per il monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ("Nano-Biotechnologia: środowisko i zdrowie. Projekt 2: Środowisko. Narzędzia i metody ekotoksykologicznego monitorowania nanocząstek") przyznanej LM przez Region Lazio-Consorzio Hypatia. AR został sfinansowany z grantu podoktorskiego Uniwersytetu Tor Vergata/Regione Lazio-Consorzio Hypatia w ramach wcześniej cytowanego projektu. Umowa z Uniwersytetem ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) umożliwiła wzajemne korzystanie z obiektów i wymianę naukowców.
Autorzy są wdzięczni prof. Marii Cristinie Thaller, naszemu aniołowi stróżowi, za wszystkie działania mikrobiologiczne, za wzbudzenie zainteresowania światem mikroorganizmów i za znaczącą pomoc w ulepszaniu naszych badań nad tym zagadnieniem. Autorzy dziękują Andrei Tornambè i Erice Magaletti za cenną współpracę z ISPRA Laboratorium Ekologii Fitoplanktonu i Ekotoksykologii.

1. Przygotowanie odczynników/materiałów
<ol>
	<li>Przygotować (około 300) sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml do seryjnego rozcieńczania zawiesin bakteryjnych, a także sterylne probówki o pojemności 15 ml jako pojemniki testowe oznaczone stężeniami testowymi.</li>
	<li>Przygotuj 2% roztwór NaCl jako pożywkę ekspozycyjną i wysterylizuj go. Alternatywnie użyj sterylizowanej syntetycznej lub naturalnej wody morskiej o zasoleniu od 5 do 40.</li>
	<li>Przygotuj tryptyczny agar sojowy (TSA) z 2% NaCl zgodnie ze wskazówkami na etykiecie i biorąc pod uwagę ilość NaCl już obecnego w pożywce.</li>
	<li>Wlać TSA (chłodną, ale nadal płynną) do 90-milimetrowych szalek Petriego, uprzednio oznaczonych badanym stężeniem i czasem ekspozycji, liczbą powtórzeń i współczynnikiem rozcieńczenia; 19 ml to odpowiednia objętość.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do uprawy bulionu sojowego tryptycznego (TSB) zgodnie ze wskazówkami na etykiecie. Dodać odpowiednią ilość NaCl, aby uzyskać takie samo zasolenie jak podłoże ekspozycyjne.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowyCuSO4 z wodą podwójnie destylowaną i wysterylizować (niezbędną) porcję za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. W przypadku próbek środowiskowych należy przygotować odpowiedni odstęp między rozcieńczeniami próbki i wysterylizować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować roztwory testowe w probówkach o pojemności 15 ml oznaczonych stężeniami testowymi. Wypełnić kontrolę ujemną 5 ml pożywki ekspozycyjnej (2% NaCl). Napełnić pozostałe probówki odpowiednią ilością pożywki ekspozycyjnej i roztworu podstawowegoCuSO4 w celu uzyskania badanych stężeń w końcowej objętości 5 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
<ol>
	<li>Na 12-18 godzin przed badaniem należy przygotować płynną świeżą kulturę Vibrio anguillarum. Za pomocą sterylnej pętli wybierz pojedynczą, dobrze odizolowaną kolonię z nocnej hodowli na stałym podłożu (TSA). Zaszczepić probówkę wypełnioną 10 ml TSB i inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 25 °C przez 12-18 godzin.</li>
	<li>Po 12-18 godzinach należy oszacujeć stężenie bakterii w inokulum spektrofotometrycznie. Wirować inokulum i zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 600 nm, używając TSB jako ślepej próby.</li>
	<li>Aby uzyskać znane stężenie bakterii, rozcieńczyć 2 ml inokulum z wirem, dodając ilość TSB obliczoną według tego wzoru: 
	TSB ml = [(OD / 0,14) * 2] - 2.</li>
	<li>Sprawdzić, czy gęstość optyczna rozcieńczonego inokulum wynosi 0,140 (±0,005), co odpowiada 0,5 punktu na wzorcu nefelometrycznym McFarlanda.</li>
	<li>Odwirować rozcieńczony inokulum przez 10 minut w temperaturze 3 000 g. Wyeliminuj supernatant i ponownie zawiesić osad mikrobiologiczny w 1 ml 2% roztworu NaCl (pożywka ekspozycyjna).</li>
</ol>
3. Testowanie ekspozycji
<ol>
	<li>Dodać 150 μl ponownie zawieszonego inokulum bakteryjnego do każdej probówki, łącznie z kontrolą. Zawiesiny V. anguillarum inkubować przez 6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności i w ciągłym wstrząsaniu, aby uniknąć sedymentacji.</li>
	<li>Na początku (T0) i na końcu (T6) czasu narażenia należy przeprowadzić zliczanie bakterii we wszystkich narażonych zawiesinach bakteryjnych przy użyciu metod liczenia jednostek tworzących kolonie (CFU).</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej odsłoniętej zawiesiny bakteryjnej w trzech egzemplarzach, stosując dziesięciokrotny współczynnik rozcieńczenia (do 10-5). Dodać 100 μl każdej zawiesiny bakteryjnej do odpowiedniej probówki już wypełnionej 900 μl pożywki ekspozycyjnej (2% NaCl). Kontynuuj seryjne rozcieńczanie, wirując na każdym kroku, aby ponownie zawiesić bakterie.</li>
	<li>Umieścić 10 μl rozcieńczeń 10-4 i 10-5 na płytkach Petriego TSA w odpowiednim segmencie. Szybko pozwól kroplom ślizgać się po małym okręgu, obracając płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 48 godzin.</li>
</ol>
4. Liczenie CFU
<ol>
	<li>Po 48 godzinach policz kolonie wyhodowane na szalkach Petriego; płytki zawierające od 5 do 50 kolonii są optymalne do dokładnego liczenia.</li>
	<li>Obliczyć liczbę żywotnych bakterii na ml każdej narażonej zawiesiny bakteryjnej, stosując następujące wzory: 
	10-4 → jtk/ml = nr jtk x 100 x 10 000 
	10-5 → jtk/ml = zero jtk x 100 x 100 000</li>
	<li>Średnią z liczb uzyskanych w równoległych powtórzeniach należy wykorzystać do oceny śmiertelności w porównaniu z kontrolą. Oblicz śmiertelność w procentach za pomocą następującego wzoru: 
	M% = 100 - [(Nie dotyczy) * 100] 
	UWAGA: Gdzie N = liczba jtk/ml wyhodowanych po narażeniu na działanie substancji toksycznej; C = liczba jtk wyhodowanych w pożywce kontrolnej.</li>
	<li>Oblicz LC50 (tj. stężenie substancji toksycznej, które zmniejsza liczbę aktywnie replikujących się bakterii o 50% na ml; CFU/ml) z analizą regresji nieliniowej przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów). Przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy t post-hoc parami, aby ocenić istotne różnice między terapiami.</li>
</ol>

