Name: Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę stymulacji sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy in vitro. Technika ta pozwala badać różnicowanie komórkowe i ma zastosowanie w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), grant od Fundacji AO (S-16-12A), Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, oraz fundusz rozwoju badań na oddziale chirurgii ortopedycznej. JWA jest wspierane przez stypendium University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) ufundowane przez National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).

Wszystkie badania z udziałem kręgowców zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Przygotowanie podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>Przygotować α-MEM, rozpuszczając minimalną ilość niezbędnego podłoża (MEM) w proszku i 1,9 g wodorowęglanu sodu w 900 ml H2O i uzupełnić 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Sterylizuj za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować pożywkę makrofagową, uzupełniając α-MEM rekombinowanym mysim czynnikiem stymulującym makrofagi i kolonie (M-CSF) o stężeniu 35 ng/ml</li>
	<li>Przygotować pożywkę dla osteoklastów, uzupełniając pożywkę makrofagową o 100 ng/ml RANKL</li>
</ol>
2. Izolacja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Napełnić jedną strzykawkę o pojemności 10 ml igłą o rozmiarze 255/8 na mysz 10 ml α-MEM.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji poprzez 10-minutową ekspozycję na CO2 przy natężeniu przepływu 1,3 l/min. Upewnij się, że zwierzę umrze, po narażeniu na CO2 ze zwichnięciem szyjki macicy przed przystąpieniem do sekcji.</li>
	<li>Używając czystej techniki, wypreparuj i oddziel piszczele i kość udową. Zdezynfekuj skórę myszy 70 % etanolem przed wykonaniem nacięcia wzdłuż przedniej powierzchni każdej kończyny tylnej w celu odsłonięcia kości piszczelowej i kości udowej.
	<ol>
		<li>Przeciąć staw kolanowy, aby uwolnić dystalny koniec kości udowej i przeciąć kość udową jak najbliżej miednicy. Usuń kość udową i oczyść jak najwięcej tkanki miękkiej. Aby usunąć kość piszczelową, przetnij kostkę i usuń jak najwięcej tkanki miękkiej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przytrzymaj kość za pomocą kleszczy i przepłucz szpik do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 2,5 ml o temperaturze pokojowej α-MEM, łącząc płukanie szpiku z jednej myszy do jednej probówki. 
	UWAGA: Udane płukanie szpiku zmieni zabarwienie kości z czerwonego na beżowe.</li>
	<li>Poczekaj, aż zanieczyszczenia osiądą na dnie probówki i przenieś supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, uważając, aby nie przenieść żadnych zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Niektóre komórki mogą również osadzać się wraz z resztkami szpiku. Jeśli wymagana jest większa liczba komórek, płukanie szpiku kostnego można przefiltrować przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm do czystej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Probówkę (probówki) o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej do granulek komórek.</li>