<ol><li>Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information">http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information</a> (2008).</li>
<li>Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+advantages+of+implementing+luminescence+inhibition+test+%28Vibrio+fischeri%29+for+acute+toxicity+prediction+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environm.+Internat%22%5BJournal%5D)">A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals.</a> Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).</li>
<li>Rad, M., Shahsavani, D. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/veterinary/issues/vet-10-34-4/vet-34-4-15-0812-5.pdf">Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish.</a> Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).</li>
<li>Thompson, F., Iida, T., Swings, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15353563">Biodiversity of Vibrios.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).</li>
<li>Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAustin%2C+B+%22Bacterial+Fish+Pathogens%3A+Disease+of+Farmed+and+Wild+Fish%22">Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish</a>. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).</li>
<li>Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).</li>
<li>Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+the+13+priority+pollutant+metals+to+Vibrio+fisheri+in+the+Microtox+chronic+toxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test.</a> Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).</li>
<li>Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+Tetracycline+trigger+the+E.+coli+growth%3A+a+case+of+hormetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response.</a> Dose-Response. 11, 550-557 (2013).</li>
<li>Adams, M. S., Stauber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+whole-sediment+toxicity+test+using+a+benthic+marine+microalga%5BTitle%5D)+AND+%22Environm.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga.</a> Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).</li>
<li>Manfra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+of+diEthylene+Glycol+and+risk+assessment+for+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mat%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment.</a> J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microtox%C2%AE+Acute+Toxicity+Solid-Phase+Test%22">Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test</a>. , Azur Environmental. 20 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.rsambiente.it/data/photo/APAT%20CNR%20IRSA%201030%20Man%2029%202003.pdf">Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines).</a> Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030(2003).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+kinetic+Vibrio+fischeri+bioluminescence+inhibition+assay+for+study+of+toxic+effects+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles.</a> Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).</li>
<li>Bondarenko, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilaboratory+evaluation+of+15+bioassays+for+%28eco%29+toxicity+screening+and+hazard+ranking+of+engineered+nanomaterials%3A+FP7+project+NANOVALID%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID.</a> Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).</li>
<li>Matranga, V., Corsi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+engineered+nanoparticles+in+the+marine+environment%3A+model+organisms+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Envir.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches.</a> Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).</li>
<li>Corsi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+strategies+and+technologies+for+the+ecosafety+assessment+and+design+of+nanomaterials+entering+the+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+NANO%22%5BJournal%5D)">Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment.</a> ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).</li>
<li>Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecotoxicology+and+chemistry+of+manufactured+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).</li>
<li>Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CuO+nanoparticles+to+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+BY4741+wild-type+and+its+nine+isogenic+single-gene+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants.</a> Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).</li>
<li>Ivask, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+toxic+action+of+Ag%2C+ZnO+and+CuO+nanoparticles+to+selected+ecotoxicological+test+organisms+and+mammalian+cells+in+vitro%3A+A+comparative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review.</a> Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszej pracy opisano nowy test biologiczny z bakterią morską V. anguillarum , który został z powodzeniem zastosowany do oceny toksycznego działania CuSO4, referencyjnego środka toksycznego, wykazując wyraźną zależność między dawką a reakcją. Bakteria morska V. anguillarum została wybrana jako organizm modelowy, ponieważ jest halotolerancyjna, wszechobecna i reprezentatywna dla ekosystemów morskich.
Test może być wykonywany w szerokim zakresie wartości zasolenia (5-40) i może wykorzystywać roztwory soli oraz syntetyczne lub naturalne wody morskie jako medium ekspozycyjne, o ile mikroorganizmy mogą z łatwością przetrwać przez cały czas trwania testu. Pozwala to na analizę różnego rodzaju próbek, w tym środowisk słonawych i morskich.
W fazie ekspozycji nie jest wymagana żadna pożywka wzrostowa, co pozwala uniknąć jego ingerencji w zanieczyszczenia8 i jego ewentualnego wpływu na odpowiedź biologiczną. Protokół jest niezawodny, szybki, opłacalny i stosunkowo łatwy. Procedura mikrozliczania cieczy na płytkę9 ma tę zaletę, że wykorzystuje małe objętości (próbki), chociaż oznacza to wysoki stopień dokładności i wytrzymałości. Wyniki trzech niezależnych badań i powtórzeń dla każdego leczenia wskazują na wysoką powtarzalność tej metody. Wykorzystanie bakterii jako modelu biologicznego, a także zdolność adaptacyjna tej techniki, sprzyjają ekologicznemu i środowiskowemu znaczeniu tej procedury. Innymi krytycznymi kwestiami technicznymi są dokładność w przygotowaniu inokulum bakteryjnego i sterylność wymagana na niektórych etapach procedury.
Proponowany test jest szybszy (6 godzin) niż inne morskie testy ekotoksykologiczne (24-96 godzin) i nie stwarza problemów etycznych wynikających z wykorzystania organizmów wyższych. Ponadto dane dotyczące referencyjnej substancji toksycznej wskazują na wartości LC50 porównywalne z wartościami uzyskanymi w ostrych badaniach na innych gatunkach morskich10,11, co świadczy o dobrej czułości. Wśród testów biologicznych bakterii test inhibicji luminescencji V. fischeri jest najbardziej powszechny i dobrze standaryzowany12. Ten test biologiczny jest bardzo szybki (15-30 min) i ważny do badania próbek w fazie stałej, ale mogą na niego wpływać kolorowe i mętne próbki, które zakłócają pomiary luminescencji. Zasolenie jest czynnikiem ograniczającym w stosowaniu wyżej wymienionego testu, przy czym wymagane jest 2% NaCl13. Wręcz przeciwnie, proponowany tutaj test z V. anguillarum daje przystępne cenowo wyniki w szerokim zakresie wartości zasolenia, nie ma ograniczeń w odniesieniu do mętnych lub kolorowych próbek i wymaga tańszego sprzętu w porównaniu z analizatorami luminescencji. Porównanie wyników naszego badania z wynikami dostępnymi w literaturze dla V. fisheri 14,15,16 pokazuje porównywalne wartości EC50, co dodatkowo potwierdza skuteczność tego testu biologicznego.
Ten test biologiczny ocenia zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii, ogólnie określane jako śmiertelność, zamiast tempa wzrostu populacji lub zahamowania aktywności enzymatycznej, które są stosowane w obecnie dostępnych testach dla mikroorganizmów. Obliczenie LC50 pozwala na porównanie z innymi testami biologicznymi powszechnie stosowanymi do oceny ekotoksykologicznej środowisk morskich, w których często punktem końcowym jest przeżycie/śmiertelność. Pilnie konieczne jest przeprowadzenie ćwiczeń interkalibracyjnych w celu oceny/potwierdzenia wiarygodności i odtwarzalności tego testu oraz wsparcia jego standaryzacji i stosowania w protokołach regulacyjnych.
Coraz powszechniejsze stosowanie nanomateriałów i ich potencjalne uwalnianie do środowiska pociąga za sobą konieczność przeprowadzenia oceny ryzyka17 . Wydaje się jednak, że klasyczne podejścia (ekotoksykologiczne) do tych pojawiających się zanieczyszczeń nie dają przystępnych wyników i mogą wymagać pewnych dostosowań18. Charakterystyka tego nowego testu biologicznego pozwala na jego łatwe i użyteczne zastosowanie do oceny toksyczności nanocząstek. W rzeczywistości możliwość przeprowadzenia testu przy różnym zasoleniu dostarczy informacji na temat zachowania nanocząstek przy różnych stężeniach jonowych, co jest zmienną parametru środowiskowego, która może znacząco wpłynąć na toksyczność19. Ponadto w ocenach ekotoksyczności nanocząstek nie zaleca się szczególnie stosowania pożywki wzrostowej i składników odżywczych, ponieważ substancje organiczne mogą ułatwiać ich wchłanianie poprzez zwiększenie skutków toksycznych20 lub mogą powodować agregację, zmniejszając biodostępną frakcję, a tym samym ich toksyczność21.
Podsumowując, test biologiczny na Vibrio anguillarum jest obiecującym narzędziem do oceny ryzyka związanego z klasycznymi i pojawiającymi się zanieczyszczeniami, a także do oceny stanu środowiska morskiego i słonawego.