	<li>Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w celu lizy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Dodać 10 ml PBS bezpośrednio do roztworu komórek ACK i odwirować przy 300 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Poprzednio czerwona krwinka powinna być teraz beżowa.</li>
	<li>Odessać próżniowo supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml α-MEM, a następnie rozmieścić płytkę w naczyniu poddanym działaniu kultur tkankowych o średnicy 100 mm. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Liczenie komórek nie jest konieczne na tym etapie. W tym czasie przylegające komórki ze szpiku kostnego przyczepią się do powierzchni hodowli; Populacje komórek szpiku kostnego, które nie przylegają do zapytania, pozostaną w zawiesinie. MCSF nie jest obecny w pożywce hodowlanej podczas tej początkowej inkubacji.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie prekursorów osteoklastów
<ol>
	<li>Po całonocnej inkubacji płukania szpiku należy przenieść supernatant hodowli zawierający nieprzylegające komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Szalki hodowlane z przylegającymi komórkami, które zawierają mezenchymalne komórki progenitorowe szpiku kostnego, można wyrzucić lub karmić świeżymi α-MEM, jeśli jest to pożądane do innych eksperymentów. 
	UWAGA: Osteoklasty można odróżnić bezpośrednio od tych nieprzylegających komórek szpiku kostnego, posiewając je w naczyniach poddanych hodowli tkankowej o gęstości 4 x 105 komórek/cm2 w pożywce osteoklastowej i pożywce odświeżającej co drugi dzień przez 5 dni.</li>
	<li>Dodać α-MEM do nieprzylegającego roztworu komórek do końcowej objętości 18 ml i dodać M-CSF do końcowego stężenia 35 ng/ml.</li>
	<li>Dodać po 3 ml zawiesiny komórek do 6 naczyń do hodowli zawiesiny o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. W tym czasie M-CSF będzie stymulował różnicowanie makrofagów, które mogą przylegać nawet do powierzchni niepoddanych hodowli tkankowej.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji należy ponownie nakarmić prekursory osteoklastów 3 ml świeżej pożywki makrofagowej. Spowoduje to usunięcie nieprzylegających komórek, które nie zróżnicowały się w makrofagi.</li>
	<li>Kontynuować hodowlę prekursorów osteoklastów w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 przez 2 dni lub do momentu, gdy kultury osiągną około 70% konfluencji.</li>
</ol>
4. Różnicowanie osteoklastów
<ol>
	<li>Przemyć prekursory osteoklastów 5 ml PBS i potraktować komórki 1 ml enzymu proteolitycznego/kolagenolitycznego pochodzenia morskiego w temperaturze pokojowej, aż komórki będą mogły zostać usunięte przez delikatne stukanie w płytkę. 
	UWAGA: Prekursory osteoklastów można podnieść tylko wtedy, gdy są hodowane w naczyniach zawiesinowych; Prekursory przyczepiają się zbyt mocno do powierzchni poddanych działaniu kultur tkankowych, aby można je było podnieść. Trypsyna może aktywować prekursory osteoklastów i należy jej unikać.</li>
	<li>Dodać 4 ml α-MEM do każdego naczynia i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz komórki do gęstości 5 x 104 komórek/ml i dodaj M-CSF do końcowego stężenia 35 ng/ml i RANKL do końcowego stężenia 100 ng/ml.</li>
	<li>Komórki nasienne o gęstości 2,6 x 104 komórki/cm2 na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2 dni. Różnicowanie przeprowadza się zwykle na płytkach 24-dołkowych, gdzie do każdej studzienki umieszcza się 5 x 104 komórek.</li>
	<li>2 dni po rozpoczęciu różnicowania należy ponownie nakarmić komórki, zastępując je 1 ml świeżej pożywki dla osteoklastów. 
	UWAGA: Różnicowanie osteoklastów zwykle kończy się w ciągu 3 dni. Powstałe osteoklasty można wybarwić metodą TRAP w celu łatwej oceny ilościowej i analizy morfologicznej.</li>
</ol>
5. Ciągła stymulacja sygnalizacji wycięcia za pomocą powierzchni pokrytej Jagged1
<ol>
	<li>Zawiesić kozie przeciwciało antyludzkie IgG Fc w PBS w stężeniu 10 μg/ml (rozcieńczenie 1:1 000 10 mg/ml bulionu). Dodać roztwór przeciwciała do powierzchni hodowli o gęstości 1,3 μg/cm2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. W przypadku płytek 24-dołkowych dodać 250 μl (2,5 μg) na dołek.</li>
	<li>Odsysać próżniowo studzienki i ponownie napełnić 1 ml PBS. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Zawiesić rekombinowane białko fuzyjne Jagged1-Fc w PBS o stężeniu 10 μg/ml. Dodać roztwór Jagged1-FC do powierzchni hodowli pokrytej przeciwciałem o gęstości 1,3 μg/cm2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powierzchnie hodowlane pokryte przeciwciałem mogą być używane wyłącznie jako kontrole.</li>
	<li>Odsysać próżniowo studzienki i ponownie napełnić 1 ml PBS. Powtórz ten krok 2 razy. Przechowuj PBS w studzienkach do momentu tuż przed wysiewem komórek, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
	<li>Wysiewaj 2,6 x 104 prekursory osteoklastów/cm2 na powlekane powierzchnie. Sygnalizacja wcięcia będzie stymulowana w sposób ciągły przez co najmniej 3 dni.</li>
</ol>
6. Tymczasowa stymulacja sygnalizacji wycięcia za pomocą koralików pokrytych Jagged1
<ol>
	<li>Połącz następujące składniki w probówce o odpowiedniej wielkości: 0,5 μg/cm2 Jagged1-Fc, 21 μl/cm2 kulki białkowe G agarozy i PBS do końcowej objętości 1,5 ml. Aby przygotować odpowiednią liczbę kulek Jagged1 na 1 dołek z 24-dołkowej płytki, połącz 1 μg Jagged1-Fc, 40 μl kulek białkowych G z agarozy i PBS w 1,5 ml.</li>
	<li>Probówkę inkubacyjną obracać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Probówka wirówkowa o pojemności 300 x g przez 1 minutę do granulek. Zawieś koraliki w 1,5 ml PBS. Powtórz to pranie jeszcze 2 razy.</li>
	<li>Zawiesić kulki Jagged1 w pożywce hodowlanej 130 μl/cm2 i nałożyć na hodowane komórki.</li>
	<li>Inkubować komórki z kulkami w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 przez żądany okres. Usuń koraliki za pomocą kilku przemyć PBS lub pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Sprawdź aktywację sygnalizacji Notch poprzez pomiar transkryptów genu docelowego Notch10.</li>
</ol>