Ekotoksykologiczne testy biologiczne oceniają toksyczność substancji chemicznych lub próbek środowiskowych za pomocą standardowych modeli biologicznych, integrując wpływ fizycznych, chemicznych i biologicznych czynników stresogennych na ekosystemy. Ze względu na złożoność ekosystemów oceny ryzyka ekotoksykologicznego muszą uwzględniać zestaw testów biologicznych, które obejmują organizmy z różnych poziomów troficznych. Testy toksyczności na zwierzętach laboratoryjnych mogą być kosztowne, czasochłonne i wątpliwe etycznie. Dążenie do ograniczenia testów na zwierzętach i opracowania alternatywnych podejść (np. na bakteriach i zwierzętach bezkręgowych) jest obecnie kluczową kwestią, o czym informują obowiązujące prawodawstwo europejskie, w tym dyrektywa UE w sprawie ochrony zwierząt, 7. poprawka do dyrektywy kosmetycznej UE oraz REACH.
Skorupiaki, ryby i glony są głównie używane do pomiarów toksyczności w środowisku morskim1. Bakterie są ważnym elementem ekosystemu, a zmiany w zbiorowiskach mikrobiologicznych mogą mieć znaczący wpływ na cykl biogeochemiczny i inne krytyczne usługi ekosystemowe. Testy toksyczności oparte na mikroorganizmach zyskują na popularności, ponieważ są stosunkowo szybkie, powtarzalne i tanie oraz nie budzą wątpliwości etycznych2. Celem niniejszej pracy jest opisanie protokołu ekotoksykologicznego służącego do oceny odpowiedzi bakterii morskiej Vibrio anguillarum (Listonella anguillarum, Vibrionaceae) na narażenie na zanieczyszczenia środowiskowe.
V. anguillarum to Gram-ujemna, krótka, zakrzywiona bakteria pręcikowa (0,5 x 1,5 μm) z polarną wicią. Zazwyczaj występuje w słonawej lub słonej wodzie, jest halotolerancyjny, o optymalnym zasoleniu około 20 i optymalnej temperaturze między 25 a 30 °C3. Został wybrany jako model organizmu ze względu na jego wszechobecność i ważną rolę ekologiczną w oceanach na całym świecie4. Wiadomo, że niektóre serotypy V. anguillarum powodują wibriozę u różnych gatunków ryb morskich lub słonawych5,6. W tym celu niektóre etapy eksperymentu wymagają standardowych praktyk mikrobiologicznych, ale nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt ochronny ani środki ostrożności. Proponowany protokół badania toksyczności wykorzystuje zdolność do hodowli bakterii (tj. zdolność do replikacji i tworzenia kolonii) jako punkt końcowy i pozwala na określenie LC50, stężenia, które powoduje 50% redukcję bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie, po 6-godzinnej ekspozycji. W Vibrio, podobnie jak u innych drobnoustrojów, ta redukcja, którą ogólnie określamy jako śmiertelność, może być częściowo spowodowana przez osobniki w fazie żywotnej, ale niehodowlanej (VBNC)7. W tym badaniu zastosowaliśmy tę metodę do pomiaru toksycznego działania siarczanu miedzi (CuSO4), referencyjnego środka toksycznego.
Ta metoda została opracowana, aby zapewnić odpowiedni, oparty na mikroorganizmach test do oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń/związków chemicznych, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały. Nowatorstwo tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami stosowanymi w odniesieniu do mikroorganizmów jest związane głównie z podłożem ekspozycyjnym i punktem końcowym. W rzeczywistości ekspozycja odbywa się w roztworze soli, unikając ewentualnej interferencji pożywki wzrostowej z badanymi zanieczyszczeniami, które mogą wpływać na odpowiedź biologiczną8. Punktem końcowym jest zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii, które można łatwo porównać z innymi ostrymi punktami końcowymi stosowanymi do ekotoksykologicznych badań przesiewowych w środowiskach morskich/słonawych, w oparciu o przeżywalność/śmiertelność. Co więcej, w protokole wykorzystano technikę mikroliczenia ciecz do płytki, stosowaną już w przypadku E. coli9, zmniejszając objętość, a tym samym wysiłek eksperymentalny (szczegóły w krokach 3.3 i 3.4 protokołu).