<ol><li>Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in development and disease.</a> Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).</li>
<li>Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+simplicity+in+design%2C+versatility+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: simplicity in design, versatility in function.</a> Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).</li>
<li>Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+ligand+endocytosis+generates+mechanical+pulling+force+dependent+on+dynamin%2C+epsins%2C+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin.</a> Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).</li>
<li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Single+Molecular+Forces+Required+for+Notch+Activation+Using+Nano+Yoyo%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo.</a> Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).</li>
<li>Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+receptor-ligand+binding+and+activation%3A+insights+from+molecular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies.</a> Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).</li>
<li>Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged-1+is+able+to+inhibit+the+function+of+its+multivalent+form+to+induce+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+a+surrogate+in+vitro+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).</li>
<li>Small, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged+1+represses+the+function+of+its+transmembrane+form+to+induce+the+formation+of+the+Src-dependent+chord-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).</li>
<li>Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+notch+signaling+by+immobilization+of+jagged-1+on+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers.</a> Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).</li>
<li>Varnum-Finney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+ligand%2C+Jagged-1%2C+influences+the+development+of+primitive+hematopoietic+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells.</a> Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).</li>
<li>Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCdelta+is+required+for+Jagged-1+induction+of+human+mesenchymal+stem+cell+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation.</a> Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+radiation+on+the+Notch+signaling+pathway+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts.</a> Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).</li>
<li>Urs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+soluble+Jagged1-mediated+inhibition+of+Notch+signaling+on+proliferation+and+differentiation+of+an+adipocyte+progenitor+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model.</a> Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).</li>
<li>LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1-STAT3-ETBR+signaling+axis+controls+reactive+astrocyte+proliferation+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+gene+related+to+anergy+in+lymphocytes+is+associated+with+Notch-mediated+human+T+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression.</a> J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%3A+what+do+they+do+and+how+do+they+do+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts: what do they do and how do they do it?</a> Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+transcription+factor+RBP-J+results+in+osteopenia+attributable+to+attenuated+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation.</a> Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+regulates+osteoclastogenesis+directly+in+osteoclast+precursors+and+indirectly+via+osteoblast+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells.</a> J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).</li>
<li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+development+by+Notch+signaling+directed+to+osteoclast+precursors+and+through+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells.</a> Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).</li>
<li>Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+JAGGED1+promotes+osteolytic+bone+metastasis+of+breast+cancer+by+engaging+notch+signaling+in+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells.</a> Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).</li>
<li>Sekine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+osteoclastogenesis+by+Notch2%2FDelta-like+1+and+Notch1%2FJagged1+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes.</a> Arthritis Res Ther. 14 (2), R45(2012).</li>
<li>Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signaling+Promotes+Osteoclast+Maturation+and+Resorptive+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity.</a> J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).</li>
<li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+Notch2+and+NF-kappaB+accelerates+RANKL-induced+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis.</a> Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).</li>
<li>Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hajdu+Cheney+Mouse+Mutants+Exhibit+Osteopenia%2C+Increased+Osteoclastogenesis%2C+and+Bone+Resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption.</a> J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Hodowla i różnicowanie prekursorów osteoklastów in vitro stanowi użyteczną platformę do badania molekularnych mechanizmów osteoklastogenezy i identyfikacji celów terapeutycznych dla regeneracji kości i zachowania masy kostnej. Podczas hodowli prekursorów osteoklastów myszy najważniejszym elementem jest utrzymanie prekursorów w stanie naiwnym. Jako komórki podobne do makrofagów, prekursory osteoklastów są przygotowane do reagowania na składniki bakteryjn...