<table><tbody><tr><td>Vibrio anguillarum (szczep AL 102, serotyp O1)</td><td></td><td></td><td>Uzyskany z kolekcji laboratoryjnej NOIFMA (Norwegia)</td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy&nbsp;</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Odwodnione podłoże hodowlane</td></tr><tr><td>Pożywka do produkcji bulionu sojowego</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Odwodnione podłoże hodowlane</td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa sprzętu<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Okap laminarny bezpieczeństwa biologicznego&nbsp;</td>Inkubator <td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fratelli Galli</td><td>Mod. 2100</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa oprogramowania</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Benchmark Dose Software&nbsp;</td>Dawka wzorcowa <td>US EPA</td><td>2.4.0&nbsp;</td><td>Rok 2012</td></tr></tbody></table>

metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bakterie są ważnym składnikiem ekosystemu, a zmiany w zbiorowiskach mikroorganizmów mogą mieć znaczący wpływ na cykl biogeochemiczny i sieci pokarmowe. Testy toksyczności oparte na mikroorganizmach są szeroko stosowane, ponieważ są stosunkowo szybkie, powtarzalne, tanie i nie wiążą się z kwestiami etycznymi. W tym miejscu opisujemy ekotoksykologiczną metodę oceny odpowiedzi biologicznej bakterii morskiej Vibrio anguillarum. Metoda ta ocenia ostrą toksyczność związków chemicznych, w tym nowych zanieczyszczeń, takich jak nanocząstki, a także próbek środowiskowych. Punktem końcowym jest zmniejszenie zdolności do hodowli bakterii (tj. zdolności do replikacji i tworzenia kolonii) w wyniku narażenia na działanie substancji toksycznej. Spadek ten można ogólnie określić mianem śmiertelności. Test pozwala na określenie LC50, stężenia, które powoduje 50% spadek bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie, po 6 godzinach ekspozycji. Bakterie zdolne do hodowli są liczone w jednostkach tworzących kolonie (CFU), a "śmiertelność" jest oceniana i porównywana z kontrolą. W niniejszej pracy oceniono toksyczność siarczanu miedzi (CuSO4). Po trzech niezależnych testach zaobserwowano wyraźną zależność między dawką a reakcją, ze średnią LC50 wynoszącą 1,13 mg/l. Protokół ten, w porównaniu z istniejącymi metodami z mikroorganizmami, ma zastosowanie w szerszym zakresie zasolenia i nie ma ograniczeń dla próbek barwionych/mętnych. Jako medium ekspozycyjne wykorzystuje roztwór soli fizjologicznej, unikając ewentualnych zakłóceń podłoża wzrostowego z badanymi zanieczyszczeniami. Obliczenia LC50 ułatwiają porównania z innymi testami biologicznymi powszechnie stosowanymi do ocen ekotoksykologicznych środowiska morskiego.

Wyniki trzech niezależnych prób narażenia V. anguillarum na cztery stężenia CuSO4 wykazują wyraźną zależność dawka-odpowiedź oraz istotny spadek liczby bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie wraz ze wzrostem stężenia toksykantu referencyjnego (Rysunek 1; ANOVA, F = 20,28, p &lt;0,001). Liczba CFU/mL jest istotnie zredukowana przy 1,25 mg/L (test post-hoc Tukeya, p &lt;0,05) w porównaniu z kontrolą (CNTR). Przy najwyższym badanym stężeniu nie wykryto żadnych bakterii zdolnych do hodowli. Nie stwierdzono różnic w toksyczności CuSO4 w szerokim zakresie zasolenia medium ekspozycyjnego (tj. 5, 20 lub 35 g/L NaCl, dane nie pokazano). Reprezentatywny wynik analizy statystycznej przedstawiający regresję nieliniową został zamieszczony w Rysunku dodatkowym 1. Wartości LC50 obliczone dla trzech niezależnych prób (Tabela 1) potwierdzają wykonalność i powtarzalność tej metody.
<img alt="Wykres hamowania wzrostu bakterii, stężenie CuSO4 względem liczby CFU, przedstawiający procent redukcji." src="/files/ftp_upload/55211/55211fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Vibrio anguillarum poddane działaniu CuSO4. Średnia liczba CFU/mL (CFU = jednostka tworząca kolonię) po ekspozycji na różne stężenia CuSO4 przez 6 h. Wartości przedstawiają średnią (±SD) z trzech niezależnych prób. Redukcje bakterii aktywnie replikujących się i tworzących kolonie w stosunku do kontroli (CNTR) przedstawiono w żółtych polach (w procentach). Istotne różnice względem kontroli, określone na podstawie testu post-hoc Tukeya, zaznaczono gwiazdkami (* = p &lt;0.05; ** = p &lt;0.01). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55211/55211fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela wyników toksyczności CuSO4 przedstawiająca wartości LC50, granice dolne i górne dla trzech prób oraz średnią ±SD." src="/files/ftp_upload/55211/55211table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Wartości stężenia letalnego (LC50) dla Vibrio anguillarum eksponowanych na CuSO4. Przedstawiono wyniki trzech niezależnych prób oraz wartości średnie (± SD).
 
Rycina uzupełniająca 1: Analiza regresji nieliniowej. Reprezentatywny wynik analizy regresji nieliniowej (model Logit-Hill) przeprowadzonej na wynikach testu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55211/suppl_fig_1.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Ta praca opisuje nowy protokół oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń, w tym pojawiających się zanieczyszczeń, takich jak nanomateriały, przy użyciu morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Metoda ta pozwala na określenie LC50, czyli śmiertelności, stężenia, które powoduje 50% spadek zdolności hodowli bakterii, po 6 godzinach ekspozycji.

Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Jesteśmy badaczami z Uniwersytetu Tor Vergata w Włoskim Instytucie Ochrony Środowiska i Badań w Rzymie. Opracowujemy narzędzia do oceny wpływu zanieczyszczeń na środowisko oraz identyfikujemy organizmy modelowe jako bioindykatory. Pracujemy w laboratorium ekotoksykologii w Katedrze Biologii Uniwersytetu Tor Vergata.W tym filmie opisujemy metodę ekotoksykologiczną służącą do oceny odpowiedzi biologicznej morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Film obejmuje wszystkie etapy przygotowania i przeprowadzania testów toksyczności. Oprócz standardowego wyposażenia laboratoryjnego należy przygotować następujące materiały.Probówki o pojemności 1,5 ml do rozcieńczeń seryjnych zawiesin bakteryjnych. Szalki Petriego o średnicy 90 mm do wysiewu bakterii. Wymagane są co najmniej dwie szalki dla każdego stężenia testowego, wliczając próbę kontrolną.Oznacz boki szalek Petri odpowiednim stężeniem testowym i czasem ekspozycji. Narysuj na dnie szalek Petri sześć sekcji i oznacz je numerem powtórzenia oraz stopniem rozcieńczenia. Jako naczynia testowe wykorzystaj sterylne probówki o pojemności 15 ml, oznaczone stężeniami testowymi.W tym badaniu jako medium ekspozycyjne zastosowano 2% sterylną roztwór chlorku sodu. Można również użyć wysterylizowanej syntetycznej lub naturalnej wody morskiej o stężeniu początkowym od 5 do 40 g/l. Należy przygotować odpowiednią ilość pożywki agarowej sojowo-tryptycznej z dodatkiem 2% chlorku sodu.Dodać chlorek sodu, uwzględniając ilość już obecną w medium, aby osiągnąć końcowe stężenie 2%. Poddać sterylizacji, a po wystudzeniu, gdy ciecz nadal pozostaje płynna, przelać do wcześniej oznakowanych szalek Petriego. Przygotować bulion sojowo-tryptyczny jako medium hodowlane z chlorkiem sodu.Dodać chlorek sodu, aby uzyskać taką samą zasolenie medium ekspozycyjnego. Należy zawsze uwzględnić ilość chlorku sodu już obecnego w medium. W tej próbie zastosowano bulion sojowy z tryptonem z dodatkiem 2% sodium chloride.Zesterylizować go i pozostawić do ostygnięcia przed użyciem. W niniejszym badaniu jako toksykant referencyjny wykorzystujemy siarczan miedzi. Przygotować roztwór stokowy w wodzie dwukrotnie destylowanej i przechowywać go w temperaturze 4 °C.Przesterylizuj niezbędną alikwot używając filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,22 mikrona. W przypadku próbek środowiskowych przygotuj odpowiedni szereg rozcieńczeń próbki. Jako naczynia testowe wykorzystaj probówki o pojemności 15 mililitrów.Napełnić probówki ekspozycyjne medium ekspozycyjnym. Przygotować pięć mililitrów kontroli negatywnej. Przygotować probówki ekspozycyjne z odpowiednią ilością medium ekspozycyjnego i roztworu zapasu siarczanu miedzi, aby uzyskać stężenie testowe w końcowej objętości pięciu mililitrów.Ten test wymaga świeżej hodowli Vibrio anguillarum. Za pomocą sterylnej pętli należy wybrać pojedynczą, dobrze odseparowaną kolonię z płytki z agarem. Zaszczepić ją tą bakterią z poprzednich dni.Trzymając probówkę pod kątem, wykonaj posiew pętlą z inokulum na powierzchni probówki. Wypełnij ją 10 milliliters bulionu sojowo-tryptycznego. Inkubuj kulturę bakteryjną w temperaturze 25 degrees C przez 12-18 godzin.Stężenie bakterii w inokulum szacuje się spektrofotometrycznie. Inokulum należy wymieszać w wstrząsaciu typu vortex, a następnie zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 600 nanometrów. W ramach próbki zerowej (blank) należy użyć bulionu sojowo-tryptonowego.Aby uzyskać znaną stężenie bakterii, rozcieńczyć dwa mililitry wymieszanego w wortexie