Szlak sygnałowy Notch u ssaków jest homologiczny do tego samego szlaku u Drosophila melanogaster i składa się z czterech transbłonowych receptorów Notch (Notch1-4) i pięciu ligandów związanych z błoną z rodzin Jagged (JAG1 i JAG2) oraz Delta-like (DLL1, 3,& 4)1. Sygnalizacja Notch jest inicjowana, gdy receptor Notch na komórce odbiorczej jest związany przez ligand na komórce nadawczej2. Podczas tej transaktywacji ligand Notch związany z błoną wytwarza siłę rozciągającą na związany z błoną receptor Notch3,4. Siła rozciągająca wiązania liganda indukuje zmiany konformacyjne w receptorze Notch, które ułatwiają zewnątrzkomórkowe rozszczepienie receptora przez enzym konwertujący TNFalpha (TACE), po którym następuje wewnątrzkomórkowe zdarzenie rozszczepienia, w którym pośredniczy kompleks gamma-sekretazy zawierający presenilinę (γ-sekretaza). γ-sekretaza uwalnia wewnątrzkomórkową domenę Notch (NICD), która przemieszcza się do jądra, gdzie tworzy kompleks aktywacji transkrypcyjnej z CBF-1-Su(H)-Lag-1 (CSL), podobnymi do masterminda (MAML) i czynnikami specyficznymi dla typu komórki, aby napędzać ekspresję docelowych genów5.
Mechaniczne elementy aktywacji sygnalizacji Notch powodują konieczność stosowania unikalnych metod aktywacji szlaku Notch in vitro. Rozpuszczalne ligandy Notch mogą wiązać się z receptorami Notch, ale nie wytwarzają sił rozciągających niezbędnych do uwalniania NICD, jednocześnie konkurencyjnie hamując wiązanie ligandów Notch związanych z komórkami. Tak więc dodanie rozpuszczalnych ligandów Notch do pożywki hodowlanej może osłabić normalną sygnalizację Notch6,7. Na szczęście ligandy Notch mogą indukować uwalnianie NICD, jeśli są przymocowane do odpowiednio sztywnego podłoża5,8,9,10. Wysiewanie komórek na podłożach hodowlanych pokrytych ligandem lub nakładanie na komórki kulek pokrytych ligandem może aktywować sygnalizację Notch, a wybór między nimi zależy przede wszystkim od pożądanego czasu stymulacji Notch. W celu natychmiastowej, tymczasowej aktywacji sygnalizacji Notch, co byłoby pożądane w punkcie środkowym testu funkcjonalnego lub różnicowania, ligand Notch można związać z kulkami agarozy, nałożyć na hodowane komórki i wypłukać w dowolnym momencie. Aby uzyskać bardziej trwałą sygnalizację Notch od początku okresu hodowli, płytki do hodowli tkankowych można pokryć ligandem przed wysiewem komórek.
Dla celów tego protokołu, metody są przeprowadzane przy użyciu prekursorów osteoklastów myszy, ale metody i wariacje metod opisanych tutaj mają zastosowanie do szerokiej gamy typów komórek6,11,12,13,14. Osteoklasty są ostatecznie zróżnicowanymi krwiotwórczymi komórkami linowymi, które są odpowiedzialne za resorpcję tkanki kostnej i są zaangażowane w wiele zaburzeń utraty masy kostnej15. W związku z tym badania in vitro różnicowania osteoklastów od ich prekursorów z linii monocytów/makrofagów oraz mechanizmów molekularnych kontrolujących ich funkcję mają zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia osteoklastów i opracowania nowych terapii regenerujących kości. Chociaż obecnie powszechnie przyjmuje się, że sygnalizacja Notch odgrywa pozytywną rolę w różnicowaniu i funkcjonowaniu osteoklastów, różnice zarówno w stymulacji sygnalizacji Notch, jak i hodowli i różnicowaniu prekursorów osteoklastów doprowadziły do początkowo sprzecznych wyników16,17,18,19. Dokładniejsze badanie różnic w metodach i wykorzystaniu modeli genetycznych znacznie wyjaśniło rolę sygnalizacji Notch w osteoklastogenezie, ale zastosowanie standaryzowanych metod stymulacji i hodowli Notch może zapobiec takim kontrowersjom w przyszłych badaniach sygnalizacji Notch w innych typach komórek20,21,22,23.
Istnieje wiele metod hodowli i różnicowania prekursorów osteoklastów myszy, a ponieważ w przypadku różnych metod stymulowania sygnalizacji Notch, najlepsza metoda będzie zależeć od pytania eksperymentalnego. W niniejszym artykule przedstawiona zostanie nasza preferowana metoda hodowli przylegających i nieprzylegających frakcji komórek szpiku wypłukanych z kości długich myszy. Metoda ta ma tę zaletę, że zasadniczo nie wymaga specjalistycznego sprzętu i wytwarza komórki, które można zastosować do różnych metod różnicowania.