inokulum, dodając ilość bulionu sojowego z trypsyną obliczoną według tej formuły. Zweryfikować, czy gęstość optyczna rozcieńczonego inokulum wynosi 0,14, co odpowiada punktowi 0,5 standardu nefelometrycznego McFarlanda. Odwirować rozcieńczone inokulum przez 10 minut przy 3 000 g.Odciąć supernatant i zawiesić osad drobnoustrojów w jednym mililitrze 2% roztworu chlorku sodu. Do każdej probówki dodać 150 µL zawiesiny bakteryjnej. Zawiesinę Vibrio anguillarum inkubować przez sześć godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, przy ciągłym mieszaniu w celu uniknięcia sedymentacji.Na początku oraz po sześciu godzinach ekspozycji przeprowadź zliczanie bakterii we wszystkich eksponowanych zawiesinach bakteryjnych, stosując metodę zliczania jednostek tworzących kolonie. Przygotuj sterylne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej, stosując 10-krotny czynnik rozcieńczenia aż do 10⁻⁵. Dla każdej zawiesiny bakteryjnej przygotuj trzy powtórzenia w zestawie pięciu probówek.Opisz probówki, podając czynnik rozcieńczenia oraz numer powtórzenia, a następnie napełnij wszystkie probówki 900 µL 2% roztworu NaCl. Do odpowiednich probówek dodaj 100 µL zawiesiny bakteryjnej. Przeprowadź rozcieńczenia seryjne, mieszając zawartość na wirówce laboratoryjnej (vortexie) na każdym etapie.Nanieś 10 µL z dwóch ostatnich rozcieńczeń na szalki Petriego z agarem sojowym z tryptoną w odpowiednich segmentach i szybko rozprowadź kroplę, wykonując niewielki okrąg poprzez obracanie szalki. Następnie inkubuj szalki w temperaturze 25 °C przez 48 godzin. Po 48 godzinach oblicz liczbę kolonii wyrosłych na szalkach Petriego.Optymalne dla dokładnego przeliczenia są płytki zawierające od pięciu do 50 kolonii. Można obliczyć liczbę żywych bakterii na mililitr w każdym roztworze testowym, a następnie ocenić śmiertelność i porównać ją z grupą kontrolną. Aby obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr, należy pomnożyć średnią liczbę kolonii uzyskanych w równoległych powtórzeniach przez znany czynnik rozcieńczenia N oraz przez 100.Śmiertelność wyrażona w procentach oblicza się według następującego wzoru. Wyniki trzech niezależnych testów wskazują na zależną od nich śmiertelność. LC 50, czyli stężenie letalne powodujące śmierć 50% kolonii bakteryjnych narażonych na toksykant, oblicza się za pomocą znanej analizy regresji liniowej modelu logit L przy użyciu oprogramowania Benchmark Dose Software.Wartości LC50 z trzech niezależnych testów potwierdzają wykonalność i powtarzalność tej metody. Podsumowując, opisaliśmy metodę ekotoksykologiczną służącą do oceny odpowiedzi biologicznej morskiej bakterii Vibrio anguillarum. Mikroorganizm ten został wybrany, ponieważ jest halotolerancyjny, powszechnie występuje w środowisku i jest reprezentatywny dla ekosystemów morskich.Nowy test został z powodzeniem zastosowany do oceny toksycznego działania siarczanu miedzi, wykazując wyraźną zależność dawka-odpowiedź. W porównaniu z istniejącymi metodami dla innych mikroorganizmów, niniejszy protokół może być stosowany w szerszym zakresie pH i zasolenia, bez ograniczeń dotyczących próbek. Dzięki temu można go przeprowadzić również na próbkach środowiskowych.Ponadto, niniejszy bioassay ocenia śmiertelność zamiast tempa wzrostu lub inhibicji aktywności enzymatycznej. Ułatwia to porównanie z innymi testami ostrej ekotoksyczności dla środowiska morskiego, w których punktem końcowym jest śmiertelność. Test został zaprojektowany w celu oceny ekotoksyczności zanieczyszczeń wschodzących, takich jak nanocząstki, a prace nad tym zagadnieniem są w toku.

ecotoxicological-method-with-marine-bacteria-vibrio-anguillarum-to

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje izolację bakterii morskich degradujących zanieczyszczenia poprzez seryjne rozcieńczanie, selekcję kolonii oraz wzrost w medium zawierającym EE2. Wykorzystując EE2 jako jedyne źródło węgla, protokół identyfikuje szczepy bakterii zdolne do metabolizowania tego zanieczyszczenia środowiska.

Przesiewowe bakterie morskie pod kątem izolacji szczepów degradujących zanieczyszczenia

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Ten film demonstruje test toksyczności cieczy C. elegans z użyciem Aeromonas, metodę służącą do oceny zjadliwości bakterii poprzez pomiar przeżywalności robaków w środowisku ciekłym o ograniczonym zawartości składników odżywczych. Test wykazuje patogenność specyficzną dla szczepu na podstawie zakresu uszkodzeń i śmiertelności wywołanej toksynami u C. elegans.

Ocena zjadliwości bakteryjnej za pomocą testu toksyczności płynnej C. elegans

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Wykrywanie i izolacja klinicznie istotnych gatunków Vibrio wymaga selektywnych i zróżnicowanych pożywek hodowlanych. W badaniu tym oceniono zdolność nowej pożywki chromogennej do wykrywania i identyfikacji V. parahaemolyticus i innych pokrewnych gatunków. Okazało się, że nowe podłoże ma lepszą czułość i swoistość niż konwencjonalne podłoże.

Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

Test bioreporterowy całej komórki z Burkholderia sartisoli RP037-mChe został opracowany do wykrywania frakcji zanieczyszczenia organicznego (tj. fluoru) dostępnego do degradacji bakteryjnej po aktywnym transporcie przez grzybnię wypełniającą pory wypełnione powietrzem w systemie modelowym nienasyconym wodą.

Podejście bioreporterowe oparte na całej komórce do oceny transportu i biodostępności zanieczyszczeń organicznych w systemach nienasyconych wodą

Poznaj metodę ekotoksykologiczną z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska. Protokół umożliwia wyznaczenie wartości LC50 dla toksycznych substancji.

Metoda ekotoksykologiczna z bakteriami morskimi Vibrio anguillarum do oceny ostrej toksyczności zanieczyszczeń środowiska

Przeglądaj więcej filmów