<table><tbody><tr><td>Rekombinowana mysz M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz RANKL</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>200-04</td><td>Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Jagged1-Fc</td><td>R& D Systems</td><td>1277-JG-050</td><td>Dostępne od wielu dostawców, aktywność testowa przed eksperymentami</td></tr><tr><td>Białko G Kulki agarozowe</td><td>InvivoGen</td><td>gel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-ludzka IgG Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne podłoże w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Służy do podnoszenia prekursorów osteoklastów</td></tr><tr><td>Fosfataza kwasowa, leukocyty (TRAP) Zestaw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>Służy do barwienia zróżnicowanych osteoklastów</td></tr></tbody></table>

stymulacja sygnalizacji notch w prekursorach osteoklastów myszy

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Sygnalizacja Notch jest kluczowym elementem wielu procesów fizjologicznych i patologicznych. Natura sygnalizacji Notch sprawia jednak, że badanie in vitro jej różnorodnych, a czasem sprzecznych ról jest wyzwaniem. Jako składnik bezpośredniej komunikacji komórka-komórka zarówno z receptorami, jak i ligandami związanymi z błoną plazmatyczną, sygnalizacja Notch nie może być aktywowana in vitro przez proste dodanie ligandów do pożywek hodowlanych, jak jest to możliwe w przypadku wielu innych szlaków sygnałowych. Zamiast tego ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. 
Różnice w metodach aktywacji sygnalizacji Notch mogą prowadzić do różnych wyników w hodowanych komórkach. W szczególności w przypadku prekursorów osteoklastów różnice w metodach stymulacji Notch oraz hodowli i różnicowaniu prekursorów osteoklastów doprowadziły do sporów co do tego, czy sygnalizacja Notch jest pozytywnym, czy negatywnym regulatorem różnicowania osteoklastów. Podczas gdy bliższe porównania różnicowania osteoklastów w różnych warunkach stymulacji Notch in vitro i modelach genetycznych w dużej mierze rozwiązały kontrowersje dotyczące sygnalizacji Notch i osteoklastów, standaryzowane metody ciągłej i tymczasowej stymulacji sygnalizacji Notch w hodowanych komórkach mogą zapobiec takim rozbieżnościom w przyszłości.
Ten protokół opisuje dwie metody stymulowania sygnalizacji Notch, szczególnie w hodowanych prekursorach osteoklastów myszy, chociaż te metody powinny być stosowane do każdego typu komórek przylegających z niewielkimi poprawkami. Pierwsza metoda powoduje ciągłą stymulację sygnalizacji Notch i polega na unieruchomieniu liganda Notch na powierzchni hodowli tkankowej przed wysiewem komórek. Drugi, który wykorzystuje ligand Notch związany z kulkami agarozy, pozwala na tymczasową stymulację sygnalizacji Notch w komórkach, które są już przyklejone do powierzchni hodowli. Protokół ten obejmuje również metody wykrywania aktywacji Notch w prekursorach osteoklastów, a także reprezentatywne markery transkrypcyjne aktywacji sygnalizacji Notch.

Celem tej metody jest hodowla i stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów. Przy prawidłowej hodowli prekursory osteoklastów wykazują głównie wydłużoną, wrzecionowatą morfologię z gładką cytoplazmą (Rysunek 1A). Należy zachować ostrożność, aby uniknąć aktywacji immunologicznej prekursorów osteoklastów. Po aktywacji prekursory rozprzestrzeniają się i stają się spłaszczone z pienistą cytoplazmą (Rysunek 1B). Komórki te, przypominające „smażon...

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja wpływu stymulacji sygnalizacji Notch w różnych punktach procesu różnicowania osteoklastów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak: w jaki sposób zmienia się rola sygnalizacji Notch w trakcie procesu komórkowego? Główną zaletą tej techniki jest jej uniwersalność, która pozwala na jej adaptację do innych komórek lub ligandów Notch.Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w różnicowanie osteoklastów, można ją również zastosować do innych procesów, takich jak przeżywalność i proliferacja komórek lub różnicowanie innych typów komórek. Procedurę należy rozpocząć od unieruchomienia myszy w pozycji grzbietnej i zdezynfekowania skóry 70% etanolem. Następnie należy wykonać nacięcie wzdłuż powierzchni przedniej jednej kończyny tylnej, aby odsłonić kość piszczelową i kość udową.Następnie wykonuje się nacięcie przez staw kolanowy, aby uwolnić dystalny koniec kości udowej. Usuwa się kość udową, przecinając koniec kości blisko miednicy, i usuwa się wszelkie przytwierdzone tkanki miękkie. Przecina się staw skokowy, aby usunąć kość piszczelową, a następnie usuwa się tkanki miękkie.Następnie, u

stimulation-of-notch-signaling-in-mouse-osteoclast-precursors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

To badanie dostarcza protokołu do wykorzystania indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastów do badania przebudowy kości pod wpływem siły ortodontycznej i opisuje metody analizy przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów, rzucając tym samym światło na biologię mechaniczną szkieletu.

Wykorzystanie indukowalnych myszy z nokautem Stat3 specyficznych dla linii osteoblastycznej do badania przebudowy kości wyrostka zębodołowego podczas ortodontycznego ruchu zębów

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Poznaj metodę stymulacji sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy in vitro. Technika ta pozwala badać różnicowanie komórkowe i ma zastosowanie w biologii komórki.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Przeglądaj więcej filmów